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Variabilidad genetica y recurrencia de Plasmodium vivax durante la malaria asintomatica en Mazan, Iquitos, Peru.

Genetic variability of Plasmodium vivax and patterns of recurrence in asymptomatic malaria at Mazan, Iquitos, Peru

INTRODUCCION

La malaria es un principal problema en salud publica y se ha convertido en una enfermedad reemergente en los lugares donde antes habia sido controlada. La malaria ocasiona, en el mundo, alrededor de un millon de muertes cada ano y mas de tres billones de personas estan en riesgo de infeccion, siendo considerada la enfermedad tropical mas importante, segun la Organizacion Mundial de la Salud (1). Entre las cuatro especies causantes de malaria, Plasmodium falciparum (P falciparum) y Plasmodium vivax (P vivax) tienen la mayor incidencia, considerando a P falciparum como la mas peligrosa, por su letalidad, por la dispersion mundial de sus estirpes resistentes a las drogas antimalaricas y por su predominio en Africa, el continente con mayor incidencia de malaria (2).

En Sudamerica, P vivax es el parasito mas importante causante de malaria en terminos de su morbilidad; hoy en dia, Peru ocupa el tercer lugar despues de Brasil y Colombia, siendo la region amazonica la mas afectada (1). Los casos de malaria por P falciparum ocurren mayormente en areas de la jungla peruana, mientras que la malaria ocasionada por P vivax es ademas endemica en la costa y valles interandinos, por lo que se presume que es la especie predominante (3,4).

En estas regiones endemicas, donde la transmision de P vivax es continua, la deteccion mediante vigilancia activa de casos asintomaticos podria no ser relevante, pero los datos sugieren la aparicion de sintomas tempranos con escasa deteccion que llega al 0,1% (5). Esto puede atribuirse al hecho de que las personas experimentan sintomas rapidamente, lo cual conduce al incremento de pacientes con manifestaciones subclinicas no diagnosticadas, de los cuales solo algunos pasan a la deteccion por vigilancia pasiva en centros de salud y son sometidos a tratamiento, generalmente con farmacos como la cloroquina (6). La frecuencia de malaria asintomatica no es conocida en regiones de transmision baja. En Peru, los estudios se han limitado a disenos transversales, como los efectuados en las comunidades al sur de Iquitos, donde en un estudio de 998 individuos se encontro 13 con P falciparum y 30 con P vivax, detectados por microscopia; de estos, solo 8 y 19, respectivamente, comunicaron solamente fiebre. En zonas endemicas, el incremento de la inmunidad frente a las constantes infecciones, aunque no es protectora, evita las complicaciones de la enfermedad, incrementando el numero de portadores asintomaticos (5,6).

Claros ejemplos son los estudios realizados en Brasil, especificamente en las localidades riberenas de Rondonia, Portuchuelo y Ji-Parana, donde se diagnostico infecciones por P vivax y P falciparum con formas asintomaticas y sintomaticas de la enfermedad, siendo estrechamente similares para ambas especies. En estas regiones geograficas, la prevalencia de infecciones asintomaticas fue 4 a 5 veces mayor que las sintomaticas, 20% y 4,6% para Portuchuelo, 49,5% y 10% para Ji-Parana, respectivamente. La alta prevalencia de la malaria asintomatica puede representar nuevos problemas para las estrategias de control adoptadas para la malaria en la region amazonica, la cual esta basada esencialmente en el tratamiento de pacientes sintomaticos (7). Por otra parte, el incremento de la malaria asintomatica se encuentra vinculado con las constantes infecciones o recurrencias de Plasmodium; asi, en el estado de Acre (Granada), en la base de la Amazonia occidental de Brasil que limita con Peru y Bolivia, comunican indices de P vivax = 0,39 y de P falciparum = 0,13 infecciones/persona/temporada, con rangos de recurrencia postratamiento de 26% a 40% en 180 dias de seguimiento (8).

La genotipificacion de muestras secuenciales en individuos provenientes de regiones endemicas permite determinar la asociacion genotipica entre distintos episodios de la infeccion, lo cual conlleva a determinar la recurrencia de la infeccion (9,10). Las reinfecciones y los relapsos son patrones de recurrencia poco conocidos; sin embargo, se sabe que los relapsos son una caracteristica importante de P vivax originados por estadios latentes en el higado, conocidos como hipnozoitos. Los relapsos pueden ocurrir semanas o anos despues de registrado el primer episodio de parasitemia (11).

Las recurrencias de la infeccion por P vivax generalmente son clasificadas por metodos de genotipificacion, para lo cual se ha utilizado diversos marcadores geneticos, como los genes pvsc, pvmspl (12,13) y el pvmsp3-[alfa], que codifica para la proteina de superficie 3[alfa] del merozoito del parasito, de mayor utilidad debido a su manejo, costo bajo y reproducibilidad alta; este marcador permite realizar una diferenciacion precisa entre distintos genotipos del parasito (14). Es importante senalar que las recurrencias muestran diferencias notables entre diferentes cepas; asi, las que provienen de zonas tropicales presentan infecciones primarias tempranas, con un corto periodo latente de 4 a 10 semanas antes de la aparicion de frecuentes relapsos durante el siguiente ano; en cambio, las cepas de zonas templadas presentan infecciones primarias de periodo variable, entre 5 a 10 meses antes del comienzo de los relapsos (13,15). En el 2009, en Guyana Francesa se encontro picos de relapsos de P vivax similares a los de zonas tropicales, es decir, los relapsos se presentaron dentro de los tres meses despues del primer episodio; despues de este tiempo, los episodios secundarios fueron principalmente debidos a reinfecciones (16).

Estudios similares se han realizado en la Amazonia peruana desde el 2006, exactamente en el departamento de Loreto, donde se destaca la necesidad de efectuar analisis de genotipificacion en zonas endemicas a malaria, por prevalencia de infecciones mixtas e incremento de recurrencias de la parasitemia principalmente por P vivax (17). Por tales motivos, el presente estudio tuvo como principal objetivo determinar la variabilidad genetica de P vivax y los patrones de recurrencia en individuos con malaria asintomatica, provenientes de la comunidad de Mazan, la cual actualmente esta catalogada como una zona de riesgo alto en la transmision de la malaria, principalmente por P vivax.

METODOS

El presente estudio se realizo con muestras colectadas durante los anos 2006 a 2008 en la comunidad de Mazan, ubicada en la parte nororiental del Peru, a 50 km de la ciudad de Iquitos. Durante este periodo, mediante el sistema de vigilancia activa, se logro reclutar un total de 496 individuos asintomaticos. Para el estudio se considero un tamano muestral de 222 individuos, calculado con un nivel de confianza al 95% (Z[[alpha].sub.2] = 1.962), proporcion esperada del 50% (p = 0,5; q = 1-p) y una precision estadistica en 5% (d = 0,05) (18). Todos los individuos fueron previamente informados sobre el presente estudio. Se incluyo a todos los individuos comprendidos entre 0 a 75 anos de edad, con firma de consentimiento informado, residentes en la zona endemica, que tuvieron dos muestras secuenciales, evaluados durante un ano de seguimiento activo. Se excluyo a los individuos con tratamiento antimalarico previo a la evaluacion.

A todos los individuos que formaron parte de la poblacion muestral se les tomo 5 mL de sangre total (puncion venosa). Todas las muestras fueron mantenidas a -20[grados]C y posteriormente enviadas al area de Biologia Molecular del Laboratorio de Investigacion en Enfermedades Infecciosas de la Universidad Peruana Cayetano Heredia en Lima-Peru. Este estudio forma parte del proyecto Human reservoirs of Plasmodium vivax transmission in the Peruvian Amazon, el cual fue aprobado por el comite de etica de la universidad en mencion (codigo SIDISI: 50457) y tambien aprobado por los comites de etica de la Universidad Johns Hopkins (USA), la Asociacion Benefica PRISMA y el Ministerio de Salud, a traves de la Direccion Regional de Salud de Loreto.

Se realizo la extraccion de ADN a partir de muestras de sangre con EDTA, usando el protocolo del kit comercial QIAamp DNA Blood (Qiagen Sciences, Maryland-USA). El volumen utilizado fue de 200 [micron]L, del cual se obtuvo entre 20 a 50 ng de ADN, posteriormente empleado para las pruebas de diagnostico y genotipificacion molecular.

La identificacion de las especies de Plasmodium se realizo mediante el nested-PCR (reaccion en cadena de la polimerasa anidada), que consta de dos PCR consecutivos, realizados con la finalidad de aumentar tanto la especificidad como la sensibilidad del analisis. Las secuencias, los oligonucleotidos y las condiciones de reaccion y amplificacion fueron adaptadas a partir de un estudio epidemiologico efectuado previamente en la ciudad de Iquitos (6).

La primera PCR amplifico un segmento del gen que codifica el ARN ribosomal 18S (SSUrRNA), especifico del genero Plasmodiun, con los oligonucleotidos: Pgen1 = 5'-CTTGTTGTTGCCTTAAACTTC-3' y Pgen2 = 5'-TTAAAATTGTTGCAGTTAAAACG-3'. El volumen final de reaccion fue de 15 [micron]L, conteniendo buffer 1X (Tris HCl 10 mM y KCl 50 mM), 2,0 mM de Mg[Cl.sub.2], 0,2 mM deoxinucleotidos (dNTPs), 0,25 [micron]M de cada oligonucleotido, 0,032 U/[micron]L de Taq ADN polimerasa y 50 ng de ADN molde. Condiciones: 95[grados]C por 3 min., 19 ciclos cada uno de 94[grados]C por 30 seg., 58[grados]C por 30 seg., 72[grados]C por 1 min. 30 seg. y 1 ciclo de extension final de 72[grados]C por 7 min.

La segunda PCR amplifico una region interna especifica para P vivax y para P. falciparum, con los oligonucleotidos para P vivax Viv1 = 5'-CGCTTCTAGCTTAATCCACATAACTGATAC-3' y Viv2 = 5'-ACTTCCAAGCCGAAGCAAAGAAA-GTCCTTA-3', los cuales amplificaron 120 pares de bases (pb), para P falciparum: Fal1=5'TTAAACTGGTTTGGGAAAACC-AAATATATT-3' y Fal2=5'-ACACAATGAACTCAATCATGACTACCCGTC-3', los cuales amplificaron 205 pb. El volumen final de reaccion fue de 15 [micron]L, conteniendo buffer 1X, 2,0 mM de Mg[Cl.sub.2], 0,2 mM de dNTPs, 0,5 [micron]M de cada oligonucleotido, 0,032 U/[micron]L de Taq ADN polimerasa y 1 [micron]L de ADN obtenido de la primera amplificacion. Condiciones: 95[grados]C por 2 min, 34 ciclos cada uno de 94[grados]C por 30 seg., 60[grados]C por 1 min. 30 seg., 72[grados]C por 1 min. 30 seg., y finalmente 1 ciclo de extension de 72[grados]C por 7 min.

La genotipificacion de P. vivax se realizo mediante la tecnica de PCR-RFLP para la cual se utilizo el gen pvmsp3-[alfa] que codifica la proteina de superficie 3[alfa] del merozoito del parasito (MSP3-[alfa]); este marcador ha sido usado en otras investigaciones en zonas endemicas de Sudamerica como en nuestro pais (19), Colombia (10) y en Brasil (20), tambien en lugares como Tailandia (14), Papua Nueva Guinea (21) y la India (22). Las secuencias, los oligonucleotidos y las condiciones de reaccion y amplificacion fueron adaptadas a partir de estos estudios epidemiologicos.

Nested-PCR: Para la amplificacion del gen pvmsp3-[alfa], la primera PCR se realizo con los oligonucleotidos: P1V1=5'CAGCAGACACCATTTAAGG-3' y P2V1=5'-CCGTTTGTTGATTAGTTGC-3'. El volumen final de reaccion fue de 15 [micron]L, conteniendo buffer 1X, 2,0 mM de Mg[Cl.sub.2], 0,15 mM de dNTPs, 0,15 [micron]M de cada oligonucleotido, 0,013 U/[micron]L de Taq ADN polimerasa y 50 ng de ADN molde. Condi ciones: 94[grados]C por 3 min., 34 ciclos cada uno de 94[grados]C por 30 seg., 56[grados]C por 30 seg., 68[grados]C por 2 min. 30 seg. y 1 ciclo de extension final de 72[grados]C por 4 min.

Para la segunda PCR se utilizo los oligonucleotidos N1V1= 5'-GACCAGTGTGATACCATTAACC-3' y N2V1= 5'-ATACTGGTTCTTCGTCTTCAGG-3', con los cuales se amplifico 1900 pb y 1500 pb, correspondientes a las secuencias alelicas A y B, respectivamente. Las reacciones de amplificacion fueron similares a las usadas para la primera PCR con 1 [micron]L de ADN agregado a cada reaccion, obtenido de la primera amplificacion. Condiciones: 94[grados]C por 3 min., 29 ciclos cada uno de 94[grados]C por 30 seg., 57[grados]C por 30 seg., 68[grados]C por 2 min. 30 seg. y 1 ciclo de extension final de 68[grados]C por 4 min.

La digestion enzimatica se realizo a partir de los productos de amplificacion provenientes de la segunda PCR del nested PCR. Se utilizo dos enzimas de restriccion denominadas Alu I y Hha I (New England BIOLabs), las cuales permitieron establecer el polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccion o RFLP, ampliamente utilizadas para estudios de genotipificacion como los efectuados en Iquitos (Peru) (19), Colombia (10) y Brasil (20). Para la reaccion de digestion se uso 8 [micron]L del producto amplificado (ADN) conteniendo 0,5 unidades/enzima y se incubo a 37[grados]C por 3 horas. Los productos obtenidos (fragmentos de digestion) fueron visualizados en gel de agarosa al 2%, conteniendo 0,05 [micron]g de bromuro de etidio (1 [micron]g/mL). Se determino los tamanos de los fragmentos usando un marcador de peso molecular de 100 pb. Los patrones enzimaticos fueron designados en base al tamano de los fragmentos como haplotipos PA para Alu I y PH para Hha I. Se identifico las infecciones policlonales por la presencia de dos o mas secuencias alelicas del producto de PCR (alelos A o B) o por la suma de los fragmentos, cuando excedian el tamano del producto antes de la digestion (10).

La variabilidad genetica de P. vivax fue evaluada mediante la determinacion del nivel de la diversidad poblacional (PLD), tipicamente definido como la variacion de un gen en un loci antigenico, variable o neutral. Una medida de PLD es la heterozigocidad esperada He = 1/(1 - N) (1 - [suma de (termino)][p.sub.2i]), con p igual a la frecuencia de alelos y N igual al numero de alelos detectados), demostrando una alta variabilidad genetica con valores cercanos a la unidad. La complejidad de la infeccion (COI) es usada para evaluar el numero minimo de tipos de alelos presentes en un loci polimorfico de copia unica; un COI>1 puede ser determinado por la observacion de multiples alelos dentro de una unica muestra. Estos criterios fueron tomados en cuenta por estudios previos realizados en la Amazonia peruana (23).

Los patrones de recurrencia fueron establecidos a traves de la genotipificacion de P vivax, durante dos periodos de evaluacion. Se determino los relapsos cuando se encontro haplotipos identicos en ambos periodos y las reinfecciones cuando se hallo haplotipos diferentes. En estudios de la Amazonia rural de Brasil (8), la genotipificacion molecular permitio establecer los relapsos como la reactivacion del mismo clon del parasito, es decir, se identifico genotipos identicos tanto en la infeccion primaria como en la recurrencia de la enfermedad y en las reinfecciones se identifico genotipos diferentes. Asimismo, en Guyana Francesa (Camopi) (16) estiman las recurrencias como relapsos y reinfecciones tomando en cuenta rangos de tiempo antes y despues de 90 dias del primer episodio, respectivamente.

Para el analisis de datos, la identificacion de los haplotipos se realizo independientemente con cada enzima y con la combinacion de ambas. Para estimar la diferencia entre las medias de las frecuencias de haplotipos monoclonales, identificados en la primera y segunda evaluacion, se realizo un analisis de varianza, con tablas de contingencia, el cual emplea la razon de las estimaciones o razon de Fisher (F). El valor estadistico de F se obtuvo dividiendo la estimacion intermediante entre la estimacion interna; luego, se comparo con el valor tabular de F, en un intervalo de significancia al 95% ([alfa] = 0,05). Para determinar la asociacion entre los patrones de recurrencia y el rango de tiempo luego de la primera evaluacion, se aplico la prueba chi-cuadrado ([X.sup.2]), considerando una relacion altamente significativa con una probabilidad del 99% cuando p < 0,01 (tabla [X.sup.2]) y con grados de libertad mayores o iguales a 1(GL [mayor que o igual a] 1).

RESULTADOS

Durante la primera evaluacion se detecto 191/222 (86%) casos con infeccion por P vivax, 2/222 (0,9%) con infeccion por P falciparum, 21/222 (9,5%) con infeccion mixta y 8/222 (3,6%) fueron negativos (figura 1a). Durante la segunda evaluacion, considerando solo los casos con infeccion primaria por P vivax, se detecto recurrencias de la infeccion por P vivax en 180/191 (94,2%), los cuales fueron utilizados en los analisis posteriores de genotipificacion (figura 1b).

[FIGURA 1 OMITIR]

En la genotipificacion de P vivax en individuos con infeccion recurrente, mediante nested PCR se detecto 2 secuencias alelicas diferentes, el alelo A (1900 bp) y alelo B (1500 bp). En la primera evaluacion, 172/180 (95,5%) presentaron el alelo A, siendo el de mayor frecuencia, mientras que 8/180 (4,5%) presentaron el alelo B. En la segunda evaluacion 166/180 (92,2%) presentaron nuevamente el alelo A y 3/180 (1,7%) nuevamente el alelo B. Ademas, 5/180 (2,8%) con el alelo A y 6/180 (3,3%) con el alelo B fueron identificados en la primera evaluacion como alelos B y A, respectivamente (tabla 1).

Mediante la digestion enzimatica con Hha I, en el alelo A, se identifico nueve haplotipos monoclonales (PH1 a PH9) y tres haplotipos policlonales (PH11 a PH13). Con esta misma enzima, en el alelo B se identifico un haplotipo monoclonal (PH10) (figura 2a). Con Alu I, en el alelo A, se identifico seis haplotipos monoclonales (PA1PA6) y un haplotipo policlonal (PA8); con esta misma enzima, en el alelo B se identifico un haplotipo monoclonal (PA7) (figura 2b).

Con la combinacion de ambas enzimas se logro una mayor variabilidad genetica, identificando 14 haplotipos monoclonales (PAH1-PAH14) y siete haplotipos policlonales (PHA15-PHA21). El analisis de recurrencia permitio identificar a los haplotipos PHA13, PHA2 y PHA6 como los mas recurrentes, con 5,5 %, 7,2% y 12,2%, respectivamente. Los haplotipos PHA8, PHA10, PHA17 Y PHA19 no fueron identificados durante la primera evaluacion; por lo tanto, no presentaron recurrencia. Se identifico haplotipos no recurrentes y policlonales, presentes como haplotipos diferentes en la segunda evaluacion. La prueba F ([alfa] = 0,05; Fp<Ft), indico que no existe diferencias reales entre las frecuencias de haplotipos monoclonales identificados, mediante metodos de genotipificacion, en los dos periodos de evaluacion (figura 3). En el analisis estadistico, el 5,6% de los individuos presento un COI>1 en la primera evaluacion y 3,8% en la segunda evaluacion. Los valores PLD en ambos periodos de evaluacion fueron He = 0,88 y 0,87, respectivamente.

[FIGURA 2 OMITIR]

En la determinacion de los patrones de recurrencia de P vivax, la combinacion enzimatica permitio identificar infecciones por haplotipos policlonales en 17/180 (9,4%) casos, en alguno de los dos periodos de evaluacion. Se identifico infecciones por haplotipos monoclonales identicos (relapsos) en 75/180 (41,7%) y diferentes (reinfecciones) en 88/180 (48,9%) casos, en ambos periodos de evaluacion. En los relapsos, el haplotipo PHA6 fue el mas frecuente con 12,2% y los haplotipos PHA5 y PHA7 fueron los menos frecuentes, ambos con 0,6%. En las reinfecciones, los haplotipos PHA4 y PHA13 tuvieron mayores porcentajes de haplotipos diferentes durante la segunda evaluacion, con 8,4% y 7,8%, respectivamente. El haplotipo PHA12 solo presento 4,4% de haplotipos diferentes, ninguno identificado como causante de relapso (figura 4a).

[FIGURA 3 OMITIR]

[FIGURA 4 OMITIR]

En la distribucion de los patrones de recurrencias segun el rango de tiempo se observo 36/180 (20%) relapsos y 21/180 (11,7%) reinfecciones entre 0 a 90 dias. Los relapsos mostraron una disminucion de 25/180 (13,9%), 10/180 (5,6%) y 4/180 (2,2%) casos entre 180, 270 y 365 dias post-primera evaluacion, respectivamente. En cambio las reinfecciones incrementaron mientras mayor era el rango de tiempo, de 19/180 (10,5%), 21/180 (11,7%) y 27/180 (15%) casos en los mismos periodos de tiempo (tabla 2 y figura 4b). Asi mismo, la prueba X2 mostro una relacion altamente significativa (p<0,01), entre los patrones de recurrencia y el rango de tiempo en que se presentaron estos patrones.

DISCUSION

Las infecciones asintomaticas por Plasmodium son el principal problema en muchas regiones del mundo; la principal razon es que los individuos despues de repetidas infecciones desarrollan inmunidad contra estos parasitos, por lo que se minimiza la intensidad de los sintomas, manteniendo ademas una parasitemia muy baja por largos periodos de tiempo (24). La inmunidad adquirida en forma natural a traves de anticuerpos contra los estadios asexuales sanguineos de Plasmodium, ha sido demostrada desde los anos 1960, mediante tecnicas serologicas como Elisa (25). Se ha comprobado que los anticuerpos persisten entre tres y seis meses despues de la infeccion inicial (26). De esta manera, individuos de zonas endemicas podrian ser vinculados a un diagnostico recurrente de la enfermedad, por la presencia continua de estos anticuerpos.

Tecnicas novedosas como la PCR ofrecen alta sensibilidad y especificidad para la deteccion del ADN genomico de Plasmodium; ademas, es efectiva para la determinacion de infecciones mixtas (27). Diferentes estudios usan variantes, como el nested PCR para el diagnostico de Plasmodium (28); por lo general, este metodo es utilizado como prueba estandar. En Mazan-Iquitos, el diagnostico por nested PCR ha demostrado la presencia de individuos asintomaticos con frecuencias altas de infecciones por P vivax y bajas por P falciparum. Condiciones similares han sido encontradas en Venezuela (29), indicando infecciones asintomaticas de 34,8% para P vivax y 15,2% para P falciparum. Otros estudios realizados en la Amazonia brasilena (8), donde existen bajos indices de transmision tanto en P. vivax como en P. falciparum, indican un numero alto de individuos asintomaticos no detectados.

El nested PCR tambien puede ser utilizado para realizar pruebas de genotipificacion. En el presente estudio se detecto dos secuencias alelicas diferentes, una de 1900 pb (alelo A) y de 1500 pb (alelo B). Adicionalmente, investigaciones realizadas en Papua Nueva Guinea (21,26) informan sobre un tercer alelo de 1100 pb (alelo C); incluso estudios en la India (Chennai) (22), mencionan un cuarto alelo de 500 pb (alelo D). En todas estas investigaciones, la frecuencia del alelo A es mayor que la del alelo B, resultados similares a los encontrados en este estudio. Contrariamente, en regiones como Venezuela (30), se indica un 9,3% para el alelo A y 21,9% para el alelo B. Incluso contrastando con la mayoria de investigaciones de esta parte del mundo, un estudio realizado en el Sur de Iran (31) encuentra al alelo C como el mas frecuente. Estos resultados nos muestran que existe una gran variabilidad genetica de las poblaciones de P vivax circulando en diferentes regiones geograficas; ademas, se observa un predominio de determinado tipo alelico, por determinada region.

Los metodos de nested PCR y digestion enzimatica efectuados en Mazan permitieron identificar hasta 10 haplotipos monoclonales con la enzima Hha I y 7 con Alu I; algunos de estos haplotipos, seis con Hha I y tres con Alu I, ya han sido publicados en Tailandia (14), Papua Nueva Guinea (21), India (22) e Iran (31), igual que en Peru (19), donde identificaron ocho y nueve patrones, respectivamente. Lo que sugiere que algunas de estas variantes alelicas tienen una distribucion geografica global. Tambien, en Mazan se identifico tres haplotipos policlonales o mixtos con la enzima Hha I y 1 con la enzima Alu I, representando el 9,4% de todas las infecciones. Estos valores fueron menores a los encontrados en paises como Tailandia (14) con 19,3%, Papua Nueva Guinea (21,26) con 23% y en Brasil (20) donde encontraron 14% de infecciones mixtas analizadas solo con la enzima Hha I. Incluso en otras localidades de la Amazonia peruana se registro 26,3% de infecciones mixtas por P vivax, contrastando con este estudio, lo cual demuestra que en zonas como Mazan no hay una coinfeccion claramente establecida; sin embargo, la alta variabilidad genetica determinada por los valores del PLD (cercano a la unidad) si son bastante similares en estas regiones geograficas de la Amazonia peruana (23).

En las regiones endemicas, las recurrencias de malaria son bastante frecuentes, principalmente por las reinfecciones y por los relapsos propios de P. vivax. En el presente estudio, los metodos moleculares utilizados permitieron encontrar 41,7% de relapsos y 48,9% de reinfecciones. Frecuencias similares fueron halladas en estudios de genotipificacion de la Amazonia brasilena (8), donde los rangos de recurrencias con haplotipos similares se encuentran entre 26% y 40%, con un intervalo de tiempo de 0 a 180 dias postratamiento. Frecuencias mas altas son informadas en soldados australianos (32), donde 99% de las recurrencias lo asociaron a un solo tipo alelico, con un intervalo de tiempo entre 29 y 343 dias, el mismo periodo de tiempo utilizado en el presente estudio.

La importancia de realizar un diagnostico preciso es determinar la especie de Plasmodium causante de la enfermedad. Del mismo modo, es necesario establecer la recurrencia de la infeccion, a fin de que el paciente reciba el tratamiento adecuado. Ademas, la variabilidad genetica de P. vivax influye significativamente en el flujo de genes que pueden conferir resistencia a drogas, como la cloroquina. Esta resistencia ocasionada por la diversidad genetica de P vivax tiende a variar segun el area geografica y el vector. Estos conocimientos dirigidos a comprender la biologia y diversidad genetica son de utilidad para el tratamiento y diseno de vacunas efectivas, las cuales pueden ser dirigidas a una o varias fases especificas del parasito.

En conclusion, se estima una alta variabilidad genetica de P. vivax circulante en regiones endemicas como Mazan-Iquitos, y los patrones de recurrencia, basados en la genotipificacion, indican diferencias entre reinfecciones y relapsos, con una alta proporcion de individuos infectados pero asintomaticos. Como recomendacion se debe considerar necesario realizar estudios con un seguimiento mas exhaustivo y detallado de los pacientes, asi como con un mayor numero de muestras junto con la utilizacion de otros marcadores y tecnicas moleculares especializadas. El secuenciamiento y PCR en tiempo real podrian dar mas luces sobre los resultados encontrados y ayudar a comprender mejor la dinamica de transmision y la diversidad genetica. Este estudio permitio conocer las frecuencias reales de la infeccion asintomatica y los patrones de recurrencia. Esta informacion puede ser utilizada para establecer medidas que ayuden a las poblaciones asintomaticas a mejorar las condiciones de salud con un tratamiento eficaz, asi como adecuados controles vectoriales que eviten las constantes recurrencias de la enfermedad.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos al Dr. R. Gilman, J. Vinetz y M. Kosek (Investigadores principales del proyecto Malaria en la UPCH); tambien, al Dr. C. Naquira, por su aporte en la revision de la redaccion del presente articulo.

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Articulo recibido el 30 de mayo de 2012 y aceptado para publicacion el 26 de setiembre de 2012.

Financiado por: Asociacion Benefica PRISMA y Universidad Peruana Cayetano Heredia.

Correspondencia:

Edward Valencia Ayala

Laboratorio de investigacion en enfermedades infecciosas UD

Universidad Peruana Cayetano Heredia

Av. Honorio Delgado No. 430 Lima, Peru

Movil: 954 668 623

Correo electronico: Edu_5_7@hotmail.com

Edward Valencia Ayala [1,a], Maritza Calderon Sanchez [1,b], Manuel Martin Fasabl Espinar [1,c]

[1] Laboratorio de Investigacion en enfermedades infecciosas LID, Universidad Peruana Cayetano Heredia.

[a] Biologo, Maestro en Biologia Molecular.

[b] Biologo, Doctor en Ciencias Biologicas.

[c] Biologo, Maestro en Bioquimica y Biologia Molecular.
Tabla 1. Genotipificacion en individuos con infeccion
recurrente por Plasmodium vivax.

                        Segunda evaluacion
                               n (%)

Primera evaluacion           A           B
      n (%)

A         172 (95,5)    166 (92,2)    6 (3,3)
B           8 (4,5)       5 (2,8)     3 (1,7)
n total   180 (100,0)   180 (100,0)

Los alelos fueron determinados mediante nested-PCR.
El alelo A=1900 pb y el alelo B=1500 pb.

Tabla 2. Analisis de los patrones de recurrencia segun rango de
tiempo: 0 a 365 dias luego de la primera evaluacion. Existe una
relacion altamente significativa (p<0,01 segun prueba
[chi square]), entre los patrones de recurrencia y el rango de
tiempo de presentacion, destacandose el relapso en los primeros
90 dias y la reinfeccion entre los 270 y 365 dias despues de la
primera evaluacion.

                  Dias luego de la primera evaluacion
                                 n (%)

Patrones de     0-90       90-180      180-270     270-365
recurrencia

Relapso       36 (20,0)   25 (13,9)   10 (5,6)     4 (2,2)

Reinfeccion   21 (11,7)   19 (10,5)   21 (11,7)   27 (15,0)
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Author:Ayala, Edward Valencia; Calderon Sanchez, Maritza; Fasabi Espinar, Manuel Martin
Publication:Anales de la facultad de medicina
Date:Dec 22, 2012
Words:6109
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