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Viral complexes detected in garlic by ELISA and confirmed by RT-PCR/Deteccion de complejos virales en ajo por ELISA y confirmados por RT-PCR/Deteccao de complexos virais no alho por ELISA e confirmados por RT-PCR.

Introduccion

El ajo (Allium sativum L.) ocupa el segundo lugar en importancia en el ambito mundial dentro de las especies del genero Allium, despues de la cebolla (Allium cepa L.) (FAOSTAT, 2012). Las especies del genero Allium se ven afectadas por la presencia de enfermedades, destacando entre estas las de etiologia viral. En plantas de ajo, estas enfermedades son causadas por varios virus (complejos virales) y su eliminacion es dificil, debido a que los virus del ajo se acumulan en los bulbillos y se propagan por reproduccion vegetativa. El complejo viral esta integrado por mas de ocho especies pertenecientes a los generos potyvirus, carlavirus y allexivirus, y producen la enfermedad denominada como mosaico del ajo (Cafrune et al., 2006; Perez et al., 2010). Los potyvirus: virus enanismo amarillo de la cebolla (Onion yellow dwarf virus: OYDV) y virus rayado amarillo del puerro (Leek yellow stripe virus: LYSV), asi como varias especies de allexivirus (GarV-A, B, C, D y X) son a nivel mundial los patogenos virales mas extendidos en los cultivos del genero Allium (Cafrune et al., 2006; Klukackova et al., 2007). Los virus OYDV y LYSV son severos y por consiguiente los que mas afectan el rendimiento y la calidad de los bulbos (Dovas et al., 2001; Perez et al., 2010). La contribucion al dano total de cada uno de los virus individuales de la mezcla no habia sido investigada en Mexico, salvo en el caso de los poty-virus (OYDV y LYSV; Perez y Rico, 2004; Ramirez et al., 2006; Perez et al., 2008) y de los carlavirus (GCLV y SLV; Perez et al., 2008).

Durante muchos anos, la deteccion de los virus en ajo estuvo basada en la sintomatologia, tipos de hospedantes y serologia (Salomon, 2002); sin embargo, estas metodologias tienen desventajas tales como la imprecision y la duracion para obtener los resultados, lo cual puede ocasionar como consecuencia una identificacion erronea de los agentes virales causales de las enfermedades. Por ejemplo, virus similares o identicos de diferentes paises fueron caracterizados como especies diferentes (Yamashita et al., 1995; Salomon et al., 1996). Por lo tanto, el uso de tecnicas modernas y de frontera es un requisito indispensable para la identificacion precisa de los virus que causan enfermedades en la planta de ajo, y la aplicacion de tecnicas moleculares ha resultado en una identificacion y clasificacion mas precisa de los virus en ajo (Tsuneyoshi et al, 1998; Dovas et al., 2001). Por ejemplo, las tecnicas de RT-PCR, RT-PCR anidada y RT-PCR en tiempo real han sido utilizadas de manera exitosa en la identificacion de los virus presentes en plantas de ajo (Dovas et al., 2001; Lunello et al., 2004; Lunello et al., 2005; Leisova-Svobodova y Karlova-Smekalova, 2011).

Por otra parte, es ampliamente conocido que la infeccion por complejos virales disminuye el rendimiento y calidad del ajo y. por lo tanto, se requiere de un metodo confiable de indexacion especifica y eficiente para identificar estos patogenos (Perez et al., 2008; Perez et al., 2010). Con estos antecedentes, se planteo el objetivo de detectar los virus presentes en doce ecotipos seleccionados de plantas de ajo, ya sea de forma simple y/o en complejos virales, mediante analisis por ELISA y confirmarlo por RT-PCR.

Materiales y Metodos

Material genetico de ajo

Un compuesto o ecotipo seleccionado de ajo es una mezcla fisica formada por diferentes lineas geneticas, las cuales tienen en comun su lugar de origen y su respuesta a la incidencia de virosis. Para el caso de este estudio, se evaluaron 10 ecotipos seleccionados de ajo de plantas asintomaticas de diferentes localidades, a saber: 'Monte Cristo 2, Los Rodriguez', de San Miguel de Allende y 'Tabla 1, El Ramillete', 'Tabla 2, El Ramillete' y 'Tabla 3, El Ramillete', de San Luis de La Paz, en la zona norte del estado de Guanajuato; 'Santa Teresa Tabla 3, Valtierrilla' y 'Santa Teresa Tabla 4, Valtierrilla', de Salamanca y 'Pozo Alto 1, El Pato', 'Pozo Alto 2, El Pato', 'Laurel 1, El Pato', 'Bodegas, El Pato', de Salamanca, en la zona centro del estado de Guanajuato. Tambien se evaluaron dos ecotipos seleccionados aparentemente enfermos: mezcla 1 de varios predios y mezcla 2 de varios predios, los cuales presentaron distintos sintomas presuntivos de una virosis: enchinamiento y/o enrollamiento, mosaico, deformacion de hojas, amarillamiento y ampollamiento, bandeado y enanismo. Los 12 ecotipos seleccionados evaluados fueron del ajo tipo Taiwan y los bulbos se produjeron en el ciclo otono-invierno 2008-2009, cosechandose en marzo 2009.

Area de estudio y ciclo de cultivo

El estudio se realizo en el Rancho San Pablo, municipio de San Luis de la Paz, Guanajuato, Mexico, localizado en 21[grados]17'5"N y 100[grados]30'5"O, a una altura de 2,035msnm (www. sanluisdelapaz.com/mexico/localizacion). La temperatura media anual en 2009 fue de 16,3[grados]C y en 2010 fue de 15,4[grados]C. La temperatura minima promedio anual en 2009 fue de 7,7[grados]C (1,4 a 13,5) y en 2010 fue de 7,1[grados]C (-2,6 a 14,1). La precipitacion media anual fue de 303,4 y 512,0mm en 2009 y 2010, respectivamente (http://clima.inifap.gob.mx/red-clima/clima/historicos.aspx). La siembra se realizo el 09/10/2009. Los 12 ecotipos seleccionados se sembraron en parcelas individuales de cinco surcos de 6m de largo y 1m de ancho, a doble hilera.

Analisis estadistico

El diseno experimental utilizado fue en bloques completos al azar, con tres repeticiones.

Evaluacion viral

Tambien se evaluo la presencia de los potyvirus: virus rayado amarillo del puerro (Leek yellow stripe virus: LYSV) y virus enanismo amarillo de la cebolla (Onion yellow dwarf virus: OYDV); los carlavirus: virus latente del shallot (Shallot latent virus: SLV) y virus latente comun del ajo (Garlic common latent virus: GCLV); y el tospovirus: virus manchado amarillo del iris (Iris yellow spot virus: IYSV). Para la deteccion de los virus se utilizo la tecnica de inmunoabsorcion enzimatica (ELISA), y para la confirmacion de los resultados obtenidos con ELISA se uso la tecnica de RT-PCR.

Fechas de evaluacion y colectas

La deteccion viral se realizo en tres fechas de muestreo, a los 71, 120 y 147 dias despues de la siembra (dds). Para formar la muestra a evaluar, se colecto una hoja de cada una de cinco plantas de la parcela experimental. Dependiendo del ecotipo seleccionado sembrado, las plantas podian presentar sintomas presuntivos de una virosis, o ser asintomaticas. El ensayo comprendio 36 parcelas o unidades experimentales, a las cuales se les realizaron tres muestreos, para un total de 108 muestras. Estas fueron colocadas en bolsas de plastico y mantenidas a -20[grados]C hasta su procesamiento.

Analisis de las muestras

Las muestras fueron procesadas en el Laboratorio de Fitopatologia, DICIVA-CIS, Universidad de Guanajuato, Mexico. Los virus se detectaron mediante la inmunoabsorcion enzimatica de doble anticuerpo (DAS; Clark y Adams, 1977; Cruz y Frias, 1997). Para la determinacion de los virus LYSV, OYDV, GCLV, IYSV y SLV se utilizaron los kits de Agdia Inc. (Elkhart, IN, EEUU); los cuatro primeros se conjugaron con la enzima fosfatasa alcalina, mientras que el ultimo se conjugo con la enzima peroxidasa. Los controles positivo y negativo (extracto de hojas de cebolla) fueron de Agdia Inc. La absorbencia se determino en un espectrofotometro BIORAD Modelo 3550-UV, a 405nm para LYSV, OYDV, GCLV y IYSV y 655nm para el virus SLV.

Evaluacion de resultados y determinacion del limite de deteccion

Las lecturas de cada muestra se hicieron por duplicado y el valor medio de cada par fue registrado. El valor del control sano se calculo en base al promedio de los dos valores de absorbencia del testigo sano (negativo) para cada virus. Como criterio para determinar el limite de deteccion se uso el valor medio de densidad optica del control negativo mas 0,05, y todo valor mayor a este limite se considero positivo (SARH, 1994; citado por Cruz y Canseco, 1995).

Confirmacion de la presencia viral

Los resultados obtenidos en la deteccion viral por ELISA se corroboraron por RT-PCR. En las muestras de follaje de ajo seleccionadas se realizo la extraccion de RNA total utilizando el metodo del Trizol ([Trizol.sup.MR], Invitrogen, Grand Island, NY, EEUU), siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Para la retrotranscripcion (sintesis de cDNA) se empleo 1ug del RNA de cada muestra analizada, y para su sintesis se utilizo la enzima Super Script IIA de Invitrogen, siguiendo las indicaciones del fabricante.

Los oligonucleotidos para cada virus fueron disenados en regiones especificas del gen que codifica para la proteina de la capside (Tabla I).

Para obtener los amplicones de cada virus se utilizaron las siguientes condiciones: para todos se realizo una desnaturalizacion inicial a 94[grados]C por 4min, seguido por 35 ciclos de desnaturalizacion a 94[grados]C por 45s cada uno, un alineamiento por 45s a 52,4[grados]C para LYSV; a 46,3[grados]C para OYDV; a 49,5[grados]C para SLV; a 47,0[grados]C para GCLV; y a 47,3[grados]C para IYSV, seguido de una extension a 72[grados]C por 90s para los cinco virus, y una extension final a 72[grados]C por 7min para los cinco virus. Los productos amplificados fueron separados por electroforesis en gel de agarosa 1%, tenidos con bromuro de etidio y observados en un transiluminador UV.

Resultados y Discusion

Deteccion de los virus por la tecnica de ELISA

Se detecto por medio de la prueba de ELISA la presencia de los cinco virus en el follaje de los ecotipos seleccionados evaluados. En la primera, segunda y tercera fechas de muestreo se detecto el LYSV con frecuencias del 100,100 y 100%; el OYDV con frecuencias del 50, 75 y 77,7%; el SLV con frecuencias del 19,4; 30,5 y 0%; el GCLV con frecuencias del 100,0; 97,2 y 91,6%; y el IYSV con frecuencias del 0,0; 2,.7 y 22,2% (Tabla II). Estos resultados coinciden con los de Smekalova et al. (2010), quienes reportaron la presencia de los virus OYDV, LYSV, GCLV y SLV en germoplasma de ajo, con un intervalo de frecuencia del 65,0 al 83,0%. Asimismo concuerdan con los descritos por Klukackova et al. (2007) para OYDV y GCLV, ya que sus frecuencias fueron de 75,4 y 99,6% respectivamente, aunque mantienen diferencias para LYSV y SLV, para los que sus frecuencias fueron de 31,2 y 81,1% respectivamente. Posiblemente las diferencias sean atribuibles a distintas condiciones climaticas, al material genetico de ajo evaluado y a las poblaciones de vectores presentes en las diferentes localidades.

[FIGURA 1 OMITIR]

En la Tabla II se observa una frecuencia de infeccion del 53,8% en la primera fecha de evaluacion, 61,1% en la segunda fecha y 58,3% en la tercera fecha de evaluacion, lo que implica una mayor deteccion de virus a la mitad del ciclo de cultivo de la planta; esto no significa que los virus hayan desaparecido de las plantas en la tercera fecha de evaluacion, sino que posiblemente se haya reducido el titulo viral y por lo tanto la prueba de ELISA resulto negativa. Resultados similares han sido reportados por Koch y Salomon (1994), quienes observaron cambios en las concentraciones de OYDV a traves del tiempo al analizar plantas obtenidas de meristemos. Asimismo, Conci et al. (2002) reportaron cambios en las concentraciones de LYSV en plantas de ajo en diferentes estadios de desarrollo del cultivo. Lo anterior muestra la importancia de acotar diferentes tiempos de lectura viral para tener resultados confiables y reducir la posibilidad de diagnosticar plantas enfermas como sanas, y tambien lleva a sugerir que las detecciones virales se realicen cuando las plantas se encuentren al 50% de su ciclo de cultivo.

Deteccion de los virus presentes por RT-PCR

La tecnica de RT-PCR permitio detectar y confirmar la presencia de los cinco virus analizados (Figura 1). Los tamanos de los fragmentos amplificados por RT-PCR fueron: LYSV 1020pb, OYDV 940pb, SLV 1145pb, GCLV 727pb e IYSV 1069pb. Los resultados obtenidos para el GCLV son similares a los reportados por Majumder y Baranwal (2009) con tamanos de fragmentos de 536pb; asimismo, para el OYDV son parecidos a los reportados por Arya et al. (2006), con un tamano de fragmento amplificado por RT-PCR de 1111pb. Para el SLV son semejantes a los reportados por Mituti et al. (2011) y por Torrico et al. (2010) con tamanos de fragmentos de 960 y 992pb, respectivamente. Tambien, para el IYSV son similares a los reportados por Bag et al. (2009), Gawande et al. (2010) y Hafez et al. (2012), con tamanos de fragmentos amplificados por RT-PCR de 1100, 797, y 1100pb, respectivamente. Por otra parte, como se aprecia en la Figura 2, el virus LYSV se detecto en el 55,5% de las muestras analizadas, el OYDV en el 66,6%, el SLV se detecto en el 100,0%, el GCLV en el 55,5% y el IYSV en el 77,7%. Finalmente, se confirmo por RT-PCR que las muestras negativas detectadas por ELISA no tenian presencia de ninguno de los cinco virus analizados (datos no mostrados).

[FIGURA 2 OMITIR]

Comparacion de las tecnicas de ELISA y RT-PCR

Aunque la tecnica de ELISA a menudo ha sido utilizada para realizar el diagnostico de virus en ajo (Conci et al., 2003), la tecnica de PCR ha demostrado ser mas eficiente y sensible (Dovas et al., 2001; Shiboleth et al., 2001). Al comparar los resultados obtenidos en la deteccion de virus en ajo con las tecnicas de ELISA y RT-PCR, se tiene que el virus LYSV por la tecnica de ELISA se detecto con frecuencias del 100,0; 100,0 y 100,0% en las tres fechas de evaluacion, para un promedio de 100,0% (Tabla II), comparado con una deteccion del 55,5% por la tecnica de RT-PCR (Figura 2); en el caso del virus OYDV, por la tecnica de ELISA se detecto con frecuencias del 50,0; 75,0 y 77,7% en las tres fechas de evaluacion, respectivamente, dando un promedio de 67,6% (Tabla II), comparado con la deteccion del 66,6% por la tecnica de RT-PCR (Figura 2); para el virus SLV se detecto por ELISA con frecuencias del 19,4; 30,4 y 0,0% en las tres fechas, respectivamente, dando un promedio de 16,6% (Tabla II), comparado con la deteccion del 100,0% por la tecnica de RT-PCR (Figura 2); el virus GCLV se detecto por ELISA con frecuencias del 100,0; 97,2 y 91,6%, respectivamente, con un promedio de 96,3% (Tabla II), comparado con la deteccion del 55,5% por la tecnica de RT-PCR (Figura 2); y el virus IYSV se detecto por ELISA con frecuencias del 0,0; 2,8 y 22,2% con un promedio de 8,3% (Tabla II), comparado con la deteccion del 77,7% por la tecnica de RT-PCR (Figura 2).

En los casos de los virus SLV e IYSV la tecnica de ELISA detecto promedios para las tres fechas de evaluacion de 16,6 y 8,3% respectivamente, mientras que con la tecnica de RT-PCR se alcanzaron promedios de 100 y 77,7%. La mayor sensibilidad de esta ultima tecnica coincide con lo reportado por Dovas et al. (2001), quienes utilizaron ambas tecnicas para detectar la presencia de los virus OYDV, LYSV y Allexi virus en especies del genero Allium, encontrando que la tecnica de RT-PCR es mas sensible que ELISA. La variabilidad de los resultados obtenidos con las dos tecnicas de deteccion de virus lleva a sugerir que es conveniente seguir utilizando ambas.

[FIGURA 3 OMITIR]

Deteccion de complejos virales en ecotipos seleccionados de ajo

En la Figura 3 se puede observar que todos los virus se presentaron en forma de complejos: en el 55,5% de las muestras se presento un complejo de cuatro virus, y en el 44,4% se presento uno de tres. Del 55,5% de los complejos formados por cuatro virus, el 22,2% correspondio a OYDV+SLV+GCLV+ IYSV, el 22,2% a LYSV+ OYDV+ SLV+GCLV y el 11,0% a LYSV+SLV+GCLV+ IYSV. Para el caso de los complejos de tres virus, el 22,2% correspondio a OYDV+SLV+ IYSV y el 22,2% a LYSV+ SLV+IYSV. Estos resultados coinciden con los obtenidos por Fidan y Baloglu (2009) que reportaron la presencia de LYSV y OYDV (ambos poty virus); por Majumder et al. (2008) que reportaron OYDV y SLV, y Majumder y Baranwal (2009) que reportaron OYDV, SLV y GCLV, ambos en follaje de ajo; y por Pappu et al. (2005) y Gieck et al. (2007), que encontraron la mezcla de LYSV, OYDV y GCLV (dos potyvirus y un carlavirus).

En el presente estudio se detecto el SLV en todos los complejos de tres o de cuatro virus. El GCLV se encontro en todos los complejos formados por cuatro virus, mientras que LYSV, OYDV e IYSV solo se observaron en dos de las tres combinaciones de complejos de cuatro virus. Estos resultados muestran que no existe una asociacion clara que indique que un virus sea determinante para que se forme el complejo viral. De manera aislada, un solo virus es capaz de ocasionar sintomas claros de virosis en la planta infectada de ajo sin que estos se tornen graves; sin embargo, la sintomatologia mas severa esta asociada a complejos virales, tal es el caso del Ecotipo Seleccionado 12 que en la tercera fecha de evaluacion presento el complejo viral de cuatro virus LYSV+OYDV+ SLV+ GCLV, lo cual concuerda con los reportes de Gieck et al. (2007); Lunello et al. (2007, 2008) y Fidan y Baloglu (2009).

Conclusiones

Las infecciones virales en el cultivo del ajo ocasionan severas perdidas en la cosecha. Esas infecciones pueden estar formadas por varios tipos de virus y hasta donde se conoce, este es el primer reporte sobre la presencia de complejos virales formados hasta por cuatro virus; pertenecientes a los generos potyvirus-carlavirus-tospovirus. Tanto la tecnica de ELISA como la RT-PCR tienen la capacidad de detectar la presencia de los virus en los extractos de hoja de plantas de ajo, siendo la pertinencia de utilizar una de esas tecnicas o ambas para estimar las infecciones virales en los campos una decision que el investigador debe valorar de acuerdo con su experiencia. Ambas metodologias tienen sus ventajas y sus desventajas; sin embargo, su uso asegura una determinacion mas precisa de la presencia de los virus en plantas de ajo.

Recibido: 28/09/2012. Modificado: 22/05/2013. Aceptado: 29/05/2013.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a Javier Usabiaga Arroyo, Javier Usabiaga Gonzalez, Teresa de Jesus Castillo y Esteban Macias Padilla, de Grupo "U", por las facilidades para el establecimiento y conduccion del experimento en sus terrenos, en El Rancho San Pablo, San Luis de la Paz, Gto., Mexico; a la Universidad de Guanajuato, Mexico, por el apoyo para la realizacion de esta investigacion y al Consejo de Ciencia y Tecnologia del Estado de Guanajuato (CONCYTEG) por el financiamiento parcial para la realizacion de esta investigacion bajo el Convenio No. 06-16-k117-23. Finalmente, agradecemos a la Rectoria del Campus Irapuato-Salamanca de la Universidad de Guanajuato y al Programa Integral de Fortalecimiento Institucional (PIFI) 2012, por el apoyo economico brindado en la contribucion para la publicacion de este trabajo.

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Martha J. Navarro-Leon. Ingeniera Agronoma y Maestra en Proteccion Vegetal de Hortalizas, UGTO, Mexico. Asistente de Investigacion, DICIVA-UGTO, Mexico.

Rafael Ramirez-Malagon. Ingeniero Agronomo, UGTO, Mexico. Maestro en Biologia de Plantas y Doctor en Biotecnologia de Plantas, CINVESTAV, Mexico. Profesor-Investigador, DICIVA, UGTO, Mexico.

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Hector G. Nunez-Palenius. Biologo, Universidad Michoacana de San Nicolas de Hidalgo. Mexico. Maestria en Biologia de Plantas, CINVESTAV-IPN, Mexico. Ph.D. en Horticultura, University of Florida, EEUU. Profesor-Investigador, DICIVA-UGTO, Mexico.

Ma. Fabiola Leon-Galvan. Ingeniera Bioquimica, Instituto Tecnologico de Celaya. Mexico. Maestra en Ciencias en Ingenieria Bioquimica y Doctora en Ciencias en Biologia Molecular, Instituto Potosino de Investigacion Cientifica y Tecnologica, Mexico. Profesora-Investigadora, DICIVA-UGTO, Mexico.
TABLA I
OLIGONUCLEOTIDOS PARA LOS VIRUS
LYSV, OYDV, SLV, GCLV, IYSV, DISENADOS
EN REGIONES ESPECIFICAS DEL GEN QUE CODIFICA
PARA LA PROTEINA DE LA CAPSIDE

Virus   Nombre              Secuencia

LYSV    LYSV F   5'-GTGAAGAGTTGGATGCAG-3'
        LYSV R   5'-CATCAAGATGGTGCATACGTGC-3'
OYDV    OYDV F   5'-GTGGGTGCTGGAGCAAGCACC-3'
        OYDV R   5'-CTGATGTGAATAAGGATCATCAC-3'
SLV     SLV F    5'-GCACCGTACAATCTAATAGCG-3'
        SLV R    5'-GTCTCCCTAACAAAACGTGCA-3'
GCLV    GCLV F   5'-CGAGYGTTAATGATGTTGA-3'
        GCLV R   5'-CGGCCATTRCGCCTATTCCT-3'
IYSV    IYSV F   5'-CTCTTAAACACATTTAACAAGCAC-3'
        IYSV R   5'-TAAAACAAACATTCAAACAA-3'

F: Forward, R: Reverse.

TABLA II
FRECUENCIA (%) DE INFECCION POR LOS VIRUS
LYSV, OYDV, SLV, GCLV, E IYSV EN FOLLAJE
DE 12 ECOTIPOS SELECCIONADOS DE AJO COLECTADO
EN TRES FECHAS DE MUESTREO DEL CICLO
OTONO-INVIERNO 2009-2010

Virus             1a            2da          3era       Promedio
                evaluacion    evaluacion   evaluacion     (y)
               (71 dds (z))   (120 dds)    (147 dds)

LYSV              100,0         100,0        100,0       100,0
OYDV               50,0          75,0         77,7        67,6
SLV                19,4          30,5         0,0         16,6
GCLV              100,0          97,2         91,6        96,3
IYSV               0,0           2,8          22,2        8,3
Promedio (x)       53,8          61,1         58,3

(z) DIas despues de sembrado.

(y) La frecuencia promedio de cada virus se calculo
de 108 determinaciones.

(x) La frecuencia promedio de cada fecha de muestreo
se calculo de 180 determinaciones.
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Author:Perez-Moreno, Luis; Navarro-Leon, Martha J.; Ramirez-Malagon, Rafael; Mendoza-Celedon, Briseida; Nun
Publication:Interciencia
Date:May 1, 2013
Words:4562
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