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VEGF-A and VEGFR2 Expression in Chicken Myocardium Treated with Acetylsalicylic Acid (AAS)/ Expresion de VEGF-A y VEGFR2 en Miocardio de Pollos Tratados con Acido Acetilsalicilico (AAS).

INTRODUCCION

La angiogenesis corresponde al proceso por el cual se desarrollan nuevos vasos sanguineos a partir de otros preexistentes. Este fenomeno se presenta normalmente durante el desarrollo embrionario, en el crecimiento del organismo, en la fase proliferativa del ciclo menstrual y durante la formacion de la placenta; ademas en procesos de cicatrizacion de las heridas y regeneracion de organos.

Segun Hoeben et al. (2004) la angiogenesis se encuentra sujeta a un complejo sistema de control fisiologico conocido como "balance angiogenico", en el que participan factores proangiogenicos y antiangiogenicos. Entre los factores proangiogenicos se encuentran los factores de crecimiento vascular endotelial (VEGF), los que a traves de la union a su receptor (VEGFR) modulan la angiogenesis e incrementan la permeabilidad microvascular. Dentro de la familia de los VEGF, el VEGF-A se une a VEGFR1 y a VEGFR2, dos receptores con actividad tirosina kinasa, expresados por las celulas endoteliales de la pared vascular. Molin & Post (2007) reportaron que VEGF-A promueve la angiogenesis a traves de su union a VEGFR2, iniciando una cascada de senales que estimulan el crecimiento, la supervivencia y la proliferacion de las celulas del endotelio vascular.

La interaccion de VEGF-A con sus receptores es esencial para establecer un sistema vascular funcional durante la embriogenesis y al comienzo del desarrollo postnatal e incluso en procesos patologicos como cancer. Aun cuando este proceso tiene una actividad fisiologica limitada en los adultos, se activa y tiene un rol relevante cuando hay procesos de reparacion tisular. Dado esto, es interesante caracterizar agentes que participan en la modulacion de este proceso de angiogenesis.

El Acido Acetilsalicilico (AAS) ha sido ampliamente prescrito como antiagregante plaquetario, antipiretico y antiinflamatorio. Adicional a estos efectos, Khan & Mehta (2005) demostraron que AAS tiene efectos antiangiogenicos. Si bien es cierto que es conocida la accion inhibitoria de AAS sobre las enzimas cicloxigenasas 1 y 2 (COX-1 y COX2), impidiendo asi la sintesis de prostaglandinas a partir del acido araquidonico, el mecanismo por el cual inhibe la angiogenesis no esta totalmente estudiado. Meek etal. (2010) reportaron que el efecto inhibidor de AAS sobre COX-1 y COX-2 esta mediado por acetilacion de un residuo de serina en el sitio activo. Complementando esta evidencia, la acetilacion de COX-2 conduce a la formacion de lipoxinas, potentes inhibidores de la angiogenesis, como lo describe Fierro (2005). Bolli etal. (2002) aportaron evidencias de que COX-2 posee un rol cardioprotector, observando que inhibidores especificos de esta isoenzima aumentan el riesgo de sufrir accidentes cardiovasculares. Wu etal. (2006) demostraron que COX-2 juega un papel importante en la angiogenesis inducida por VEGF a traves de p38 y las vias de activacion de la quinasa JNK, sugiriendo que el papel cardioprotector de la COX-2 puede ser, al menos en parte, a traves de su actividad angiogenica.

Segun Tegeder etal. (2001), el AAS al hidrolizarse en medio acuoso o al ser metabolizado por esterasas genera acido acetico y acido salicilico (AS). Este ultimo tambien tiene efecto antiangiogenico pero su mecanismo de accion parece tener diferencias con el de AAS ya que no inhibe a COX.

Resultados concluyentes de la accion de AAS sobre la angiogenesis han sido demostrados por muchos investigadores en modelos tumorales como lo indican Zhang et al. (2013); sin embargo, a la fecha no se han descrito efectos antiangiogenicos en el miocardio sano. En el presente trabajo nos propusimos estudiar el posible efecto inhibidor de AAS sobre la expresion de VEGF-A y su receptor en cardiomiocito de pollo durante el desarrollo fetal, con el objeto de comprender el mecanismo por el cual AAS interfiere en la formacion de vasos sanguineos.

MATERIAL Y METODO

Aplicacion de AAS y AS. Se utilizaron 30 huevos de pollo de raza White Leghorn embrionados, incubados con aire humedecido en una camara a 37[degrees]C, para analizar la capacidad angiogenica, de acuerdo a lo descrito previamente por Cordova et al. (2016). Brevemente, a las 48 horas de incubacion se perforo cada huevo y se extrajo aproximadamente 2 mL de albumina con ayuda de una pipeta Pasteur. Se desinfecto la zona con una solucion de alcohol yodado y se tapo con cinta adhesiva. Luego se abrio a nivel dorsal una ventana de 2,5 cm de ancho por 2 cm de alto. Todo este proceso se hizo de manera esteril.

Se distribuyeron los huevos de manera aleatoria en tres grupos de 10 unidades cada uno. A los 8 dias de incubacion, se implanto en la membrana alantocorionica (MAC) de cada uno, un filtro de metilcelulosa impregnado con farmacos disueltos en 60 [micro]L de DMSO 0,1 %.

A las 48 horas post-aplicacion de la solucion a estudiar, se realizo una toracotomia para extraer el corazon de los fetos de pollo, previa diseccion de los vasos sanguineos que se comunican con este organo. Paralelamente, se extrajo trozos de MAC de cada huevo. Las muestras obtenidas fueron fijadas en formalina tamponada pH 7,0 al 10 % por 7 dias. Luego se realizo el procesamiento histologico necesario para obtener cortes de 5 mm de espesor.

Este procedimiento se llevo a cabo de acuerdo a lo descrito en el protocolo de bioetica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile.

Cuantificacion de la densidad micro vascular en la MAC.

Se contaron los vasos sanguineos de cada membrana, mediante un microscopio optico de acuerdo a lo descrito previamente Cordova et al. Del total de 10 membranas obtenidas por cada grupo, se analizaron 50 campos con un aumento de 400x (4 a 6 campos por membrana). El microscopio tiene incorporada una rejilla de 90.000 [micro][m.sup.2], dividida en 100 secciones. Se analizaron 10 de estas secciones, lo que corresponde a 9000 [micro][m.sup.2] por cada campo. Dos examinadores realizaron recuento ciego, sin conocer el grupo al que pertenecia cada MAC. Los resultados se expresan como N[degrees] de vasos sanguineos/9000 [micro][m.sup.2].

Cuantificacion de VEGF-A y de VEGFR2. Cortes seriados de miocardio de fetos de pollo, 5 cortes por cada corazon, previamente desparafinados e hidratados, fueron recuperados antigenicamente por incubacion por 30 minutos en solucion Dako Target Retrieval[R]. Luego fueron tratados con Peroxido de Hidrogeno al 3 % en Metanol por 10 minutos. Los cortes fueron incubados toda la noche a 4[degrees]C con Anticuerpo anti VEGF-A (1:200) o con Anticuerpo anti VEGFR2 (1:200). Finalmente, fueron revelados usando el kit Histostain-Plus IHC Kit, HRP, Broad Spectrum[R] (Invitrogen, Camarillo, CA, USA). Los 5 cortes de cada corazon fueron visualizados a 400x en un microscopio optico equipado con camara Moticam 5000 y se cuantifico la immunoreactividad en 50 imagenes por cada grupo experimental, mediante el programa Image-J (NIH, USA), segun condiciones descritas previamente por Fernandez et al. (2014). El recuento de cada dato-imagen fue normalizado, calculando el nivel de expresion en cada imagen con respecto al promedio obtenido en las imagenes del grupo control.

Analisis estadistico. Los resultados se expresaron como promedio [+ or -] error estandar. La comparacion entre grupos experimentales se realizo por analisis de varianza (ANOVA), con prueba de Tukey mediante el software Graph Pad Prism 5. Se considero diferencia significativa para valores de p<0,05.

RESULTADOS

Cuantificacion de la densidad micro vascular en MAC. La cantidad de vasos sanguineos en membrana alantocorionica fue diferente segun el tratamiento recibido (Fig. 1a). Tanto en el grupo tratado con AS como en el tratado con AAS, la cantidad de vasos sanguineos en 9000 [micro][m.sup.2] fue menor que en el grupo control (p= 0,0130 y p<0,0001, respectivamente) (Fig. 1b). Comparando el efecto de ambos tratamientos, el de AAS fue mayor que el de AS (p=0,0052).

Cuantificacion de la expresion de VEGF-A. La expresion de VEGF-A en el miocardio de fetos de pollo bajo el trata miento con AS y AAS, se muestra en la Figura 2. Se observa de manera homogenea la expresion de VEGF-A en los cardiomiocitos, a nivel citoplasmatico (Fig. 2a). Para el grupo control, el nivel de expresion normalizada fue 0,997[+ or -]0,082. No encontramos efecto de ninguno de los tratamientos, al compararlos con el grupo control. En el grupo tratado con AS, se obtuvo un nivel de expresion de 1,150[+ or -]0,052 y en el grupo tratado con AAS, 0,921 [+ or -]0,053. Al comparar los dos tratamientos observamos que los cortes de miocardio de fetos tratados con AAS expresan menos VEGF-A que los de los tratados con AS (p=0,001) (Fig. 2b).

Cuantificacion de la expresion de VEGFR2. El efecto del tratamiento con AS y AAS sobre los fetos de pollo en la expresion de VEGFR2 se muestra en la Figura 3. El patron de expresion de VEGFR2 es homogeneo en el grupo control, mientras que en los grupos tratados con AS y AAS se observa una inmunoreactividad concentrada en ciertos grupos celulares (Fig. 3a). El valor normalizado para el grupo control fue de 1,003[+ or -]0,098. En el grupo tratado con AS, se obtuvo un nivel de expresion de 0,853[+ or -]0,060 y en el grupo tratado con AAS, 0,752[+ or -]0,070. Dado esto, el tratamiento con AAS disminuyo la expresion de VEGFR2, (p=0,0204) mientras que el AS no tuvo efecto (Fig. 3b).

DISCUSION

Propusimos que AAS disminuye la expresion de VEGF-A y de su receptor (VEGFR2), como un posible mecanismo por el cual ejerce su efecto antiangiogenico. Tanto AAS como AS mostraron tener un efecto inhibitorio sobre la angiogenesis, observado por la disminucion de la densidad microvascular en la MAC de pollo. Adicionalmente, el AAS disminuyo la expresion de VEGFR2 en el miocardio de estos fetos, aunque no tuvo efecto sobre la expresion de su ligando, VEGF-A. Estos resultados sientan las bases para postular que la modulacion de la expresion de VEGFR2 forma parte del mecanismo de accion del AAS sobre la inhibicion de la angiogenesis.

La aplicacion de 0,3 |mmol de AAS disminuyo la densidad microvascular en ensayo de MAC. Este efecto antiangiogenico de AAS esta de acuerdo a lo reportado por nuestro grupo previamente por Cordova et al. y otros investigadores; Khan & Mehta muestran que AAS disminuye la proliferacion de celulas endoteliales, evento critico para la angiogenesis. ATL-1, analogo sintetico de lipoxina A4, inhibe la adhesion de las celulas endoteliales, la actividad de las metaloproteinasas de matriz in vitro y ademas, la densidad vascular estudiada in vivo en un modelo murino de burbuja de aire subcutanea (air pouch) granulomatoso cronico, segun lo descrito por Cezar-deMello et al. (2008) y Fierro et al. (2002). Por otra parte, Salvado et al. (2013) reportaron que AAS, al inhibir la sintesis de PGE2, inhibe la angiogenesis inducida por catelicidina LL-37, en celulas endoteliales humanas tanto in vitro como in vivo. Recientemente, Dai et al. (2017) observaron que AAS disminuye la angiogenesis tanto en embriones de pollo como en modelos tumorales y que este efecto es mediado por inhibicion de la actividad enzimatica de heparanasa. Esta enzima degrada al proteoglicano de cadenas de heparansulfato permitiendo una mayor disponibilidad de VEGF en el microambiente celular. Interesantemente, encontraron que AS y AAS inhiben a esta enzima en concentraciones similares. En su conjunto, estos hallazgos presentan evidencias de que AAS ejerce un efecto antiangiogenico al menos a traves de dos mecanismos, uno de ellos independiente de COX.

No encontramos disminucion de la expresion de VEGF-A en los cardiomiocitos de fetos de pollo como respuesta al tratamiento de 0,3 |mmol de AAS. Este resultado se suma a reportes contradictorios en relacion a la inhibicion de la expresion y actividad de VEGF mediada por este farmaco. AAS disminuye la expresion de VEGF-A en modelos de sarcoma segun lo reportado por Zhang et al. y tambien en hepatocarcinoma murino de acuerdo a lo descrito por Zhao et al. (2016). Sin embargo, Dai et al. muestran que AAS disminuye la liberacion de VEGF solo en algunas de las lineas tumorales que estudiaron. Mas aun, Escribano et al. (2004) no observaron cambio en la concentracion de VEGF en tejido colonico despues de administracion de AAS 10 mg/kg por 7 semanas.

La aplicacion de 0,3 |mmol de AAS disminuyo la expresion de VEGFR2. Escribano et al. observaron que el tratamiento con AAS 10 mg/kg disminuye la expresion de VEGFR2. Sin duda, la disminucion de la presencia de VEGFR2 debida a la accion de AAS aun en las dosis usadas en nuestro trabajo, permite postular que AAS ejerce un efecto antiangiogenico a traves de una menor disponibilidad del receptor aun cuando no modifique los niveles del ligando. Esta evidencia apoya la idea de que AAS ejerce su rol antiangiogenico alterando mas de un factor involucrado.

La aplicacion de 0,3 |mmol de AS disminuye la densidad vascular en el ensayo de MAC de pollo, lo que concuerda con lo descrito previamente por nuestro grupo y otros investigadores. Borthwick et al. (2006), trabajando con cultivos de linea de celulas inmortalizadas, comprobaron que AS reduce la viabilidad celular y promueve la apoptosis de celulas endoteliales, ademas de reducir la ramificacion de las formaciones tubulares. En nuestro estudio, AAS y AS tuvieron efecto similar sobre la densidad vascular y la concentracion de VEGF; sin embargo, a diferencia de la accion inhibitoria de AAS en los niveles de VEGFR2, AS no tuvo efecto. Estos resultados nos permiten postular que AS podria ejercer su efecto antiangiogenico por una via independiente de VEGFR2.

La administracion de AAS post infarto al miocardio (IM) es el tratamiento convencional para prevenir la agregacion plaquetaria. Nuestros resultados apuntan a que se estaria generando una contradiccion fundamental al utilizar el AAS como antiagregante plaquetario, porque a su vez tiene un efecto antiangiogenico, dificultando la reperfusion adecuada del tejido infartado. Esta idea se ve reafirmada por Chung et al. (2002) y Gerrah et al. (2004).

Por lo tanto, es necesario explorar alternativas terapeuticas que eviten la agregacion plaquetaria luego de ocurrido un infarto, sin afectar el proceso de angiogenesis como lo reportan Smadja et al. (2012), que es tan necesario en este proceso. En conclusion, AAS disminuye los niveles de VEGFR2 en miocardio y la densidad microvascular en MAC de pollo. Estos resultados aportan al conocimiento del efecto antiangiogenico que posee el AAS en dosis farmacologicas, lo que podria tener implicancia en el tratamiento inicial post infarto.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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Direccion para correspondencia:

Dr. Carlos Rosas C.

Departamento de Ciencias Morfologicas

Fac. de Medicina y Ciencia

Universidad San Sebastian

Lota 2465

Santiago

CHILE

Email: carlos.rosas@uss.cl

Recibido : 23-07-2018

Aceptado : 16-10-2018

Francisco Sepulveda (1); Eduardo Saavedra (1); Rodrigo Sanchez (1); Sebastian Cordova (1); David Lemus (1); Marcela Fuenzalida (1); Marcela Vergara (2) & Carlos Rosas (2)

(1) Laboratorio de Embriologia Experimental y Molecular, ICBM, Fac. de Medicina, Universidad de Chile, Santiago, Chile.

(2) Facultad de Medicina y Ciencia, Universidad San Sebastian, Santiago, Chile.

Caption: Fig. 1. Cuantificacion de densidad microvascular en MAC. Datos expresados como numero de vasos en 9000 [micro][m.sup.2] (*:p=0.0130, **:p=0.0052, ***:p<0,0001). La barra negra indica una distancia de 100 mm

Caption: Fig. 2. Expresion de VEGF-A en miocardio de pollo.

Caption: Fig. 3. Expresion de VEGFR2 en miocardio de pollo
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Author:Sepulveda, Francisco; Saavedra, Eduardo; Sanchez, Rodrigo; Cordova, Sebastian; Lemus, David; Fuenzal
Publication:International Journal of Morphology
Date:Mar 1, 2019
Words:3215
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