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Zoosporogenese in vitro entre isolados do oomiceto Pythium insidiosum.

In vitro zoosporogenesis among oomycetes Pythium insidiosum isolates

INTRODUCAO

Pythium insidiosum e um oomiceto aquatico, classificado no Reino Stramenopila, Phylum Oomycota, Familia Pythiaceae, Genero Pythium e Especie insidiosum. Esse genero apresenta mais de 200 especies, sendo a maioria habitante do solo e patogenos de plantas (ALEXOPOULOS et al., 1996). Apenas Pythium insidiosum e patogenico para mamiferos, uma vez que causa pitiose, uma doenca cronica, piogranulomatosa, que acomete animais e humanos (De COCK et al., 1987).

A pitiose e mais frequente na especie equina, manifestando-se principalmente nas formas clinicas cutanea e subcutanea. Nestes animais, observase o desenvolvimento de lesoes ulcerativas granulomatosas, de crescimento rapido e dificil tratamento, localizadas, predominantemente, nas extremidades distais dos membros e porcao ventral da parede toraco-abdominal. A presenca de massas necroticas semelhantes a corais, denominadas kunkers, e caracteristica da enfermidade nos equinos (MILLER & CAMPBELL, 1982; MENDOZA & ALFARO, 1986; MEIRELLES et al., 1993; MENDOZA et al., 1993). Ja, nas demais especies, os kunkers nao sao observados e a doenca se manifesta, principalmente, nas formas cutanea e gastrointestinal em caninos e felinos (GROOTERS, 2003; RAKICH et al., 2005), e subcutanea em bovinos e ovinos (SANTURIO et al., 1998; PEREZ et al., 2005; TABOSA et al., 2004). Nos ultimos anos, e crescente o numero de relatos de pitiose em especies nao-domesticas como urso, jaguar, camelo e tigre (GROOTERS, 2003; CAMUS et al., 2004; WELLEHAN et al., 2004; BUERGELT et al., 2006). Em humanos, e uma enfermidade de prognostico desfavoravel, sendo comum na Tailandia (IMWIDTHAYA, 1994; KRAJAEJUN et al., 2006). Porem, casos de pitiose humana tambem tem sido descritos em outros paises, inclusive no Brasil (PRASERTWITAYAKIJ et al., 2003; BOSCO et al., 2005).

Segundo MILLER (1983), a presenca de areas alagadas, vegetacao abundante e temperatura ambiental superior a 15 - 20[grados]C constituem as condicoes ideais para o desenvolvimento de Pythium insidiosum. Nessas situacoes, ha a producao de zoosporos moveis, biflagelados, responsaveis pela infeccao em mamiferos. Acredita-se que os zoosporos livres nas aguas sejam atraidos para a pele dos animais, onde se encistam, iniciando a infeccao cutanea. A enfermidade ocorre em areas tropicais, subtropicais e temperadas, tendo sido relatada em paises como Argentina, Australia, Brasil, Colombia, Costa Rica, Estados Unidos, Haiti, India, Indonesia, Japao, Nova Zelandia, Papua-Nova Guine, Tailandia, Venezuela e Africa (MENDOZA et al., 1996; PEREZ et al., 2005; RIVIERRE et al., 2005). Embora nao exista um levantamento preciso da prevalencia da enfermidade no Brasil, a pitiose representa um problema a equinocultura, especialmente em regioes alagadicas como o Pantanal Matogrossense (LEAL et al., 2001).

O diagnostico presuntivo de pitiose e realizado levando-se em consideracao a epidemiologia, sinais clinicos e aspectos macro e microscopicos das lesoes. O isolamento e identificacao do agente sao de grande valor para o diagnostico definitivo e diferencial, embora, atualmente, metodos sorologicos e moleculares constituam poderosas ferramentas para o diagnostico precoce e preciso de pitiose (SANTURIO et al., 2006). ALEXOPOULOS et al. (1996) e MOORE-LANDECKER (1996) afirmam que, para realizar-se a correta identificacao do Pythium insidiosum, e necessario observar-se as caracteristicas morfologicas dos zoosporangios, zoosporos, oogonia e anteridio. Para isto, e preciso a obtencao de zoosporos em laboratorio, utilizando-se a tecnica de zoosporogenese em meio liquido descrita por MENDOZA & PRENDAS (1988). A obtencao das estruturas infectantes e importante para o desenvolvimento de estudos in vitro de suscetibilidade a drogas e reproducao experimental da enfermidade em coelhos, somente possivel pela inoculacao subcutanea de agua rica em zoosporos produzidos in vitro (MILLER & CAMPBELL, 1983; SANTURIO et al., 2003). Sendo assim, a utilizacao de protocolos de inducao da zoosporogenese em Pythium insidiosum e ponto crucial nos estudos que envolvem este oomiceto. Apenas MENDOZA & PRENDAS (1988), CHAIPRASERT et al. (1990) e SANTURIO et al. (2003) relataram detalhadamente a metodologia de inducao de zoosporogenese.

O protocolo de inducao da zoosporogenese em Pythium insidiosum utilizado no presente trabalho foi baseado na tecnica descrita por MENDONZA & PRENDAS (1988) e teve por objetivos induzir a zoosporogenese de 32 isolados de Pythium insidiosum e avaliar a producao de zoosporos, com o intuito de utiliza-los na reproducao experimental da enfermidade e no desenvolvimento de testes de suscetibilidade in vitro a antifungicos.

MATERIAL E METODOS

Foram avaliadas 32 amostras de Pythium insidiosum, isoladas de equinos naturalmente infectados, provenientes dos Estados do Rio Grande do Sul e do Mato Grosso do Sul (Pantanal) e duas amostras padrao ATCC 58637 e CBS 101555, mantidas na colecao de microrganismos do Laboratorio de Pesquisas Micologicas (LAPEMI) da Universidade Federal de Santa Maria, RS.

As amostras de Pythium insidiosum previamente cultivadas em Corn Meal Agar (CMA) foram repicadas para placas de Petri contendo o mesmo meio de cultivo, juntamente com fragmentos de grama (Paspalum notatum), previamente autoclavados a 121[grados]C por 20 minutos. As placas foram incubadas por um periodo de 5 dias a temperatura de 37[grados]C. Apos esse periodo de cultivo, os fragmentos de grama parasitados pelo Pythium insidiosum foram transferidos para uma placa de Petri contendo 30mL de Meio de Inducao, composto pela solucao A: [K.sub.2]HPO4 (1,0 M), K[H.sub.2]P[O.sub.4] (1,0 M), [(N[H.sub.4]).sub.2]HP[O.sub.4] (3,66 M), e pela solucao B: Mg[Cl.sub.2]6[H.sub.2]O (0,5 M), Ca[Cl.sub.2]2[H.sub.2]O (0,5 M). O Meio de Inducao era obtido pela mistura de 0,5mL da solucao A e 0,1mL da solucao B em 1.000mL de agua destilada esteril. As placas de Petri contendo o Meio de Inducao juntamente com a grama infectada eram incubadas a 37[grados]C, por 24 horas. Durante esse periodo, os fragmentos de grama foram regularmente observados, atraves de microscopia optica (100 e 400 X) entre lamina e laminula. Nas primeiras 12 horas de incubacao, as avaliacoes foram feitas em intervalos de 1 hora e a partir da 12a hora em intervalos de 6 horas. Apos observacao da formacao de zoosporangios e liberacao dos zoosporos, realizou-se a contagem de zoosporos livres no Meio de Inducao, utilizando-se hemocitometro de Neubauer (SANTURIO et al., 2003).

RESULTADOS

Nas primeiras tres horas de incubacao no Meio de Inducao, observou-se um entumescimento na extremidade de algumas hifas. A partir dessa observacao, podia-se acompanhar o processo de formacao dos zoosporangios, verificando-se que o pequeno entumescimento na extremidade da hifa aumentava progressivamente, ate assumir a forma de uma pequena vesicula. Durante este processo era possivel a nitida visualizacao de fluxo citoplasmatico dirigindo-se do interior da hifa para a vesicula. Apos o completo preenchimento da vesicula, iniciava-se um processo de diferenciacao no seu interior que culminava com a formacao dos zoosporos. Estes se caracterizavam pelos movimentos rapidos de seus flagelos, o que resultava na ruptura da membrana do zoosporangio com liberacao dos zoosporos no Meio de Inducao. Os zoosporos liberados apresentavam forma ovoide, evidenciando a presenca de dois flagelos. Uma vez livres no Meio de Inducao, nadavam em diferentes direcoes por meio de movimentos de rotacao em torno de seu proprio eixo, permanecendo ativos por aproximadamente 15 minutos. Antes de sofrer o encistamento, nadavam lentamente ate a parada completa de movimentos, tornando-se, entao, globosos. Apos alguns minutos, os zoosporos encistados emitiam tubos germinativos que formavam longos filamentos apos 24 horas de incubacao a 37[grados]C. Todo o processo da zoosporogenese, desde a diferenciacao da hifa ate a liberacao dos zoosporos, requeria, aproximadamente, 35 a 40 minutos.

Embora zoosporos tenham sido observados ja nas primeiras 3 horas de inducao, constatou-se que o maior numero foi produzido entre 6 e 8 horas de incubacao. A partir de 9 horas de incubacao, a quantidade de zoosporos diminuia gradativamente ate a 24a hora, observando-se apenas zoosporos encistados emitindo tubos germinativos, mas sem a formacao de novos zoosporangios.

Das 32 amostras de Pythium insidiosum estudadas, observou-se que 16 isolados (50%) produziram 20.000 zoosporos [mL.sup.-1], 12 isolados (37,5%) produziram acima de 20.000 zoosporos [mL.sup.-1] (variando de 22.500 a 107.500 zoosporos [mL.sup.-1]), enquanto que quatro amostras (12,5%) produziram menos de 20.000 zoosporos [mL.sup.-1] (5.000 a 10.000 zoosporos [mL.sup.-1]). Observou-se, tambem, que os isolados de Pythium insidiosum de obtencao mais recente apresentaram elevado numero de zoosporos.

DISCUSSAO

Todos os isolados de Pythium insidiosum avaliados apresentaram a habilidade de gerar zoosporos, demonstrando que o protocolo utilizado e eficiente para a identificacao do microrganismo. Desta forma, pode-se inferir que o presente protocolo tambem pode ser utilizado para obtencao de zoosporos em numero suficiente para reproducao da enfermidade em animais experimentais e realizacao de testes de suscetibilidade a antifungicos. SANTURIO et al. (2003) reproduziram experimentalmente a doenca em coelhos utilizando 17.500 zoosporos viaveis [mL.sup.-1]. Ja para a obtencao de inoculo de Pythium insidiosum para uso em testes de suscetibilidade in vitro, estudos em andamento estimam que o numero ideal de zoosporos situe-se entre 20.000 e 30.000 [mL.sup.-1] (ALVES, 2006 - informe pessoal).

MENDOZA & PRENDAS (1988) citam que o protocolo para inducao de zoosporogenese deve ser baseado em alguns aspectos como: parasitismo de fragmentos de grama em um meio pobre em nutrientes, seguido da incubacao em um Meio de Inducao contendo ions [Ca.sup.2+] (calcio), [Mg.sup.2+] (magnesio) e [K.sup.+] (potassio) com temperatura e pH adequados. A importancia desses ions na zoosporogenese foi relatada por SHIPTON (1987) ao demonstrar que tanto a liberacao dos zoosporos quanto a sua motilidade foi influenciada pelas concentracoes de [K.sup.+], [Ca.sup.2+] e [Mg.sup.2+] no Meio de Inducao. Segundo SHIPTON (1985) e MENDOZA & PRENDAS (1988), a quantidade de zoosporos produzidos, assim como os tempos de incubacao sao dependentes do meio utilizado para crescimento do Pythium insidiosum antes do processo de inducao, da zoosporogenese. Em um estudo realizado com nove isolados de Pythium insidiosum, observou-se que o numero maximo de zoosporangios e zoosporos foram obtidos apos uma hora e meia de incubacao em Meio de Inducao a 37[grados]C, quando utilizouse o cultivo previo com grama em agar agua a 2%, por 24 horas, a 37[grados]C. Ja quando o cultivo em fragmentos de grama foi realizado em outros meios como Sabouraud dextrose agar (SDA) e CMA, o tempo de incubacao foi de quatro dias a 37[grados]C e o periodo de maior producao de zoosporangios e zoosporos no Meio de Inducao ocorreu apos 5 horas e meia de incubacao a 37[grados]C (MENDOZA & PRENDAS, 1988). No presente trabalho, foi utilizado o meio de CMA para o cultivo de Pythium insidiosum em fragmentos de grama, pois a maioria dos isolados testados nao apresentaram crescimento em agar agua a 2%. No CMA, observou-se otimo crescimento no quinto dia de incubacao a 37[grados]C. Quando realizada a inducao da zoosporogenese, observou-se que o numero maximo de zoosporos foram obtidos entre 6 e 8 horas de incubacao a 37[grados]C, sendo estes resultados similares aos anteriormente relatados. Embora SHIPTON (1985) afirme que a presenca de hifas jovens e o fator determinante para a abundante formacao dos zoosporos e que o periodo previo de crescimento considerado otimo para a producao de zoosporos encontre-se entre 24 e 30 horas de incubacao, observouse, nas condicoes do presente estudo, ausencia de crescimento do Pythium insidiosum no referido periodo. Este fato pode ser devido a idade das amostras utilizadas, pois a maioria delas havia sido isolada ha alguns anos e vinham sendo repicadas, repetidamente, para manutencao, necessitando assim de um meio mais rico em nutrientes, o que justifica a ausencia de crescimento no agar agua a 2% e o maior tempo de incubacao para o crescimento. Os resultados obtidos permitem constatar que a utilizacao do meio de CMA e eficiente para a inducao da zoosporogenese do Pythium insidiosum, mesmo que os periodos de incubacao pre e durante inducao sejam maiores aos periodos observados quando utilizado agar agua, como reportado nos estudos de MENDOZA & PRENDAS (1988). Alem disso, por meio da metodologia da zoosporogenese, pode-se avaliar a morfologia de zoosporangios e zoosporos, constatando-se que todos os isolados estudados neste ensaio apresentaram caracteristicas morfologicas condizentes com Pythium insidiosum, similares as descritas por SHIPTON et al. (1982), De COCK et al. (1987); CHAIPRASERT et al. (1990) e MENDOZA et al. (1996).

CONCLUSOES

O protocolo utilizado na inducao da zoosporogenese mostrou-se eficiente e representa uma importante ferramenta, tanto para a identificacao morfologica do Pythium insidiosum, como para a obtencao de zoosporos em quantidades suficientes para a inoculacao em animais experimentais e desenvolvimento de testes de suscetibilidade.

AGRADECIMENTOS E APRESENTACAO

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico (CNPq), pelo suporte financeiro durante a execucao do trabalho e pela concessao de bolsa de estudos ao primeiro autor.

Este trabalho e parte da Tese de Doutorado do primeiro autor, vinculado ao Programa de Pos graduacao em Ciencias Veterinarias, Faculdade de Veterinaria, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.

INFORME VERBAL

ALVES, S.H. Universidade Federal de Santa Maria. Centro de Ciencias da Saude. Departamento de Microbiologia e Parasitologia. E-mail: hartzsa@ccs.ufsm.br.

Recebido para publicacao 30.11.06 Aprovado em 18.04.07

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Daniela Isabel Brayer Pereira (I) * Janio Morais Santurio (II) Sydney Hartz Alves (II) Juliana Siqueira Argenta (I) Ayrton Sydnei Cavalheiro (II) Laerte Ferreiro (III)

(I) Programa de Pos-graduacao em Ciencias Veterinarias, Faculdade de Veterinaria, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre, RS, Brasil. * Endereco para correspondencia: Campus Universitario, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Predio 20, sala 4139, 97105-900, Santa Maria, RS, Brasil. Fone-fax: (055) 32208906. E-mail: danielabrayer@yahoo.com.br.

(II) Departamento de Microbiologia e Parasitologia, UFSM, Santa Maria, RS, Brasil.

(III) Faculdade de Veterinaria, UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil.
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Title Annotation:texto en portugues
Author:Brayer Pereira, Daniela Isabel; Santurio, Janio Morais; Alves, Sydney Hartz; Siqueira Argenta, Julia
Publication:Ciencia Rural
Date:Jan 1, 2008
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