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Zimografia de actividad calpaina en fuentes carnicas como criterio de calidad.

Calpain Activity Zymography from Meat Sources as Quality Criterion

INTRODUCCION

Las proteasas son enzimas que hidrolizan el enlace peptidico de las proteinas y se caracterizan por tener diversas especificidades. Hay dos clases principales de proteasas, segun su sitio de accion. Las exopeptidasas actuan sobre el enlace N- o C- terminal del sustrato, mientras que las endopeptidasas hidrolizan el interior de la proteina. Estas ultimas se subclasifican, de acuerdo a su sitio activo, en cuatro familias: serin-, aspartico-, cistein- o metaloproteasas [13].

Las cistein proteasas, caracterizadas por un grupo tiol de un residuo de cisteina en su sitio activo, han sido aisladas de animales, plantas y bacterias, de las cuales se conoce un grupo representativo, entre estas se encuentran las calpainas o proteasas neutras activadas por calcio, y son una familia de proteasas con un papel metabolico muy activo [4]. Se ha identificado en diferentes sistemas enzimaticos que los cambios estructurales asociados al ablandamiento de la carne estan directamente relacionados con la actividad de las calpainas, representadas por las m-calpainas, g/m-calpainas, g-calpainas y la calpastatina que actua como inhibidor enzimatico.

La calidad de la carne es juzgada por sus atributos sensoriales, como la terneza. Existe preocupacion en este tema, pues son varios los factores que confieren la terneza a la carne, entre ellos, el trato al animal antes de morir, componentes individuales, caracteristicas de la especie, edad del animal, y los diferentes musculos entre animales de una especie. Los estudios acerca de la terneza de la carne han aumentado, debido a su gran variacion genetica y dificultad de obtener datos fenotipicos que, necesariamente, requieren del sacrificio de los animales [20]. Existe evidencia que las calpainas estan directamente relacionadas con la suavidad de la carne, catalizando la reaccion de proteolisis y degradando las proteinas estructurales del musculo post mortem [4].

El almacenamiento post mortem ha sido considerado esencial para la obtencion de carne tierna, pues una vez completado el rigor mortis, se inician los cambios en la carne que la hacen mas suave [18]. La maduracion de la carne involucra varios procesos bioquimicos ligados a la degradacion proteolitica del musculo. Se han propuesto tres sistemas proteoliticos asociados a la proteolisis post mortem, las catepsinas lisosomales, el complejo de las proteinas multicataliticas y las calpainas (del ingles calcium ion dependent papain like cysteine protease, o cistein proteasas parecidas a papaina dependientes de ion calcio) [4, 21].

En mamiferos, la familia de calpainas comprende diversas isoformas especificas de tejido, se conocen con nombres derivados a partir de sus requerimientos de calcio: la g-calpaina, [mu]/m-calpaina, la m-calpaina y la calpastatina. La g/m-calpaina ha sido encontrada hasta el dia de hoy solo en aves [15]. La [mu]-calpaina requiere entre 3 y 50 [micron]M [Ca.sup.2+] para alcanzar la mitad de su actividad maxima, mientras que la m-calpaina necesita 0,2 a 1 mM para su activacion. La [mu]/m-calpaina se activa entre 3 y 1000 [micron]M. La calpastatina actua como regulador catalitico [4]. El pH optimo in vivo de estas enzimas oscila entre 7,2 y 8,2 [6]. Empero, a valores inferiores de pH, se registra aun actividad calpaina suficiente para producir un mejoramiento apreciable en la suavidad de la carne, especialmente si se permite un periodo de maduracion apropiado [4]. Las tres isoformas de esta proteasa son heterodimeros con una masa molecular nativa de ~110.000, y constan de una subunidad grande (80 kDa, la subunidad catalitica) y una subunidad pequena (30 kDa, la subunidad reguladora). Una caracteristica de las calpainas es que son muy susceptibles a autoproteolisis inducida por calcio. La exposicion prolongada al calcio da como resultado una perdida de la actividad proteolitica y la destruccion final de la enzima [11]. Como secuela de la autoproteolisis, las subunidades de 80 y 30 kDa se degradan produciendo polipeptidos de ~78 y 18 kDa. Tras los cambios conformacionales que conducen a la autolisis de las subunidades, la subunidad larga liberada esta lista para ejercer su actividad proteolitica [21]. La autolisis y la disminucion de la actividad proteolitica de las calpainas son altamente dependientes de la presencia de sustrato, pH y temperatura [11].

Con el trasfondo asociado a la seguridad alimentaria, en esta investigacion se planteo analizar y caracterizar bioquimicamente la actividad calpaina de fuentes carnicas de diversos animales para el consumo humano y estandarizar un metodo para la visualizacion de actividad calpaina en geles de poliacrilamida a traves de zimografia. El proposito fue establecer una metodologia que la industria carnica nacional pueda implementar como patron de calidad. Asi puede tenerse un mayor conocimiento acerca de la relacion calpaina y terneza, y en un futuro podria establecerse como parametro para optimizar la valoracion del producto final.

MATERIALES Y METODOS

Reactivos quimicos

Todos los reactivos empleados fueron de alto grado de pureza. Acido acetico, azul brillante de Coomassie (CBB), etanol, bis-acrilamida, albumina de suero bovino (BSA), caseina, leupeptina, 2-mercaptoetanol (2-ME) y fluoruro de fenilmetil sulfonilo (PMSF) (Sigma-Aldrich). Acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), acido clorhidrico, acido ortofosforico, acrilamida, y azul de bromofenol (Fischer Scientific). Glicerol, Trizma base, Triton X-100, glicina y acido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfonico (HEPES) (Promega Corporation). Persulfato de amonio y tetrametiletilenodiamina (TEMED) (Riedel-de-Haen).

Fuente biologica y homogeneizacion

Las muestras de carne de res (Bos taurus), cerdo (Sus scrofa) y pollo (Gallus gallus) se obtuvieron de dos fuentes. La primera comprada en una carniceria, y la segunda en el Matadero Municipal de Aroa Cooperativa SUM-SUM C.A., municipio Bolivar, estado Yaracuy, Venezuela, para adquirir la carne de res inmediatamente despues del sacrificio del animal. La carne de pollo y cerdo se obtuvo de un criadero rural. Los musculos extraidos de los animales fueron el longissimus dorsi para la res y cerdo, y el musculo pectoral para el pollo. Las muestras fueron llevadas al laboratorio de biotecnologia del Centro de Investigaciones en Ambiente, Biologia y Quimica (AMBIOQUIM), en la Universidad de Carabobo, procediendose con la obtencion del homogenato.

Dos metodos de extraccion fueron empleados: Metodo A: propuesto por Arthur y Mykles [1], con algunas modificaciones, donde 200 mg de tejido muscular se colocaron en un homogeneizador de varilla con 2 mL de tampon de extraccion (50 mM HEPES, pH 7,6; 150 mM NaCl, 10% v/v glicerol, 0,1% v/v Triton X-100, 5 mM EDTA, 10 mM 2-ME, 100 [micron]M PMSF y 10 gg/mL leupeptina), a 4[grados]C. Seguido de esto, el homogenato se centrifugo a 12.000 x g por 10 min a 4[grados]C en una centrifuga Eppendorf, modelo 5417R, Eppendorf, Alemania, el precipitado fue descartado y el sobrenadante se recupero, y se mantuvo almacenado a -20[grados]C en congelador Whirlpool, Modelo ED2CHOXKO07, Whirlpool Corporation, EUA hasta su uso. Metodo B: propuesto por Koohmaraie [9] con algunas modificaciones. En un homogeneizador de varilla se trataron 200 mg de tejido muscular con 2 mL de tampon de extraccion [50 mM Tris, 10 mM EDTA y 10 mM 2-ME ajustando el pH a 7,8 con HCl 6 N, a 4[grados]C]. Seguido de esto, el homogenato se centrifugo a 28.000 x g por 120 min. El sobrenadante se recupero y el precipitado fue descartado. Se concentraron luego 500 [micron]L de los sobrenadantes obtenidos por ambos metodos de extraccion, empleando centricones de 10.000 Da, a 7.516 x g por 30 min a 4[grados]C, hasta obtener un volumen final de 100 [micron]L.

Cuantificacion de la cantidad de proteinas totales

Se utilizo el protocolo de Bradford [2], empleando BSA como patron (100 [micron]g/mL en [H.sub.2]O) con el cual se realizo una curva de calibracion de 0 a 10 [micron]g de proteina por cada 100 [micron]L. Se adiciono 1 mL de reactivo de Bradford a 100 [micron]L de muestra, se mezclo y dejo en reposo por 5 min a 27[grados]C y a continuacion se midio la absorbancia en el espectrofotometro Thermo Scientific, Modelo Genesys 10-S, Thermo Electron Corporation, EUA a 595 nm.

Cuantificacion de la actividad calpaina

Los peptidos liberados de la caseina por efecto de las calpainas se determinaron cuantitativamente por espectrofotometria [9]. Se mezclaron 125 [micron]L de muestra con 125 [micron]L de tampon de reaccion [100 mM Tris, 10 mM 2-ME, 5 [micron]/L caseina y 5 mM Ca[Cl.sub.2] pH 7,5 a 25[grados]C, ajustado con acido acetico 1 N]. La mezcla se incubo en una mini-incubadora (J.P. Selecta, Modelo Medilow-LG, J.P. Selecta S.A., Espana) a 25[grados]C por 60 min, para luego detener la reaccion adicionando 250 [micron]L TCA 5%. Seguidamente, se centrifugo a 2.000 x g por 30 min y se midio la absorbancia del sobrenadante a 280 nm. Se empleo una curva de calibracion con tirosina como patron.

Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio

Para determinar el perfil de actividad proteolitica del homogenato se realizo una electroforesis empleando un equipo de mini-electroforesis (Bio-Rad, Modelo: PowerPac Basic, Bio-Rad Laboratories Inc., EUA) en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) al 10; 12 y 12,5% m/v, en condiciones reductoras y no reductoras [14]. El homogenato se disolvio como sigue: 5 [micron]L de muestra en 15 gL de agua y 10 gL de tampon de carga 4 x; se inyectaron en el gel 20 gL de esta solucion. El gel se sometio a 100 V por 90 min a 4[grados]C. Se uso CBB para la tincion del gel. Marcadores de pesos moleculares de proteinas estandares fueron ensayados de manera paralela.

Zimografia

Para visualizar el perfil de actividad enzimatica de las calpainas, se procedio con el metodo propuesto por Arthur y Mykles [1]. Se emplearon geles al 10 o 12,5% de acrilamida, empleando caseina al 1% como sustrato. Los geles fueron pre-corridos en tampon de corrida [25 mM Tris base, 125 mM glicina, 1 mM EDTA, pH 8, 4[grados]C, adicionando 10 mM 2-ME justo antes de su uso], por 15 min a 100 V y 4[grados]C. Seguido de esto, se disolvieron 5 gL de los sobrenadantes en tampon de muestra [20% v/v glicerol; 0,1 M Tris-HCl, pH 6,8; 10 mM EDTA; 10 mM 2-ME y 0,02% azul de bromofenol] y se cargo en el gel, se corrio la electroforesis por ~150 min a 100 V y 4[grados]C. Una vez concluida la electroforesis se procedio a lavar el gel con tampon de incubacion (50 mM Tris-HCl pH 7, 5 mM Ca[Cl.sub.2], 10 mM 2-ME), con dos cambios cada 30 min. El gel se incubo por 18 h en el mismo tampon a 27[grados]C con agitacion leve. Seguidamente, se coloco el gel en solucion de tincion al 1% de CBB por 2 h y luego se destino el gel lavando con solucion de destincion entre 30 y 60 min, hasta observar la aparicion de bandas traslucidas sobre un fondo azul intenso [1, 19, 25, 26].

RESULTADOS Y DISCUSION

El factor mas importante relacionado con la aceptacion de la carne por parte del consumidor es la terneza, y esta mejora durante el almacenamiento post mortem [22], debido a la proteolisis de las principales proteinas miofibrilares causada por las calpainas [11]. La determinacion cuantitativa de la cantidad de proteinas revelo que, hay mayor concentracion de proteinas totales en el homogenato de pollo, seguido por el de cerdo y por ultimo el de res en las muestras provenientes de la carniceria. La cuantificacion de la actividad enzimatica empleando caseina como sustrato (TABLA I), arrojo como resultado que el homogenato de res presenta mayor actividad enzimatica, seguida por el de pollo y por ultimo el de cerdo.

Para el analisis electroforetico se emplearon geles de poliacrilamida al 12%. Se observo el patron electroforetico de los homogenatos en condiciones no reductoras. Si bien para todas las muestras se vio un patron comun (resultados no mostrados), no se detecto actividad por zimografia (resultado no mostrado). Se infirio que la actividad calpaina habia disminuido por debajo de la sensibilidad del metodo (< pmol) [25], dado que la muestra superaba el tiempo post mortem, el cual no se conocia con exactitud. Ademas, se sabe que la actividad calpaina disminuye en funcion del tiempo [7, 11, 12]. La cuantificacion de la actividad (TABLA I), no registrada por zimogramas, quiza se deba a una actividad proteasa global y no especifica a calpaina. Camou y col. [3] estudiaron la actividad calpaina durante el almacenamiento post mortem, encontrando que la actividad p-calpaina disminuye rapidamente durante el envejecimiento y su actividad es menor al 5% despues de 72 h. Despues de 48 h, las calpainas pueden no ser proteoliticamente activas a pH 5,8 (valor de pH del musculo post mortem).

Debido a ello, se decidio cambiar a una fuente biologica obtenida inmediatamente despues del sacrificio del animal, directamente del matadero para el caso de la carne de res y de un criadero rural para la carne de cerdo y pollo. Los homogenatos se prepararon 96 h despues de la muerte del animal. El protocolo se vario y se homogeneizaron las muestras en una licuadora (marca Oster, modelo 4090, Oster de Venezuela), se pesaron 200 mg/mL (balanza marca Ohaus, modelo Scout Pro SP2001, Scout Corporation, China) y seguido de esto se procedio a centrifugar. Se ha reportado que el uso de diferentes tampones de extraccion influye notablemente sobre la actividad calpaina [22]; por ello se realizaron los analisis por dos vias de extraccion distintos.

La FIG. 1a muestra el patron electroforetico de los homogenatos preparados por el metodo A, donde se observan al menos 13 bandas bien definidas para cada carril. El ensayo por zimografia muestra (FIG. 1b) una correspondencia de las bandas de ~80 kDa en el perfil electroforetico con la actividad registrada en la zimografia. Esto implica la presencia de autolisis, ya que la forma nativa de 110.000 no esta presente.

[FIGURA 1 OMITIR]

A continuacion se prepararon sobrenadantes por los metodos de extraccion A y B. Se obtuvo actividad para los tres sobrenadantes durante la realizacion de los ensayos fotometricos (TABLA II). Por zimografia, no obstante, solo presentaba actividad el homogenato de pollo (imagen no mostrada), con una banda representativa de ~70 kDa. Esto confirmo la posibilidad de autolisis por parte de la calpaina encargada de la proteolisis post mortem, debido a la presencia de calcio en el medio de reaccion.

En funcion del comportamiento observado durante el analisis de estos sobrenadantes, se procedio a concentrar las muestras cinco veces su volumen. Se atribuyo que no existia suficiente cantidad de enzima en los sobrenadantes provenientes de los homogenatos, impidiendo su deteccion por el metodo zimografico. La cantidad de proteinas totales presentes en las muestras concentradas fue recalculado. La TABLA III presenta una tendencia similar para las muestras tratadas con los diferentes metodos de extraccion. Por el metodo A, empero, se obtiene ~10 veces menor actividad proteolitica en comparacion con el metodo B.

La actividad de las muestras extraidas por el metodo A es mas especifica, ya que estan presentes una serie de inhibidores en el tampon de extraccion (EDTA, PMSF, leupeptina), que no inhiben la actividad calpaina, pero si otras proteasas. Ademas, el tampon de extraccion contiene NaCl y Triton X100, los cuales facilitan la extraccion de la proteina citoplasmatica [1]. El metodo B, en contraste, da valores mas altos de actividad para los mismos homogenatos. El tratamiento de la muestra en este metodo es mas sencillo, solo se adiciona EDTA y 2-ME como agente reductor. Esto sugiere que quizas se esten midiendo otras actividades proteasas que en el metodo A estan inhibidas.

En la FIG. 2, se muestra el perfil electroforetico del homogenato extraido por el metodo A en condiciones reductoras y no reductoras. Se observa que en condiciones no reductoras (FIG. 2b), existen unas bandas bien definidas en la parte superior del gel de ~99; 100 y 108 kDa, correspondientes al sobrenadante concentrado de cerdo, res y pollo. Este comportamiento no se observa en los carriles del 1-3 en condiciones re ductoras (a), las bandas correspondientes a estos pesos moleculares no se observan, lo cual indica que, la proteina de estudio es un heterodimero, corroborando reportes previos [4,11]. La FIG 2c muestra el perfil electroforetico obtenido de los sobrenadantes en condiciones nativas donde se comprueba la existencia de la banda con un peso molecular de ~100 kDa (carriles 7-9).

[FIGURA 2 OMITIR]

Existe la posibilidad de que la [micron]-calpaina se encuentre activa y desnaturalizada en las subunidades que la componen, ya que en estos ensayos el tampon de muestra contiene SDS, lo que origina la formacion de complejos desnaturalizados proteina-SDS [5], excepto para la electroforesis nativa. La autolisis de la calpaina, especificamente de la [micron]-calpaina, puede ser el factor predominante en este ensayo. Las calpainas del musculo esqueletico tienen un masa molecular de 110 kDa en geles no desnaturalizantes, el cual es disociado a dos subunidades de 80 y 30 kDa en SDS-PAGE. A su vez, se reporta que la subunidad de 80 kDa de [micron]-calpaina se autolisa durante el almacenamiento post mortem en fragmentos de 78; 76; 75; 61 y hasta 23 kDa [8, 10, 15, 24]. [micron]-calpaina es supuestamente responsable de la proteolisis de las proteinas miofibrilares durante el almacenamiento post mortem, y la principal responsable de la terneza. Se ha confirmado que [micron]-calpaina esta activa en el musculo post mortem [23]. Otra de las razones para atribuirle la degradacion miofibrilar a esta calpaina, es que la concentracion intracelular de [Ca.sup.2+] en el musculo longissimus es suficientemente alta para activar a la p-calpaina y no a la m-calpaina [17]. Adicionalmente, Veiseth y col. [24] observaron que la autolisis de la [micron]-calpaina fue detectada por primera vez a las 3 h post mortem y que entre las 3 y 24 h despues del sacrificio se empieza a autolisar la subunidad larga (80 kDa) de [micron]-calpaina originando los fragmentos de 78 y 76 kDa. Empero, Koohmaraie [11], en sus estudios por SDS-PAGE, obtuvo como resultado de la autolisis de las subunidades de 80 y 30 kDa, la generacion de polipeptidos de 61; 55; 40; 27; 23 y 18 kDa; donde el resultado de autolisis de la subunidad de 30 kDa produce solo un polipeptido con el peso molecular estimado de 18 kDa, los demas fragmentos son generados de la subunidad de 80 kDa.

Para comprobar si la subunidad larga de la [micron]-calpaina se encontraba desnaturalizada, se procedio con el analisis de las muestras concentradas mediante SDS-PAGE (12,5%) en condiciones no reductoras, en conjunto con el analisis de los homogenatos por zimografia (FIG. 3). En este ensayo se detecto degradacion de la caseina copolimerizada, obteniendose actividad proteolitica en los carriles correspondientes a las muestras de pollo y cerdo por los dos metodos de extraccion propuestos, la muestra de res extraida por el metodo A presento poca actividad, y no se logro distinguir con claridad su banda al momento de escanearla. Las bandas obtenidas corresponden a ~60 kDa para res, ~57 y 51 kDa para pollo y ~59 kDa para cerdo de los extractos por el metodo A, y de ~57 y 49 kDa para pollo y ~55 kDa para cerdo de los extractos por el metodo B, comprobando asi, por el perfil electroforetico donde se presentan bandas con masas moleculares cercanas a los obtenidos por zimografia, que la calpaina se encuentra autolisada.

Koohmaraie [11] reporta resultados similares en cuanto a la actividad de estos fragmentos productos de la autolisis de la subunidad de 80 kDa. El autor [11] senala que el producto de la autolisis de 61 kDa es casi tan activa como la subunidad de 80 kDa intacta. Adicionalmente, reporta que un polipeptido de 60 kDa y otro de 56 kDa retienen la actividad en ausencia de la subunidad de 80 kDa. Tambien indican que polipeptidos de 40 kDa representan una forma inactiva de la calpaina. Otra forma de evidenciar la autolisis es en las muestras de pollo, que aparece como un doblete a alturas del gel muy cercanas. Esta muestra presenta mayor actividad tipo calpaina. El tejido de pollo presenta activa la [micron]- y [micron]/m calpaina, una calpaina que hasta los momentos se ha encontrado solo en aves y su distribucion en el tejido de pollo varia de un musculo a otro [15]. La terneza post mortem ocurre mas rapido en la carne de pollo porque esta se completa en 2 d, luego de ella se alcanza en la carne de cerdo, completada a los 5 d y por ultimo en la carne de res, que toma casi 2 semanas en completarse [10]. Koohmaraie y col. [10] concluyen que la diferencia de terneza entre la carne de cerdo y res y por consiguiente la del pollo, se debe a la regulacion causada por la calpastatina.

[FIGURA 3 OMITIR]

Se ha reportado [16] que durante las primeras 72 h de almacenamiento de la carne se produce hasta el 80% de la terneza maxima posible por efecto de la proteolisis post mortem del musculo. Este efecto esta relacionado con alta actividad [micron]-calpaina y baja actividad de la calpastatina. Existe coincidencia en que la concentracion de calpastatina al momento de la muerte del animal es uno de los factores que afecta la calidad de la carne. Si al momento del sacrificio los niveles de calpastatina son altos, la carne sera menos tierna.

CONCLUSIONES E IMPLICACIONES

La extraccion de calpainas por el metodo A logro mantener la actividad enzimatica durante el proceso de analisis, y contuvo mayor cantidad de actividad calpaina especifica. Se corroboro la importancia de poseer muestras frescas para la obtencion de resultados positivos de actividad calpaina. El perfil electroforetico obtenido en condiciones desnaturalizantes reductoras, no reductoras y nativas confirmo la estructura heterodimerica de calpaina. La zimografia revelo bandas de actividad proteolitica correspondiente a masa moleculares de ~114 kDa en homogenato de pollo, ~103 kDa en el homogenato de res y ~99 kDa en el homogenato de cerdo, a las 96 h post mortem, por el metodo A, provenientes de sobrenadantes sin concentrar. La calpaina presente en los homogenatos de estudio se autoliso en funcion del tiempo de almacenamiento. Por zimografia se revelaron bandas de actividad proteolitica correspondiente a masa moleculares de ~60 kDa para res, 57 y 51 kDa para pollo y 59 kDa para cerdo de los extractos por el metodo A, y de 57 y 49 kDa para pollo y 55 kDa para cerdo de los extractos por el metodo B de los sobrendantes concentrados. Es indispensable para el empleo de esta tecnica una concentracion relativamente elevada de proteinas totales en el sobrenadante y realizar ensayos a pH acido (~4,5), ya que las calpainas han arrojado actividad en ese rango de pH [4, 11]. La implementacion de esta tecnica como criterio para asegurar la terneza en la carne es factible, mas debe estandarizarse el procedimiento.

Recibido: 21/03/2014. Aceptado: 14/11/2014.

AGRADECIMIENTO

Este trabajo fue subvencionado parcialmente por el Consejo de Desarrollo Cientifico y Humanistico de la Universidad de Carabobo (CDCH-UC), No. CDCH-AM-031-11. Los autores agradecen la permisologia otorgada para experimentar en los laboratorios de Bioquimica y Biotecnologia del Dpto. de BiologiaFACYT-UC. Se agradece tambien la asistencia tecnica del personal especialista adscrito a ellos. Este trabajo conto con la colaboracion academica de la Universite de Toulouse, INP-ENSAT, Francia.

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Damaris Oropeza, Liliana Kurz y Jeff Wilkesman *

AMBIOQUIM, Centro de investigacion y extension en Ambiente, Biologia y Quimica, Facultad Experimental de Ciencias y Tecnologia, Universidad de Carabobo. jwilkesm@uc.edu.ve

* Telefono +58.241.600.5000 ext. 375.068, jwilkesm@uc.edu.ve
TABLA I

DETERMINACION PRELIMINAR DE ACTIVIDAD CALPAINA EN SOBRENADANTES

Fuente (a)             Concentracion             Proteinas totales
             ([micron]g x [micron][L.sup.-1])       ([micron]g)
                      ([+ o -] 0,01)              ([+ o -] 0,01)

Cerdo                      6,52                        7,82
Pollo                      6,76                        8,11
Res                        3,95                        4,75

Fuente (a)    Actividad total (b)          Actividad especifica
             (nmol x [min.sup.-1])   (nmol x [min.sup.-1][mg.sup.-1]
                                              de homogenato)

Cerdo           2,6 [+ o -] 0,2              2,4 [+ o -] 0,2
Pollo           5,5 [+ o -] 0,3              3,3 [+ o -] 0,2
Res             3,7 [+ o -] 0,9              3,7 [+ o -] 0,9

(a) Empleando muestras de carniceria extaidas por el metodo B,
con un volumen final de 250 [micron]L. (b) Medida a 280nm,
con 5 g/L de caseina a 25[grados]C, 60 min.

TABLA II

EFECTO DE LA EXTRACCION SOBRE LA ACTIVIDAD CALPAINA

Metodo           Fuente    Concentracion         Proteinas
                            ([micron]g x        totales (a)
                              [micron]          ([micron]g)
                            [L.sup.-1])

A (Arthur)       Cerdo      18 [+ o -] 2      7,3 [+ o -] 0,9
                 Pollo    14,5 [+ o -] 0,1   5,81 [+ o -] 0,05
                  Res       15 [+ o -] 2      6,0 [+ o -] 0,6
B (Koohmaraie)   Cerdo      19 [+ o -] 2      7,7 [+ o -] 0,9
                 Pollo    15,3 [+ o -] 0,1    6,1 [+ o -] 0,1
                  Res       16 [+ o -] 1      6,4 [+ o -] 0,6

Metodo           Fuente      Actividad         Actividad
                             total (b)        especifica
                              (nmol x           (nmol x
                           [min.sup.-1])     [min.sup.-1]
                                             [mg.sup.-1])

A (Arthur)       Cerdo      8 [+ o -] 2     3,7 [+ o -] 0,7
                 Pollo      7 [+ o -] 1     3,7 [+ o -] 0,7
                  Res     4,0 [+ o -] 0,2   2,1 [+ o -] 0,1
B (Koohmaraie)   Cerdo    8,5 [+ o -] 0,2   3,6 [+ o -] 0,1
                 Pollo    8,9 [+ o -] 0,3   4,7 [+ o -] 0,2
                  Res     8,0 [+ o -] 0,2   4,0 [+ o -] 0,1

(a) Para un volumen final de 125 [micron]L. (b) Actividad
medida a 280 nm, con 5 mg/mL de caseina a 25[grados]C y 60 min.

TABLA III

EFECTO DE LA CONCENTRACION SOBRE LA ACTIVIDAD CALPAINA

Metodo           Fuente      Proteinas          Proteinas
de extraccion               totales sin          totales
                             concentrar        concentradas
                               (mg x              (mg x
                            [mL.sup.-1])       [mL.sup.-1])

A (Arthur)       Cerdo      18 [+ o -] 2       48 [+ o -] 2
                  Res       15 [+ o -] 2       37 [+ o -] 3
                 Pollo    14,5 [+ o -] 0,1   49,0 [+ o -] 0,1
B (Koohmaraie)   Cerdo      19 [+ o -] 2       41 [+ o -] 3
                  Res       16 [+ o -] 1       19 [+ o -] 2
                 Pollo    15,3 [+ o -] 0,1     66 [+ o -] 4

Metodo           Fuente       Actividad            Actividad
de extraccion                total (a,b)          especifica
                               (nmol x              (nmol x
                            [min.sup.-1])        [min.sup.-1]
                                                x [mg.sup.-1])

A (Arthur)       Cerdo    0,21 [+ o -] 0,02   0,035 [+ o -] 0,002
                  Res     0,46 [+ o -] 0,01   0,099 [+ o -] 0,004
                 Pollo    0,25 [+ o -] 0,01   0,040 [+ o -] 0,002
B (Koohmaraie)   Cerdo    1,76 [+ o -] 0,03   0,344 [+ o -] 0,005
                  Res      1,8 [+ o -] 0,1     0,78 [+ o -] 0,04
                 Pollo    1,95 [+ o -] 0,01   0,236 [+ o -] 0,002

(a) Actividad medida a 280 nm, con 5 g/L caseina,
25[grados]C y 60 min. (b) Volumen inicial a concentrar
500 [micron]L, volumen final concentrado 100 [micron]L.
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Author:Oropeza, Damaris; Kurz, Liliana; Wilkesman, Jeff
Publication:Revista Cientifica de la Facultad de Ciencias Veterinarias
Date:Jan 1, 2015
Words:5544
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