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Viabilidad espermatica e integridad del acrosoma en semen congelado de toros nacionales.

Sperm Viability and Acrosome Integrity in National Frozen Bull Semen

INTRODUCCION

En la actualidad se ha masificado la utilizacion de semen congelado para la inseminacion artificial del ganado bovino, dado el incremento de la productividad en esta especie por el uso de machos de alta calidad genetica; sin embargo, las tasas de concepcion al primer servicio son todavia relativamente bajas. Esta fertilidad esta influenciada por la capacidad fecundante de los espermatozoides que se encuentran en la pajilla de semen.

Se requiere un metodo de valoracion de la calidad seminal, que al utilizarlo solo o en combinacion con otros, sea capaz de predecir en forma rapida y segura la capacidad fecundante de una muestra de semen (Rodriguez-Martinez, 2003). Las caracteristicas seminales clasicas (volumen, concentracion, vitalidad, morfologia, motilidad) estan relacionadas con la fertilidad del animal, pero presentan variaciones en la fertilidad individual que, en ocasiones, sobrestiman o subestiman el potencial fecundante del macho.

El acrosoma juega un papel fundamental en la fecundacion. En el acrosoma se puede distinguir tres regiones claramente diferenciadas: la zona acrosomal con su borde apical, la zona post acrosomal y el segmento ecuatorial entre ambas, los mismos que tienden a romperse en el proceso de refrigeracion, congelacion y descongelamiento. Muestras seminales con alta proporcion de alteraciones acrosomales suelen tener una fertilidad baja (Pena y Linde-Forsberg, 2000).

La reactividad de la membrana acrosomal representa un requisito absoluto para la fertilizacion y solo los espermatozoides que pueden realizar la reaccion acrosomal (RA) de manera sincronizada con la fase de penetracion del oocito, tienen la habilidad de pasar a traves de la zona pelucida y, como consecuencia, fusionarse con este para formar un embrion (Januskauskas et al., 2000). Asimismo, Fraser (1994) ya habia demostrado en espermatozoides de raton que solo aquellos con acrosoma intacto pueden unirse a la membrana pelucida. No obstante, algunas celulas espermaticas pueden sufrir la RA de manera espontanea, existiendo diversas experiencias que muestran la necesidad de moleculas especificas asociadas con el ovocito en la induccion de la RA (Florman y Storey, 1982).

La integridad de la membrana plasmatica y acrosomal reflejan la viabilidad espermatica, y el proceso de criopreservacion podria afectar estas membranas ocasionando danos como hinchamiento y disrupcion de las mismas, cambios en la fluidez, alteracion del flujo de calcio y cambios en la actividad enzimatica que pueden inducir una capacitacion espermatica anticipada, viendose afectada la fertilidad (Tartaglione y Ritta, 2004).

Idealmente, el metodo para determinar el estado acrosomal debe ser exacto, rapido e inocuo para la funcion espermatica; asimismo, debe poder emplearse en distintos medios y fluidos, y ser capaz de diferenciar reacciones acrosomicas falsas, que estan asociadas a la muerte de la celula, con reacciones verdaderas, asociadas a la fecundacion (Cross y Meizel, 1989).

La prueba de resistencia osmotica (HOST), que evalua la integridad de la membrana espermatica y la prueba de integridad acrosomal, a traves de tincion Azul de Tripan/ Giemsa, permiten predecir con bastante confiabilidad la capacidad fertil de un toro, toda vez que se ha encontrado correlaciones altas y positivas con la tasa de fertilidad in vivo (Aisen et al, 2002).

El objetivo del presente estudio fue evaluar el grado de deterioro de la membrana espermatica e integridad del acrosoma en espermatozoides de toros del Banco Nacional de Semen (Lima, Peru), durante los procesos de refrigeracion y congelacion-descongelacion, como caracteristicas importantes para predecir la fertilidad en toros jovenes de alto valor genetico. Asi mismo, se evaluo la relacion existente entre la evaluacion de motilidad (valoracion subjetiva) y las pruebas de integridad de membrana e integridad acrosomal (valoracion especifica).

MATERIALES Y METODOS

Lugar de Ejecucion y Duracion

El estudio se realizo en las instalaciones del Banco Nacional de Semen de la Universidad Nacional Agraria (UNA) La Molina, ubicado en la ciudad de Lima, Peru. El promedio de temperatura maxima en la epoca de calor fue de 28.7[grados]C y el promedio minimo en la epoca de frio fue de 14.6[grados]C, con humedad relativa promedio de 80% y precipitacion anual de 60 mm (Observatorio Meteorologico A. Von Humbolt--UNA La Molina). El desarrollo de la parte experimental tuvo una duracion de 6 meses.

Animales

Se utilizaron cuatro toros donadores de semen (2 Holstein y 2 Brown Swiss), de 1.5 a 2 anos de edad, del Banco Nacional de Semen.

Los toros estaban alojados en toriles independientes, con parte del piso de concreto y otra de tierra. Los toriles eran de material noble y madera, provisto de sombras, comedero y bebedero, y con adecuada iluminacion y ventilacion. Todos los animales tuvieron un regimen de paseo, una vez por semana por un tiempo de 60 minutos. La alimentacion fue en base de maiz chala (Zea mays) fresco y picado, suplementado con concentrado (14% proteina, 17.5% fibra y 68.5% NDT). El forraje se ofrecio dos veces al dia y el concentrado por las mananas.

Coleccion de Semen

Se utilizo un brete de monta de 3.0 m de largo, 1.50 m de ancho y 1.80 m de alto. El semen fue obtenido mediante vagina artificial. La temperatura interior de la vagina fue estandarizada a 35[grados]C, y se utilizo una misma funda para cada toro durante el estudio. Los tubos de coleccion estaban rotulados y protegidos del medio ambiente con papel metalico y funda. La frecuencia de coleccion de semen fue de dos veces por semana. Para el proposito del estudio, se trabajo con 10 eyaculados por toro.

El eyaculado fue inmediatamente trasladado al laboratorio para la evaluacion preliminar, manteniendose en todo momento a 32.5[grados]C por medio de bano maria y platina temperada del microscopio. La temperatura ambiental en el laboratorio fue de 20[grados]C.

Evaluacion Macroscopica

--Volumen (ml). Se determino mediante observacion directa al tubo de ensayo graduado. No se considero las burbujas de aire sobre la superficie del semen.

--Color y aspecto. El color se determino por su aspecto, el cual estuvo asociado a su calidad (entre blanco cremoso a blanco lechoso). El aspecto se determino por el grado de opacidad, variando de denso cremoso a denso acuoso.

--pH. Se utilizo papel indicador de ph (PANPEHA[R], Sigma Aldrich).

Evaluacion Microscopica

--Actividad masal. Se coloco una alicuota de semen puro (20 [micron]L) sobre una lamina portaobjetos en el microscopio optico con objetivo de 10x y con platina temperada a 32.5[grados]C. Se estimo mediante una valoracion subjetiva del movimiento masivo de los espermatozoides, segun Evans et al. (1990), con un rango de 0 a 5.

--Motilidad. Se determino en base a la proporcion de espermatozoides progresivamente moviles, expresado en porcentaje. Para ello, se coloco una alicuota de semen sobre una lamina portaobjetos y cubierta con una laminilla. Se observo al microscopio con objetivo de 40x.

--Concentracion espermatica. El contaje de espermatozoides se hizo en la camara de Neubauer, la que fue cargada con un hemocitometro, segun la tecnica descrita por Evans y Maxwell (1990), con la variante del uso de agua bidestilada para inmovilizar a los espermatozoides.

--Porcentaje de espermatozoides vivos y muertos. Se coloco una gota de semen y dos gotas de eosina y de nigrosina. Se mezclo en una lamina portaobjetos y se hizo un frotis. Se dejo secar por 20 segundos y se observo al microscopio con objetivo de 40x. Se contaron 300 celulas espermaticas con ayuda de dos contometros, y la frecuencia de vivos (espermatozoides blancos) y muertos (espermatozoides rojos) se expreso en porcentaje.

--Morfologia espermatica. Se hicieron frotices de espermatozoides tenidos con eosina-nigrosina y se observo en el microscopio usando un objetivo de 40x. Se observaron 100 celulas espermaticas en tres campos, considerando anormales todos los espermatozoides que presentaban irregularidad en su forma, segun lo descrito por Evans y Maxwell (1990). El resultado es el promedio de los tres campos evaluados.

Dilucion y Congelacion

Para la dilucion se utilizo una parte del dilutor Bioxell Buffer IMV[R] y cuatro partes de agua bi-destilada. Esta mezcla, debidamente homogenizada se coloco en bano maria a 32.5[grados]C por 10 a 15 minutos previo a la mezcla con el semen.

Se hizo una pre-dilucion, agregando el dilutor al semen en una proporcion de 1:1 en bano maria a 32.5[grados]C. Se determino el numero de pajillas a congelar, considerando una concentracion de 20 x [10.sup.6] espermatozoides

por dosis de semen, y se adiciono la cantidad de dilutor correspondiente. Se homogenizo suavemente, se comprobo la motilidad de los espermatozoides en el microscopio y se procedio a envasar el semen en pajillas de 0.5 ml (pajillas Cassou IMV[R] Technologies, Francia).

Para el proceso de congelacion, el descenso de la temperatura se realizo en cubetas con agua a temperatura ambiente (20[grados]C) y luego en refrigeradora (5[grados]C) por 18 a 22 horas. Si la temperatura no alcanzo los 5[grados]C antes de la congelacion se agrego cubos de hielo al envase de agua para lograr la temperatura adecuada. La congelacion de semen se realizo siguiendo el metodo que usa el Banco Nacional de Semen (vapores de nitrogeno liquido para descender a razon de 20[grados]C por minuto, durante 7 minutos, y luego se sumergieron las pajillas en nitrogeno liquido para llegar a -196[grados]C). El semen se almaceno en tanques criogenicos. Para la descongelacion, las pajillas se sumergieron en agua a 37[grados]C por espacio de 15 a 20 segundos y fueron secadas con papel toalla.

La motilidad del semen se evaluo antes y despues de la congelacion. Semen con motilidad inferior a 60% era descartado, segun la politica de trabajo del Banco Nacional de Semen. Se emplearon 10 pajillas por toro tomadas al azar para las evaluaciones postdescongelacion.

Integridad de Membrana Citoplasmatica y del Acrosoma

Para determinar la integridad de la membrana citoplasmatica en semen descongelado se utilizo la prueba de endosmosis (hipoosmotica--HOST) mediante solucion hipoosmotica de citrato de sodio (100 mOsm/ L), siguiendo el protocolo utilizado por Correa y Zavos (1994). La lectura se hizo en un microscopio de contraste de fase con objetivo de 40x. Se observan 300 espermatozoides en un minimo de 10 campos microscopicos, donde aquellos con membrana citoplasmatica intacta muestran una deformacion de la cola por efecto de la hinchazon.

Para evaluar la integridad del acrosoma en semen descongelado se utilizo la solucion de doble tincion (Giemsa [Merck 1.09203]-Azul Tripan [Sigma T0776]), descrita por Didion et al. (1990). Los espermatozoides considerados como vivos y con el acrosoma intacto presentaban color rosado en la parte de la membrana acrosomal y azul palido en la base, mientras que los muertos presentaban una coloracion azul oscuro. Se contaron 200 espermatozoides por lamina.

Analisis Estadistico

Se aplico un test de normalidad para los datos numericos. Los valores porcentuales fueron transformados mediante arco seno: Y = arc sen [[(x/100).sup.1/2]], donde x representa los valores porcentuales.

Se aplico un test de normalidad a los valores. En el analisis de las caracteristicas del semen congelado/descongelado (volumen, motilidad masal, porcentaje de espermatozoides vivos, HOST e integridad de acrosoma) se determino las medidas de tendencia central como la desviacion estandar y coeficiente de variacion.

Para la evaluacion de la respuesta a la motilidad, integridad de membrana (endosmosis positiva), e integridad de acrosoma espermatica se empleo un diseno completamente al azar, cuyo modelo matematico lineal fue [Y.sub.ij] = [my] + [T.sub.i] + [e.sub.iy y] donde [Y.sub.ij] = variable respuesta de espermatozoides vivos y con acrosoma intacto del i-esimo tratamiento (toro), [my] = media general, [T.sub.i] = efecto del j-esimo tratamiento (toros), [e.sub.ij] = error experimental. Ademas, se determino el coeficiente de correlacion entre las pruebas realizadas (motilidad, HOST e integridad de acrosoma en semen congelado/descongelado) (Perez Lopez, 2001).

En todos los analisis estadisticos se utilizo el programa SAS (Statistical Analysis System), v 8.0, para un error de 0.05 (Perez Lopez, 2001).

RESULTADOS Y DISCUSION

Las colecciones seminales fueron homogeneas, de color blanco cremoso, aspecto denso, con pH promedio de 6.8, 4.33 ml de volumen, 922.5 x [10.sup.6]/ml de concentracion espermatica y 86.0% de espermatozoides vivos (Cuadro 1). Estas caracteristicas se encuentran dentro de los parametros establecidos para toros en actividad reproductiva, aunque en el analisis estadistico se encontro diferencias estadisticas entre toros (p < 0.05). Los resultados fueron similares a los reportados por Gastelum et al. (1989) con volumenes de eyaculado de 4.0 a 8.5 ml en toros de Raza Brown Swiss y Holstein.

La motilidad individual progresiva en semen refrigerado fue adecuada para el procesamiento de semen congelado, y los valores fueron superiores a los valores de 76.7-85.5% reportados por Madrid-Bury et al. (2005) en cinco toros de doble proposito en condiciones de tropico. Los valores de integridad de membrana citoplasmatica fueron homogeneos (56.7-59.1%), sin diferencia estadistica entre toros. Asimismo, la integridad del acrosoma en semen refrigerado fue uniforme (59.3-69.2%) y similar a los valores de 70.2-73.5% de Madrid-Bury et al. (2005). Estos resultados, que se observan en el Cuadro 2, demuestran que el acrosoma se pudo mantener en una gran proporcion de espermatozoides durante el proceso de refrigeracion del semen.

Se debe indicar que se tuvo que descartar el semen del toro D en dos oportunidades debido a que la motilidad post-descongelacion fue menor de 60%, a fin de seguir las normas establecidas por el Banco Nacional de Semen. Esto al parecer ocurrio por un desnivel en la cantidad de nitrogeno que se requeria para generar vapores de nitrogeno durante la congelacion.

Los valores de la evaluacion microscopica en el semen descongelado se muestran en el Cuadro 3. Se observa una ligera perdida de la calidad espermatica debido al proceso de congelacion y descongelacion. Una particularidad importante de resaltar es que la perdida en la proporcion de espermatozoides viables y capaces de fecundar (con acrosoma intacto) por efecto de la congelacion/descongelacion fue similar entre los toros. Esto indica que la calidad seminal de un toro persiste en forma proporcional desde la coleccion y durante el proceso de congelacion y descongelacion; es una caracteristica propia del individuo segun su genotipo. En base a esto, se puede remarcar la importancia de conocer la proporcion de espermatozoides con acrosoma intacto en cada toro, ya que esta medida determina su capacidad fecundante.

Los valores de motilidad espermatica post descongelamiento fueron menores a motilidades entre 66 a 75% senaladas en la literatura (Correa et al, 1996; Quispe, 2005), aunque se encuentran dentro de los rangos esperados. Estas diferencias pudieron ser debidas al protocolo de descongelamiento empleado (Nur et al., 2003).

En el Cuadro 4, se presentan los valores comparativos de la proporcion de esperma-tozoides viables y capaces de fecundar en los diferentes momentos de procesamiento del semen. Se compara los promedios a la prueba de integridad de acrosoma en semen refrigerado (65.2%) respecto al semen descongelado (48.6%), respectivamente.

El toro C, quien mostro una alta proporcion de espermatozoides vivos en el semen puro fue el que presento la mayor perdida de espermatozoides con acrosoma intacto (-34.5%), aunque sin diferencias estadisticas entre toros. La capacidad fecundante y la actividad funcional de la membrana plasmatica se encuentra afectada por los cambios metabolicos que ocurren a su alrededor, incluyendo los eventos que ocurren durante la capacitacion en el tracto femenino (Ducci, 2002). En el presente estudio, la integridad del acrosoma, dentro de cada parte del procesamiento de semen presento una baja variabilidad entre toros y entre eyaculados.

Por otro lado, el 65.2% de espermatozoides con acrosoma intacto antes de la congelacion fue estadisticamente superior (p < 0.05) al 48.6% observado despues de la congelacion/descongelacion, mostrando el grado de influencia del efecto de la congelacion sobre la calidad espermatica. Esta disminucion fue, sin embargo, menor a lo reportado por Thomas et al. (1998), quienes afirman que durante el proceso de criopreservacion se produce una disminucion del 50% de la viabilidad espermatica, debido principalmente al efecto de la temperatura y la presion osmotica, que ocasionan cambios en la permeabilidad, composicion lipidica de las membranas espermaticas y en el liquido intracelular. Correa et al. (1994) mostraron que a temperaturas menores a 37[grados]C, el fluido de iones, moleculas y proteinas a traves de la membrana espermatica disminuye. Los resultados de HOST fueron coincidentes con otros estudios (Correa et al, 1996; Nur et al, 2003), aunque diferentes a los resultados presentados por Quispe (2005), posiblemente debido al tipo de animal y condiciones del procesamiento de semen.

Las correlaciones entre motilidad espermatica antes y despues de la congelacion no fue estadisticamente significativa con los resultados de HOST ni con la integridad del acrosoma, mostrando que son caracteristicas muy independientes. Es decir, un incremento o disminucion en la proporcion de espermatozoides sin alteraciones funcionales en sus membranas espermaticas, no estaria asociado a un incremento o disminucion en el movimiento espermatico. En condiciones fisiologicas normales, la fecundacion no ocurre si la membrana plasmatica del espermatozoide es bioquimicamente inactiva, aun cuando permanezca estructuralmente intacta, por lo tanto la prueba hipoosmotica es un indicador preciso, ya que permite distinguir el adecuado funcionamiento de la membrana espermatica (Tamuli et al, 1992).

Tampoco se encontro una correlacion significativa entre integridad del acrosoma y de la membrana plasmatica. Sin embargo, la correlacion entre motilidad de semen refrigerado y semen descongelado fue altamente significativa (r = 0.81948; [p < 0.001]).

CONCLUSIONES

* El proceso de refrigeracion y congelacion/descongelacion de semen de toros del Banco Nacional de Semen (Lima, Peru) no tuvo un efecto biologico importante sobre la membrana espermatica ni sobre la integridad del acrosoma.

* La calidad espermatica de los toros fue adecuada durante el proceso de congelacion de semen, sin haber diferencia estadistica entre toros.

* No se observaron correlaciones significativas entre motilidad, integridad de membrana espermatica e integridad del acrosoma.

LITERATURA CITADA

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(14.) Perez Lopez C. 2001. El sistema estadistico SAS. Madrid: Prentice Hall. 773 p.

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(19.) Thomas CA, Garner DL, Dejarnette JM, Marshall CE. 1998. Effect of cryopreservation of bovine sperm organelle function and viability as determined by flow cytometry. Biol Reprod 58: 786-793.

Prospero Cabrera V. [1,3], Cesar Pantoja A. [2,4]

[1] Departamento de Produccion Animal, [2] Programa Doctoral en Ciencia Animal, Facultad de Zootecnia, Universidad Nacional Agraria La Molina (UNALM), Lima [3] E-mail: procecavi@lamolina.edu.pe [4] E-mail: pantoja4444@hotmail.com
Cuadro 1. Caracteristicas seminales en cuatro toros (1)
Holstein y Brown Swiss del Banco Nacional de Semen
(Lima, Peru)

Toro       Volumen (ml)           Concentracion
                                  (x[10.sup.6])

A      4.5 (a,b) [+ o -] 1.0    800 (a) [+ o -] 103
B        5.1 (a) [+ o -] 1.8        770 [+ o -] 149
C        3.9 (b) [+ o -] 1.1   1130 (b) [+ o -] 106
D        3.8 (b) [+ o -] 1.1    990 (c) [+ o -] 129

Toro   Espermatozoides vivos
                (%)

A        80.4 (a) [+ o -] 3.4
B        74.1 (b) [+ o -] 7.6
C        81.8 (a) [+ o -] 4.6
D      77.5 (a,b) [+ o -] 6.6

Superindices desiguales dentro de columnas Indican
diferencias significativas (p < 0.05) 10 eyaculados
por toro

Cuadro 2. Motilidad individual, endosmosis e integridad
de acrosoma en semen refrigerado de cuatro toros (1)
Holstein y Brown Swiss del Banco Nacional de Semen (Lima,
Peru)

Toro        Motilidad (%)           Endosmosis (%)

A      85.1 (a,b)  [+ o -] 2.0   59.1 (a) [+ o -] 1.9
B       85.1 (a,b) [+ o -] 1.5   56.7 (a) [+ o -] 3.3
C         86.0 (a) [+ o -] 3.2   58.1 (a) [+ o -] 2.5
D         82.7 (b) [+ o -] 3.3   57.4 (a) [+ o -] 3.7

Toro      Integridad de
           acrosoma (%)

A      69.2 (a) [+ o -] 3.1
B      65.9 (a) [+ o -] 4.0
C      59.3 (a) [+ o -] 3.3
D

(a) Superindices desiguales dentro de columnas indican
diferencias significativas (p < 0.05)

(1) 10 eyaculados por toro

Cuadro 3. Motilidad individual, endosmosis e integridad
de acrosoma en semen congelado/descongelado de cuatro
toros (1) Holstein y Brown Swiss del Banco Nacional de
Semen (Lima, Peru)

Toro      Motilidad (%)          Endosmosis (%)

A      62.7 (a) [+ o -] 1.7   40.7 (a) [+ o -] 5.0
B      62.1 (a) [+ o -] 1.5   40.6 (a) [+ o -] 3.0
C      63.0 (a) [+ o -] 2.0   37.1 (a) [+ o -] 3.4
D      61.2 (a) [+ o -] 2.1   41.2 (a) [+ o -] 6.7

Toro      Integridad de
           acrosoma (%)

A      52.0 (a) [+ o -] 7.2
B      46.1 (a) [+ o -] 7.2
C      47.3 (a) [+ o -] 7.4
D      49.1 (a) [+ o -] 5.0

Superindices iguales dentro de columnas indican ausencia
de diferencia significativa (p < 0.05) 10 eyaculados por
toro

Cuadro 4. Integridad del acrosoma en espermatozoides respecto a
diferentes momentos del procesamiento del semen de cuatro toros (1)
Holstein y Brown Swiss del Banco Nacional de Semen (Lima, Peru)

           Semen puro         Semen refrigerado

Toro       Espermatozoides    Espermatozoides    Diferencia
              vivos (%)        con acrosoma      con semen
                                intacto (%)         puro

A          80.4 [+ o -] 3.4   69.2 [+ o -] 3.1    (-11.2)
B          74.1 [+ o -] 7.6   65.9 [+ o -] 4.0     (-8.2)
C          81.8 [+ o -] 5.0   59.3 [+ o -] 3.3    (-22.5)
D          77.5 [+ o -] 6.6   66.5 [+ o -] 3.3    (-11.0)

Promedio         7S.5               65.2          (-13.2)

           Semen puro         Semen congelado

Toro       Espermatozoides    Espermatozoides    Diferencia
              vivos (%)        con acrosoma      con semen
                                intacto (%)         puro

A          80.4 [+ o -] 3.4   52.0 [+ o -] 7.2    (-28.5)
B          74.1 [+ o -] 7.6   46.1 [+ o -] 7.2    (-28.0)
C          81.8 [+ o -] 5.0   47.3 [+ o -] 7.4    (-34.5)
D          77.5 [+ o -] 6.6   49.1 [+ o -] 5.0    (-28.5)

Promedio         7S.5               48.6            29.9

(1) 10 eyaculados por toro
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Author:Cabrera V., Prospero; Pantoja A., Cesar
Publication:Revista de Investigaciones Veterinarias del Peru (RIVEP)
Date:Apr 1, 2012
Words:4368
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