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Uso de vectores derivados de virus ademoasoeiados para el tratamiento de la enfermedad de Morquio A.

Adenoassotiated virus-derived vectors for the treatment of Morquio A disease

Introduccion

La mucopolisacaridosis IV A (MPS 1 VA, enfermedad de Morquio A, OMIM #253000) es una enfermedad de deposito lisosomal de tipo autosomica recesiva, producida por la deficiencia de la enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatasa (GALNS, EC 3.1.6.4), la cual hidroliza el grupo 6-sulfato de las unidades N-acetilgalactosamina-6-sulfato del condroitin 6 sulfato (CC6S) y de las unidades D-galactosa-6-sulfato del queratan sulfato [1, 2].

La mucopolisacaridosis IV A es una enfermedad rara, con una incidencia promedio de 1:250.000 (www.morquio.com, [3]). A pesar de que no se dispone de informacion sobre su incidencia en Colombia, se ha documentado el hallazgo de esculturas precolombinas con claros rasgos de individuos afectados con la mucopolisacaridosis IV A[4] y, en la experiencia del Instituto de Errores Innatos del Metabolismo, es la mas diagnosticada hasta el momento en el pais [5, 6].

La mucopolisacaridosis IV A es una enfermedad caracterizada por la acumulacion lisosomal de los glucosaminoglicanos queratan sulfato y condroitin 6 sulfato, principalmente en hueso y cornea [3]. El fenotipo de la enfermedad varia desde una forma grave, caracterizada por una importante displasia esqueletica, estatura corta, facies tosca, hipoplasia de la odontoides, peetus carinatum, cifoescoliosis, genu valgum, laxitud de articulaciones, perdida del oido, opacidad corneal, enfermedad de valvulas cardiacas y hepatoesplenomegalia leve, hasta formas medias o atenuadas, con menor compromiso oseo. Sin embargo, a diferencia de otras mucopolisacaridosis los pacientes con la MPS IV A no presentan compromiso de la esfera mental [7, 8, 2, 3].

En la actualidad, no se dispone de una terapia efectiva para el tratamiento de mucopolisacaridosis IV A y solo se han empleado medidas paliativas e intervenciones quirurgicas para tratar algunas manifestaciones [3]. Aunque el trasplante de medula osea ha probado tener un gran impacto en las manifestaciones somaticas en diferentes mucopolisacaridosis, tiene un efecto limitado sobre las anormalidades cardiacas, visuales y esqueleticas [9, 10]. La terapia de remplazo enzimatico para la mucopolisacaridosis IV A se encuentra en fase preclinica, con resultados prometedores en el modelo murino de la enfermedad [11]. Sin embargo, los pacientes requeririan infusiones intravenosas semanales de la enzima recombinante, con costos anuales por paciente que superan los US$ 300.000 y con posibles complicaciones inmunologicas debidas a la administracion de grandes cantidades de enzima [12].

La terapia genica es una alternativa para el tratamiento de las enfermedades de deposito lisosomal, por las siguientes razones:

(a) no se requiere una estricta regulacion de la expresion del gen [13];

(b) los niveles cercanos al 10% de los valores normales permiten pasar de un fenotipo grave a uno atenuado o intermedio [14];

(c) es posible la correccion de celulas no transfectadas mediante el mecanismo de correccion cruzada por captura de la enzima por los receptores de manosa-6-fosfato [15, 16];

(d) los ensayos preclinicos en diferentes modelos animales (raton, rata, perro y gato) han permitido niveles enzimaticos terapeuticos hasta por 1,5 anos en raton y 7 anos en perros, con importantes correcciones bioquimicas y clinicas, tras una unica administracion [17-20], y

(e) en las enfermedades producidas por la deficiencia de una sulfatasa (como MPS II, MPS III A, MPS III D, MPS IV A y MPS VI), la coexpresion con el factor activador de sulfatasas (SUMF1), involucrado en la activacion del sitio activo de todas las sulfatasas, ha permitido incrementos entre 2 y 3 veces en los valores de actividad de diferentes sulfatasas recombinantes, con un notable efecto en la distribucion de la enzima [21], la proporcion de la enzima secretada y las manifestaciones bioquimicas y clinicas de la enfermedad [22, 23].

Entre los diferentes vectores virales y no virales empleados en terapia genica para enfermedades de deposito lisosomal, los vectores derivados de virus adenoasociados (AAV) han mostrado importantes beneficios clinicos y expresiones prolongadas en modelos animales de la enfermedad de Gaucher, la enfermedad de Fabry, la enfermedad de Pompe, la leucodistrofia metacromatica, la enfermedad de Memann-Pick A y las mucopolisacaridosis I, II, III A, III B, IV y VII (revisado en [24, 25].

Los vectores virales adenoasociados son virus no patogenos con un ADN lineal de cadena sencilla de 4,7 kb, el cual requiere de la presencia de un virus ayudador, tipo adenovirus o herpes simplex, para su replicacion [26]. La administracion intravenosa de vectores AAV en modelos animales de enfermedades de deposito lisosomal, ha llevado a incrementos en la actividad enzimatica de hasta 16 veces los valores normales en sangre, higado, bazo, rinon y musculo, con reduccion de las acumulaciones de glucosaminoglicanos y restauracion de la arquitectura del tejido [27, 19, 28, 16]. Para la mucopolisacaridosis IV A no se han publicado experimentos de terapia genica in vivo y solo existe el reporte de la transfeccion de diferentes lineas celulares empleando vectores retrovirales, con los que se logro un incremento en la actividad enzimatica entre 5 y 50 veces los valores normales [29].

En el presente trabajo se evaluo el perfil de expresion del vector AAV-GALNS, el cual porta el gen humano de la GALNS bajo el control del intensificador temprano y promotor del citomegalovirus (CMV), en celulas HEK293 y en fibroblastos de humanos y condrocitos de raton, ambos con mucopolisacaridosis IV A. Ademas, se evaluo el efecto de la coexpresion con el gen SUMF1, mediante la coadministracion de AAV-GALNS con el vector AAV-SUMF1. Estos resultados muestran el potencial de los vectores AAV y de la coexpresion con SUMF1, para la correccion del defecto en la mucopolisacaridosis IV A.

Materiales y metodos

Construccion de losplasmidos. El plasmido pAAV-CMV-GALNS, previamente construido [30], porta el ADNc de la GALNS humana bajo el control del intensificador temprano y el promotor del citomegalovirus, un intron sintetico, la senal de entrada al ribosoma IRES, que permite la transduccion de dos secuencias en un mismo ARNm, el gen de resistencia a neomicina y la senal de poliadenilacion de la hormona de crecimiento bovina, flanqueados por los ITR del serotipo AAV2. El plasmido pAAV-CMV-SUUMF1 se construyo remplazando el ADNc de GALXS en pAAV-CMV-GALNS, por el fragmento EcoRI de 1,2 kb, correspondiente al gen de SUMF1 humano, obtenido mediante digestion del plasmido pCXN-SUUMF1. Todos los procedimientos moleculares se llevaron a cabo empleando protocolos estandar [31].

Produccion de los vectores. Las particulas virales recombinantes de virus adenoasociados se produjeron por el metodo de triple transfeccion libre de adenovirus, desarrollado por Xiao et al. [32]. En este metodo, las celulas HEK293 son cotransfectadas con: (a) el plasmido que porta el gen de interes flanqueado por los ITR (pAAV-CMV-GALNS o pAAV CMV-SUMF1), (b) el plasmido de empaquetamiento pXX2, el cual porta las secuencias de los genes Rep y Cap de AAV2, y (c) el plasmido ayudador pXX6-80 que porta las secuencias adenovirales necesarias para la replicacion y el empaquetamiento del genoma viral.

Las celulas HEK293 se cultivaron en medio esencial minimo de Eagles MEM (Gibco), con suplemento de penicilina-estreptomicina (Gibco) 100 [micron]g/ml-100 [micron]g/ml, glutamina (GIBCO) 2 mM y suero bovino fetal (SFB Invitrogen) al 15%, en una atmosfera al 5% de C[O.sub.2] a 37[grados]C. Cuarenta y ocho horas antes de la transfeccion, se sembraron 1 x [10.sup.6] celulas en placas cultivo de 10 cm con 15 ml de medio crecimiento sin antibioticos. Las celulas se incubaron durante 48 horas a 37[grados]C y 5% de C[O.sub.2], tiempo en el que se debe lograr una confluencia entre 80% y 90%.

Dos horas antes de la transfeccion, el medio de cultivo se cambio por 15 ml de medio de crecimiento fresco, libre de antibioticos y suero fetal bovino. La transfeccion se realizo empleando la mezcla de liposomas cationicos Lipofectamine 2000[R] (Invitrogen), de la siguiente manera: en un tubo esteril de 15 ml se mezclaron los plasmidos pAAV-CMVGALNS o pAAV-CMV-SUUMF1 con los plasmidos pXX2 y pXX6-80, en una relacion molar 1:1:1 que corresponde a una relacion 5:5:15 en terminos de [micron]g de ADN, para un total de 25 [micron]g de ADN por cada caja de cultivo. Todos los ADN de los plasmidos utilizados se purificaron empleando el kit QUIAEX-Maxi-prep (QIAGEN), segun las instrucciones del fabricante. Como control de cotransfeccion, produccion y transfeccion, se produjeron particulas virales nativas, mediante cotransfeccion con el plasmido pSUB201, el cual contiene el genoma del virus adenoasociado serotipo 2.

La mezcla de ADN del plasmido (25 ig) se diluyo en 1,5 ml de medio de cultivo libre de suero Opti-MEM[R]I (Invitrogen) y se mezclo suavemente. En otro tubo, se diluyeron 60 il de Lipofectamine 2000[R] con 1,5 ml de Opti-MEM[R]I. La mezscla se agito suavemente y se incubo a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, se mezclaron las dos soluciones y se incubaron por 20 minutos a temperatura ambiente, para permitir que los liposomas incorporaran el ADN. Pasados los 20 minutos, la solucion ADN-Lipofectamine 2000[R] se adicio no a los cultivos de celulas HEK293, mezclando suavemente por rotacion para permitir que los complejos se distribuyeran uniformemente en la caja de cultivo. Las celulas transfectadas se incubaron en una atmosfera de 5% de C[O.sub.2] a 37[grados]C. Doce horas despues de la transfeccion, el medio se remplazo con medio de crecimiento MEM fresco y se continuo con la incubacion en las mismas condiciones descritas durante 48 horas, momento en el que las celulas se tripsinizaron y resuspendieron en 15 ml de buffer de lisis (0,15 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,5). Las celulas se lisaron mediante tres ciclos de congelacion y descongelacion, alternando los tubos entre un bano de hielo seco con etanol y un bano serologico a 37[grados]C. Finalmente, la suspension se centrifugo a 3.700 g durante 20 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante represento la solucion viral primaria, la cual se almaceno a -80[grados]C para su posterior purificacion y cuantificacion.

Purificacion y cuantificacion de los vectores recombinates AAV. Las particulas virales se purificaron empleando el metodo desarrollado por Zolotukhin et al. [33]. Este metodo emplea un gradiente discontinuo no ionico de iodixanol (OptiPrep-Sigma) y posterior ultrafiltracion por una membrana de 100 kDa para concentrar la muestra y remover el iodixanol.

El gradiente se construyo de la siguiente manera: en tubos Ultra-Clear de 25x89 mm (Beckman), se adicionaron lentamente 9 ml de iodixanol al 157 y NaCl 1M en solucion tampon PBS-MK ([Na.sub.2]HP[O.sub.4] 1,09 g, Na[H.sub.2]P[O.sup.4] 0,32 g, NaCl 9 g por litro a pH 7,2, Mg[Cl.sub.2] 1 mM, KCl 2,5 mM), 6 ml de iodixanol al 25% en PBS-MK con rojo fenol (15 [micron]l de una solucion al 0,57), 5 ml de iodixanol al 40% en PBS-MK y 5 ml de iodixanol al 60% (Optiprep, es una solucion acuosa esteril de iodixanol al 60%). Finalmente, se agregaron lentamente 15 ml de la solucion viral primaria clarificada. El gradiente se centrifugo a 25.000 rpm durante 16 horas a 18[grados]C. Trascurrido este tiempo, se tomaron, aproximadamente, 2,5 ml de la fase del 60% y 2,5 m de la fase del 40%, mediante puncion del tubo con una aguja calibre 23G.

La fraccion de iodixanol se concentro mediante ultrafiltracion por membrana de 100 kDa. Para tal fin, 2 ml de muestra fueron cargados en un Centricon[R] 100K (Millipore) y centrifugados a 1.000 g por 30 minutos y 4[grados]C, y se descarto la fraccion que pasaba a traves de la membrana. Este paso se repitio hasta que la totalidad de la muestra (aproximadamente, 5 ml) fue centrifugada. Finalmente, se hicieron dos lavados con 2 ml de NaCl 0,9% para remover el iodixanol, el cual interfiere con el proceso de cuantificacion.

Las soluciones virales se cuantificaron por el metodo espectrofotometrico desarrollado por Sommer et al. (34). Este metodo se basa en la medicion de absorbancia a 260 y 280 nm de una solucion viral purificada. El calculo de los genomas virales por ml (vg/ml) tiene en cuenta, tanto los coeficientes de extincion de las proteinas de la capside del serotipo AAV2 (VP1, VP2 y VP3), como el del ADN viral, que depende del peso molecular del genoma del vector. Este metodo permite la cuantificacion rapida, economica y reproducible de soluciones virales purificadas, con una correlacion de 98% con otros metodos de cuantificacion, como ELISA y dot-blot (34). Para la cuantificacion, se incubaron 100 [micron]l de la solucion viral purificada por 10 minutos a 75[grados]C con 0,5 [micron]l de SDS al 20%, y se midio la absorbancia de la muestra a 260 y 280 nm. (Como blanco se empleo una solucion de NaCCl al 0,9%, la cual fue tratada de igual forma que las muestras.

La concentracion de genomas virales (gv/ml) se calculo empleando la ecuacion 1:

gv/ml = 4,47 x [10.sup.19] ([A.sub.260]-0,59 [A.sub.280])/[MW.sub.DNA] - (1)

donde, [MW.sub.ADN] corresponde al peso molecular de la secuencia flanqueada por los ITR para cada vector, basado en el peso molecular de cada nucleotido: A = 312,2 Da, (= 288,2 Da, G = 328,2 Da y T = 303,2 Da. Igualmente, el calculo de la relacion de capsides por genoma viral (cp/gv) se calculo con la ecuacion 2:

cp/gv = [MW.sub.DNA] x 1,76 x [10.sup.-6] (1,80 - [A.sub.260] [A.sub.280])/[A.sub.260]/[A.sub.280]-0,59 (2)

La relacion cp/gv es igual a 1, cuando el 100% de las particulas contienen ADN y es >50 cuando solo hay presentes particulas virales vacias.

Transfeccion de celulas HEK293.

Veinticuatro horas antes de la transfeccion, se sembraron 1 x [10.sup.5] celulas HEK293 por pozo en placas de 24 pozos, cultivadas en 1 ml de medio esencial minimo de Eagle DMEM con suplemento de SFB al 15% y antibioticos a 37[grados]C y 5% de C[O.sub.2] El medio de cultivo se cambio 2 horas antes de la transfeccion por medio fresco y 1 x [10.sup.10] gv (1 x [10.sup.5] gv/celula) de los vectores AAV-GALNS y AAV-SUMF1 fueron adicionados a cada pozo. Al cabo de dos dias, el medio se remplazo por uno con suplemento de geniticina (Gibco) en una concentracion de 400 [micron]g/ml. Como control se emplearon celulas HEK293 sin transfectar. Todas las transfecciones se realizaron por triplicado.

A los 2, 4, 8 y 10 dias despues de la transfeccion, a las celulas se tripsinizaron y resuspendieron en 200 [micron]l de solucion de lisis (acetato de sodio 25 mM, [beta]-glicerolfosfato 1 mM, pH 5,5, triton X-100 1%), y lisadas mediante tres ciclos de congelacion/descongelacion. La solucion se clarifico por centrifugacion a 2.500 g por 5 minutos y se almaceno a -80[grados]C para posteriores analisis. El medio de cultivo fue recolectado a los 2, 4, 8 y 10 dias despues de la transfeccion. La solucion se clarifico por centrifugacion a 2.500 g por 5 minutos y se almaceno a -80[grados]C para posteriores analisis.

Para la cotransfeccion con CMV-SUMF1, 1,5 x [10.sup.5] celulas/pozo fueron sembradas en placas de 12 pozos, 24 horas antes de la transfeccion. El medio de cultivo se remplazo por medio fresco dos horas antes y las celulas fueron transfectadas con 1,5 x [10.sup.10] gv en una relacion 1:1 y 1:2 GALNS: SUMF1. Al cabo de 48 horas, el medio se cambio por uno que contenia geniticina y, al cuarto dia despues de la transfeccion, las celulas tripsinizaron. El lisado celular y el medio de cultivo se procesaron como se describio anteriormente.

Transfeccion de fibroblastos de mucopolisacaridosis IV A. Se obtuvieron fibroblastos de piel provenientes de un paciente con sindrome de Morquio A (MO18), con la mutacion I113F/R36KS (fenotipo grave), del banco de celulas del Pediatrie Research Institute de Saint Louis University. Los fibroblastos MO18 se cultivaron en medio esencial minimo de Eagle DMEM con suplemento de SFB al 15%, prolina y antibioticos. Veinticuatro horas antes de la transfeccion, se sembraron 1,5 x [10.sup.5] celulas/pozo en placas de 12 pozos. El medio se cambio 2 horas antes de la transfeccion y 1,5 x [10.sup.10] gv (1 x [10.sup.5] gv/celula) fueron adicionados. Al cabo de dos dias, el medio se remplazo por uno con suplemento de geniticina (Gibco) en una concentracion de 400 [micron]g/ml. Como control se emplearon fibroblastos normales y MO18 sin transfectar. A las celulas se agrego tripsinizaron a los 4 dias despues de la transfeccion y el lisado celular y el medio de cultivo se obtuvieron como se describio para las celulas HEK293. La cotransfeccion con CMV-SUMF1 se hizo como se describio previamente para las celulas HEK293, con 1,5 x [10.sup.10] gv en una relacion 1:1 y 1:2 (BALNS:SUMF1. Todas las transfecciones se hicieron por triplicado.

Aislamiento y transfeccion de condrocitos de raton. Los condrocitos de raton se obtuvieron a partir del apendice xifoides de ratones knock-out C57BL/6J silvestres y con mucopolisacaridosis IV A ([Gains.sup.-/-]), como describen Tomatsu et al.[35]. El tejido se tomo bajo condiciones esteriles y lavado con solucion de Hanks (Sigma-Aldrich). Los tejidos se incubaron en medio de crecimiento de condrocitos (CGM, (ambrex Bio Science) con 0,4% de pronasa durante 1 hora a 37[grados]C y, posteriormente, con 0,05% de colagenasa bacteriana durante 18 horas a 37[grados]C. Las celulas resultantes (condrocitos) se filtraron a traves de una membrana de nailon de 80 [micron]m (Millipore) en un tubo de centrifuga de 50 ml con medio ((M y se centrifugaron a 1.000 rpm durante 10 minutos. Luego de cuatro lavados con medio libre de colagenasa, los condrocitos se cultivaron en placas de 24 pozos con 2 ml de medio de crecimiento. Luego de alcanzar una confluencia de 60% a 70%, los condrocitos [Galns.sup.-/-] fueron transfectados con 1 x [10.sup.10] gv de AAV-GALNS, en ausencia o presencia de AAV-SUMF1 en relacion 1:2. El medio se remplazo 24 horas despues de la transfeccion. (uatro dias despues de la transfeccion, se recolecto el medio y las celulas se lavaron tres veces con NaCl 0,9% y se resuspendieron en 100 [micron]l de deoxicolato de sodio al 1%. Se empleraron condrocitos de ratones [Gains.sup.-/-] y silvestres sin transfectar como control. Todas las transfecciones se hicieron por triplicado.

Cuantificacion de la proteina por el metodo de MicroLowry. La proteina en los lisados celulares se cuantifico por el metodo de MicroLowry (36). Inmediatamente antes del analisis, las soluciones A ([Na.sub.2]C[O.sub.3] 20 g/L, NaOH 16 g/L, tartrato de sodio 0,8 g/L) y B (CuS[O.sub.4] x 5[H.sub.2]O 5 g/L) se mezclaron en una proporcion 50:1, para obtener la solucion C Se adiciono un ml de solucion C a tubos de borosilicato de 12 x 75 mm (Fischer) y se mezclo con 100 [micron]l de solucion estandar de albumina serica bovina (BSA), fraccion V, o 100 [micron]l de una dilucion 1:10 del lisado celular. La mezcla fue homogeneizada por vortex e incubada 10 minutos a 37[grados]C en bano de Maria. Trascurrida la incubacion, se adicionaron 100 [micron]l de una dilucion 1:1 en agua destilada de reactivo Folin 8 Ciocolten's Phenol 2N (SigmaAldrich). La mezcla se homogeneizo rapidamente por vortex y se incubo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, la absorbancia se midio a 660 nm. La curva de BSA empleada fue de 4 a 40 [micron]g de BSA, considerandose adecuada para la cuantificacion cuando el [r.sup.2] era superior a 0,99. (ada muestra se cuantifico por duplicado.

Determinacion de la actividad enzimatica. La actividad enzimatica se determino por el metodo descrito por van Diggelen et al. (37). Este metodo emplea la accion secuencial de dos enzimas: inicialmente, (ALNS remueve el grupo sulfato del sustrato 4-metil-umberiferil [beta]-D-galactopiranosido-6-sulfato y, finalmente, el fluorogeno 4-metilumbeliferona es liberado por la enzima [beta]-galactosidasa. La cantidad de 4-metilumbelifarona liberada es directamente proporcional a la cantidad de GALNS presente en la muestra analizada.

Para la reaccion, en tubo de borosilicato 10 x 75 mm (Fischer), se mezclaron 2 [micron]l de muestra con 9 [micron]l de sustrato 4-metil-umberiferil [beta]-D-galactopiranosido-6-sulfato (Toronto Research Chemicals) 22 mM en solucion tampon NaCl 0,1M, acetato de sodio 0,1M, pH 4,3. La mezcla fue homogeneizada por vortex e incubada 18 horas a 37[grados]C. Como blanco de reaccion, se emplearon 2 [micron]l de agua destilada. Transcurrida la incubacion, se adiciono 1 [micron]l de una solucion 10 mg/ml de [beta]-galactosidasa de Aspergillus oryzae (SIGMA), homogeneizando por vortex e incubando por 30 minutos 37[grados]C. Finalmente, se agregaron a la mezcla 1,9 ml de solucion de parada (glicina, 24 g/L; [Na.sub.2]C[O.sub.3] 21,2 g/L; NaOH, 7,5 g/L, pH10). La ' fluorescencia de la muestra se determino en un fluorometro Turner Biosystems modelo 9200-000 a [1.sub.ex] 366/[l.sub.em] 450. Las unidades de enzima (nm de 4 metilumbeliferona liberada por hora por ml) se calcularon empleando la ecuacion 3:

U = 10 mm x 1.000 [micron]L/2[micron]L x 1mL x tiempo de imcubacion (h) (3)

Para los lisados celulares, las unidades de enzima se dividieron por los miligramos de proteina en el lisado (U/mg).

PCR y RT-PCR. Para el analisis semicuantitativo por PCR (semiQ-PCR) del genoma y ARNm de los vectores, se sembraron 2 x [10.sup.5] celulas HEK293 por pozo en placas de 6 pozos, como se describio previamente. Las celulas fueron transfectadas con 2 x [10.sup.10] gv de CMV-CALNS y tripsinizaron a los 2, 4, 8 y 10 dias despues de la transfeccion. Se emplearon celulas HEK293 sin transfectar como control. El ADN genomico y el ARN total se extrajeron empleando el kit AllPrep DNA/RNA mini (QIA(EN), siguiendo las instrucciones del fabricante. La calidad del ADN y del ARN se evaluo por electroforesis en gel de agarosa al 1,2% y por cuantificacion espectrofotometrica a 260/280 nm. Todas las transfecciones se hicieron por duplicado.

Para la identificacion del ADN viral, se emplearon los cebadores TOMF23 y TOMF34R, los cuales son especificos para el ADNc de (ALNS humano y amplifican un fragmento de 235 pb. Los sitios de union para TOMF23 y TOMF34R en la secuencia genomica de (ALNS, se encuentran en los exones 10 y 12, respectivamente, que teoricamente amplificarian un fragmento de 4,1 kb, pero, bajo las condiciones de la PCR, permiten amplificar especificamente el genoma viral. La amplificacion se llevo a cabo a 95[grados]C por 5 minutos, 30 ciclos de 95[grados]C por 30 segundos, 64[grados]C por 30 segundos y 72[grados]C por 30 segundos y 72[grados]C por 10 minutos. Los productos de la PCR se visualizaron en agarosa al 1,5%.

Para el analisis del ARNm viral, la primera cadena de ADN se sintetizo por RTPCR con 500 ng de ARN total y un oligo-dT, empleando el kit Superscript II First-Strand ADNc Synthesis System (Invitrogen), segun las instrucciones del fabricante. Del producto de reaccion, se amplificaron 2 [micron]l con TOMF23-TOMF34R y con cebadores para el gen de gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GADPH), GADPIIS 5-ACCACA GTCCATGCCATCAC-3 y GADPHR 5 TCCACCACCCTGTTG CTGTA-3, los cuales amplifican un fragmento de 452 pb, el que fue usado para la normalizacion de los resultados. La amplificacion se llevo a cabo como se describio para el ADN viral. Los productos de la PCR se visualizaron en agarosa al 1,57 y la densidad de las bandas (intensidad/[mm.sup.2]) se midio empleando el programa Image J 1,38x (http:/ /rsb.info. nih.gov/ij/, National Institutes of Health, USA). Los valores se reportaron como la relacion de la densidad de la banda de GALNS Vs. la de GADPH.

Analisis estadisticos. Todos los resultados son reportados como la me dia [+ o -] desviacion estandar. Para el analisis estadistico, las medias se compararon mediante la prueba t de Student para muestras independientes, empleando el programa SPSS 13.0 para Mac OS X. Una diferencia se considero significativa con valores p<0,05.

Resultados

El esquema de los vectores AAV-GALNS y AAV-SUMF1 se ilustra en la figura 1. El metodo de produccion, purificacion y cuantificacion de los vectores recombinantes empleado en el presente trabajo permitio obtener aproximadamente 1 ml de solucion viral purificada con titulos virales del orden de [10.sup.13] vg/ml (tabla 1), superiores a los reportados por Zolotukhin et al. (33) y Sommer et al.[34], los cuales estaban en el orden de [10.sup.11] vg/ml.

Las relaciones cp/gv, las cuales son un indicativo del numero de capsides vacias presentes en la preparacion viral, fueron menores a las reportadas por Sommer et al. [34].

[FIGURA 1 OMITIR]

El rendimiento del proceso de produccion se calculo comparando la relacion [A.sub.260]/[A.sub.280] obtenida experimentalmente, contra la calculada para una preparacion con el 100% de particulas que contenian genoma, en donde la relacion cp/gv es igual a 1[34]. Empleando la ecuacion 3, se calculo el valor de [A.sub.260]/[A.sub.280] para una preparacion sin particulas vacias, el cual corresponde a 1,4578; 1,4707 y 1,4464 para las soluciones virales AAV2, AAV-GALNS y AAV SUMF1, respectivamente.

Como se observa en la tabla 1, los rendimientos del proceso de empaquetamiento se encuentran entre 63% y 79%, valores mas altos que los reportados por Sommer et al.[34], quienes obtuvieron rendimientos alrededor de 50%.

Modificaciones, como el uso de liposomas para la cotransfeccion y la remocion del rojo de fenol en el paso de iodizanol 60%, pueden haber jugado un papel importante en estos rendimientos. No se observo ninguna relacion entre el tamano del vector y el titulo viral o el rendimiento, aunque los titulos y rendimientos fueron mas elevados en los vectores recombinantes (AAV-GALNS y AAV SUMF1), que en el virus nativo (AAV2).

Transfeccion de celulas HEK293 con los vectores virales. Se transfectaron celulas HEK293 con el vector AAV-GALNS y la actividad enzimatica en los lisados celulares y medios de cultivo se determino a los 2, 4, 8 y 10 dias despues de la transfeccion (figura 2). Se observo un aumento en la actividad enzimatica a partir del segundo dia despues de la transfeccion, y se logro un incremento en la actividad hasta de 20 veces los valores observados en las celulas sin transfectar (0,63 [+ o -] 1,10 U/mg). Los valores de actividad enzimatica se mantuvieron relativamente constantes durante los 10 dias de cultivo y solo se observo un ligero aumento en la actividad, no significativo (p>0,05), con una actividad enzimatica final de 12,64 [+ o -] 1,25 U/mg al cabo de los 10 dias, correspondiente a 20 veces los valores observados en celulas sin transfectar. En el medio de cultivo no se detecto actividad enzimatica durante los 10 dias siguientes al cultivo. Debido a que los mayores valores de actividad se obtuvieron en el cuarto dia despues de la transfeccion, este intervalo fue seleccionado para los ensayos en fibroblastos de mucopolisacaridosis IV A y las cotransfecciones con CMV-SUMF1.

El analisis del ADN y el ARNm viral se muestra en la figura 3. El ADN viral se amplifico empleando cebadores especificos para el ADNc de GALNS, los cuales reconocen secuencias ubicadas en los exones 10 (TOMF23) y 12 (TOMF34R), evitando interferencia del ADN genomico. Como se muestra en la figura 3A, la cantidad de ADN viral del vector AAV-GALMS se mantuvo constante durante los 10 dias de cultivo. En cuanto al analisis del ARNm, la primera cadena de ADN fue sintetizada por RT-PCR empleando oligo-dT y, posteriormente, el ARNm viral fue amplificado con los mismos cebadores empleados para el analisis del ADN viral (figura 3B). Como se observo en el perfil de actividad enzimatica, las celulas HEK293 presentaron niveles basales de ARNm GALNS. El perfil de expresion de ARNm fue similar al observado en la actividad enzimatica, aunque en este caso se observo un pico de expresion hacia el cuarto dia (alrededor de 1,4 veces los valores basales), un leve descenso en el octavo dia, para finalmente alcanzar su valor final, 1,14 veces los valores basales.

[FIGURA 2 OMITIR]

La cotransfeccion con AAVSUMF1 en una relacion 1:1 produjo un incremento en la actividad GALNS de 2,4 veces (p<0,01), con respecto a las celulas transfectadas sin CMVSUMF1 (figura 4A). Se observo un incremento adicional en la actividad de 1,8 veces (p<0,01), cuando se empleo una relacion 1:2 GALNS:SUMF1, lo cual corresponde a un aumento final en la actividad de 82,1 (51,7 [+ o -] 5,59 U/mg) veces con respecto a los valores encontrados en celulas HEK293 sin transfectar. No se detecto actividad en el medio de cultivo de celulas HEK293 sin transfectar o en celulas transfectadas unicamente con CMV-GALNS. Sin embargo, la coexpresion con SUMF1 en una relacion 1:1 llevo a un leve incremento en la actividad (figura 4A). Se observo un incremento adicional de 1,8 (p<0,05) cuando las celulas fueron cotransfectadas en una relacion 1:2 GALNS:SUMF1.

[FIGURA 3 OMITIR]

Transfeccion de fibroblastos y condrocitos con mucopolisacaridosis IV

A. En los fibroblastos humanos con Morquio A, la transfeccion con AAV-GALNS permitio alcanzar valores de actividad enzimatica correspondientes al 36,57 respecto a la actividad en fibroblastos normales (figura 4B). Como se observo en HEK293, la cotransfeccion con AAV-SUMF1 en una relacion 1:1 llevo a un incremento de 1,6 veces en la actividad GALNS, lo que permitio alcanzar el 60% de la actividad enzimatica normal (8,05 [+ o -] 0,69 U/mg vs. 13,47 [+ o -] 1,46 U/ mg). Un incremento adicional de 1,5 veces se observo cuando se empleo la relacion GALNS: SUMF1 1:2. A diferencia de lo observado en el medio de las celulas HEK293, en fibroblastos de mucopolisacaridosis IV A, la actividad en el medio de cultivo solo fue detectada cuando estos fueron cotransfectados con SUMF1 en una relacion 1:2 (figura 4B), lograndose un valor de 0,36 [+ o -] 0,31 U/ml, el cual fue 1,9 veces los valores obtenidos en fibroblastos normales.

En condrocitos de raton knock-out con mucopolisacaridosis IV A, la transfeccion con AAV-GALNS produjo niveles enzimaticos en el lisado celular equivalentes a 707 del valor encontrado en condrocitos de raton normales (24,12 [+ o -] 6,23 U/mg vs. 34,0 [+ o -] 16,47 U/mg) (figura 5). A diferencia de los resultados obtenidos en celulas HEK293 y fibroblastos, la co-transfeccion con SUMF1 no tuvo efecto sobre la actividad GALNS en ellisado celular. En el medio de cultivo, los valores de actividad enzimatica en condrocitos transfectados con AAV-GALNS fueron 2,3 veces mayores que los normales (figura 4C). La cotransfeccion con AAV-SUMF1 no produjo un incremento en la actividad GALNS en las celulas cotransfectadas con AAV-GALNS.

Discusion

La enfermedad de Morquio A, o mucopolisacaridosis IV A (MPS IV A), es una enfermedad de deposito lisosomal rara que afecta, en promedio, 1 de 250.000 nacidos vivos (www.morquio.com). Aunque no existen cifras sobre la incidencia de esta enfermedad en Colombia, los estudios preliminares apuntan a este podria ser uno de los paises con mayor numero de individuos afectados por esta enfermedad [5, 6]. En la actualidad, no se dispone de un tratamiento especifico, por lo cual se maneja exclusivamente mediante correcciones quirurgicas y tratamiento farmacologico [3].

[FIGURA 4 OMITIR]

La mucopolisacaridosis IV A es una excelente candidata para tratamiento por terapia de remplazo enzimatico, terapia genica o terapia de reduccion de sustrato, debido a la ausencia de sintomas del sistema nervioso central. Las observaciones en otras enfermedades por deposito lisosomico de importantes correcciones bioquimicas y clinicas con niveles de actividad enzimatica de 107 o menos [13, 24] y los altos costos y efectos adversos asociados con la terapia de remplazo enzimatico [12, 38], constituyen hallazgos a favor del desarrollo de una estrategia de terapia genica para esta enfermedad. Igualmente, el reporte de correcciones completas de la enfermedad en diferentes modelos animales (raton, rata, gato, perro), son hallazgos a favor de la posibilidad de realizar la correccion del defecto enzimatico en humanos [13, 24, 25]. En el desarrollo de una estrategia de terapia genica para la mucopolisacaridosis IV A, en el presente trabajo se evaluo la capacidad de un vector derivado de virus adenoasociados (AAV) que portan el gen GALNS, para transfectar diferentes tipo de celulas. Ademas, se evaluo el efecto de la co-transfeccion con un vector portando el gen humano de SUMF1.

La transfeccion de celulas HEK 293 mostro que AAV-GALNS es capaz de entrar en la celula y expresar el gen GALNS (figura 2). Como se muestra en el analisis del ADN durante los diez dias de seguimiento, las variaciones observadas en la actividad enzimatica no fueron producto de perdidas del ADN viral durante el proceso de division celular (figura 3A). Por el contrario, estas variaciones estuvieron relacionadas con el nivel de ARNm, lo cual muestra que la actividad enzimatica estuvo directamente relacionada con la expresion inducida por el promotor CMV (figura 3B). Es importante anotar, en ese punto, que la enzima GALNS presenta una vida media de 30 minutos a pH neutro [39, 35], por lo que la actividad encontrada en las celulas HEK293 transfectadas no fue producto de enzima presente en las preparaciones virales.

Como se observa en la figura 4, los valores de actividad GALNS en el lisado celular fueron mayores en celulas HEK293, seguidos por los observados en condrocitos de raton y, finalmente, los encontrados en fibroblastos humanos. Esta diferencia puede deberse a factores propios de la celulas, como eficiencia de transcripcion, transduccion, de entrega de la proteina a su sitio de accion (trafico desde el reticulo endoplasmatico hasta el lisosoma) y lo mas importante, el tipo y la extension del procesamiento posterior a la transduccion. Aunque HEK293 no es el sistema de expresion de proteinas recombinantes mas usado, presenta una mayor eficiencia para la expresion de un transgen que la observada por cultivos celulares primarios [40]. Otros aspectos que pueden afectar los niveles de actividad son la eficiencia en la entrada del vector por una expresion diferencial de los receptores de membrana o las diferencias en el trafico del vector en el interior de cada celula [40, 41].

Desde el descubrimiento y aislamiento del gen SUMF1, el cual codifica para la enzima activadora de sulfatasas o enzima generadora de formilglicina, y su asociacion con la deficiencia multiple de sulfatasas, la coexpresion con SUMF1 ha mostrado ser de gran importancia, tanto en la produccion de enzimas para terapia de remplazo enzimatico, como en el tratamiento de estas enfermedades mediante terapia genica [42, 43]. Cuando una sulfatasa lisosomal es sobreexpresada, su activacion es incompleta, lo que se manifiesta por una disminucion de los rendimientos de produccion, para el caso de la terapia de remplazo enzimatico [42]. De otro lado, esta sobreexpresion puede reducir la actividad enzimatica de otras sulfatasas, lo que lleva a la obtencion de un beneficio parcial de la terapia, pues la cantidad endogena de SUMF1 no es suficiente para la activacion de la sulfatasa que se encuentra sobreexpresada y la de las otras sulfatasas [42].

La cotransfeccion con AAV-GALNS y AAV-SUMF1 en celulas HEK293 y fibroblastos humanos de mucopolisacaridosis IV A, produjo un incremento en la actividad de hasta 4,5 y 2,6 veces, respectivamente, en una relacion 1,2; mientras que, en condrocitos de raton con mucopolisacaridosis IV A cotransfectados con SUMF1, el incremento de actividad fue de 1,3 veces (figura 4). CCosma et al. (42) reportaron un incremento de 16, 3, 1,5 y 2 veces en la actividad de arilsulfatasa A en celulas CCOS-7, hepaticas, HEK293 y U2OS (linea celular de osteosarcoma), respectivamente, cotransfectadas con vectores derivados del virus del herpes simplex, que portaban los genes de arilsulfatasa A y SUMF1. Por otro lado, Takakusaki et al. [44] reportaron un incremento en la actividad de arilsulfatasa A de 5,8 y 6,1 veces en celulas HEK293 cotransfectadas mediante liposomas, con plasmidos que portaban los dos genes.

Uno de los trabajos mas completos en este campo fue el desarrollado por Fraldi et al. [22] en el cual se evaluo el efecto de la coexpresion de SUMF1 sobre 5 sulfatasas, empleando vectores lentivirales y virus adenoasociados en fibroblastos de leucodistrofia metacromatica, condrodisplasia punctata ligada al X, y mucopolisacaridosis II, III y VI. El incremento en la actividad de las sulfatasas estuvo entre 1 y 2,1 veces, con respecto al observado en celulas no cotransfectadas con SUMF1; e incrementos en la relacion sulfatasa:SUMF1 por encima de 1:2 no produjeron incrementos significativos en la actividad o en la reduccion de los glucosaminoglicanos [22], motivo por el cual en el presente trabajo solo se evaluaron las relaciones GALNS: SUMF1 1:1 y 1:2.

En cuanto a la coexpresion de GALNS y SUMF1 en celulas HEK293, los valores reportados en el presente trabajo son 1,7 veces mayores que los reportados por la cotransfeccion de dos plasmidos que porten el gen de GALNS y SUMF1 bajo el control del promotor CCMV, mediante el uso de liposomas[45]. Aunque es dificil comparar los resultados del presente trabajo con los reportados en la literatura debido que existe un claro efecto de la enzimas (a pesar de que todas son sulfatasas), promotores, tecnicas de transfeccion y vectores, los incrementos en la actividad enzimatica fueron similares a los observados con otras sulfatasas.

Otro hallazgo similar a lo observado en reportes de literatura [44, 22], y de gran importancia en terapia genica, fue el incremento de la actividad en el medio de cultivo de las celulas cotransfectadas con SUMF1, el cual tambien fue dependiente del tipo de celula utilizada. En celulas HEK293, la actividad en medio fue observada con una relacion 1:1 e incrementada hasta 4 veces cuando se empleo la relacion 1:2, mientras que, en fibroblastos humanos de mucopolisacaridosis IV A, esta actividad en el medio se detecto exclusivamente en celulas cotransfectadas en una relacion 1:2. Esta diferencia entre la linea celular HEK293 y los fibroblastos humanos de mucopolisacaridosis IV A (un cultivo primario), esta relacionada con la mayor eficiencia de HEK293 para exportar proteinas al medio [40].

Por su parte, los condrocitos de raton con mucopolisacaridosis IV A presentaron un comportamiento interesante. La transfeccion de los vectores AAV sin CMV-SUMF1 llevo a un incremento en la actividad enzimatica en el medio de cultivo (figura 4), con valores de actividad promedio superiores a los observados en el medio de cultivo de condrocitos de raton normales, mientras que la contransfeccion con AAV-SUMF1 no produjo un incremento en la actividad GALNS en el medio de celulas cotransfectadas con AAV-GALNS. Estos resultados en condrocitos apuntan hacia la existencia de un mecanismo de control o de una ruta saturable durante el procesamiento de la enzima en estas celulas, que regulan los niveles de enzima que son secretados. El incremento en la actividad GALNS en el medio de cultivo de celulas cotransfectadas con SUMF1 esta relacionado con el incremento en la estabilidad de la enzima, que evita su degradacion y permite superar un umbral de enzima activa en el interior de la celula, por encima del cual esta es secretada en mayor proporcion [44].

Los valores de actividad enzimatica en el lisado celular y el medio de cultivo fueron menores que los reportados por Toietta et al. [29], quienes emplearon retrovirus para transfectar diferentes cultivos celulares. Aunque los retrovirus presentan la ventaja de generar elevados niveles de expresion y transfectar diferentes tipos de celulas, su principal desventaja radica en la capacidad de generar canceres por mutagenesis por insercion o activacion de oncogenes tras su integracion.

Hacein-Bey-Abina et al. [46] reportaron la generacion de leucemia en 4 de 10 ninos con inmunodeficiencia combinada grave tratados con celulas hepatomopoyeticas transfectadas con un vector retroviral. En los cuatro casos, el efecto adverso se produjo por la activacion de diferentes oncogenes y solo tres de ellos respondieron positivamente a la quimioterapia [47]. Por el contrario, los vectores AAV se presentan como vectores mas seguros, pues permanecen principalmente de manera episomica [48] y, con excepcion de los hallazgos de Donsante et al. [49], quienes detectaron la aparicion de hepatocarcinomas en ratones con mucopolisacaridosis VII, no se han generado efectos adversos importantes en 60 estudios clinicos realizados a la fecha, algunos de ellos con mas de 8 anos de seguimiento (http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical/).

Al comparar estos resultados con los obtenidos en trabajos previos con el gen GALNS, se destaca que los valores de actividad enzimatica fueron mayores que los obtenidos con vectores AAV (30) y plasmidos transfectados por metodos no virales [45]. En el primer caso, el incremento en la actividad enzimatica puede ser producto de la purificacion de los vectores, mientras que, en el segundo, el incremento se debe a la mayor eficiencia de entrega del gen por parte del vector AAV que cuando se emplean metodos no virales. En la actualidad, estos vectores y otros que portan promotores eucarioticos estan siendo evaluados, tanto in vitro como in vivo, en la busqueda de la mejor estrategia de terapia genica para la enfermedad de Morquio A.

Conclusiones

El vector AAV-GALNS permitio la expresion del gen GALNS en celulas HEK293, fibroblastos humanos de mucopolisacaridosis IV A y condrocitos de raton con mucopolisacaridosis IV A, lograndose un incremento en la actividad enzimatica entre 5 y 24 veces los valores basales. La cotransfeccion con AAV-SUMF1 permitio un incremento hasta de 4,2 veces en la actividad C-ALNS, con respecto a celulas transfectadas con AAV-C-ALNS, llevando a la obtencion de valores de actividad normales en fibroblastos de mucopolisacaridosis IV A cotransfectados en una proporcion AAV-GALNS:AAV-SUMF1 1:2. La cotransfeccion con AAV-SUMF1 permitio la deteccion de la actividad enzimatica en el medio de cultivo de celulas que coexpresan C-ALNS y SUMF1, lo cual tiene un efecto importante sobre la capacidad de utilizar la correccion cruzada, mediante el uso de receptores de manosa-6-fosfato, para corregir celulas no transfectadas. Aunque es necesario el desarrollo de estudios in vivo en el modelo de raton con mucopolisacaridosis IV A, para observar la capacidad de corregir la enfermedad, estos resultados muestran el potencial de los vectores AAV y de la coexpresion con SUMF1, para lograr niveles terapeuticos de actividad enzimatica para la correccion del defecto genetico en la enfermedad de Morquio A.

Agradecimientos

Este trabajo se realizo con el apoyo de la Iniciativa Genomica Javeriana (proyecto numero ID 000950) y la Organizacion Internacional Morquio. Carlos Javier Almeciga-Diaz recibio una beca del Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnologia, Colciencias.

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CARLOS JAVIER ALMETICSA-DIAZ (1)

MARIA ANDREA RUEDA-PARAMO (1)

OLGA YANETH ECHEVERRI (1)

ADRIANA MARIA MONTANO (2)

SHUNJI TOMATSU (2)

LUIS ALEJANDRO BARRERA (1)

(1) Instituto de Errores Innatos del Metabolismo, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana.

(2) Department of Pediatrics, School of Medicine, Saint Louis University, MO, USA.

Este trabajo fue realizado en la Pontificia Universidad Javeriana (Bogota) y en Saint Louis University (MO, USA).

Recibido: 26-01-2009 Revisado: 24-04-2009 Aceptado: 25-06-2009
Tabla 1

Cuantificacion de los vectores recombinantes por metodo
espectrofotometrico

Vector      Tamano         Peso          [A.sub.260]/[A.sub.280]
             (pb)        molecular               Teorico
                          (gmol)

AAV2        4.677    1,44 x [10.sup.6]           1,4578
AAV-GALNS   4.937    1,52 x [10.sup.6]           1,4707
AAV-SUMF1   4.467    1,37 x [10.sup.6]           1,4464

Vector                    [A.sub.260]/[A.sub.280]
            [A.sub.260]          Observado                vg/ml

AAV2           2,868               0,928            3,24 x [10.sup.13]
AAV-GALNS      2,884               1,118            4,01 x [10.sup.13]
AAV-SUMF1      2,535               1,140            3,97 x [10.sup.13]

Vector                    Rendimiento
               cp/vg          (7)

AAV2           6,53          63,7%
AAV-GALNS      3,45          76,0%
AAV-SUMF1      2,90          78,8%
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Author:Almeticsa-Diaz, Carlos Javier; Rueda-Paramo, Maria Andrea; Yaneth Echeverri, Olga; Montano, Adriana
Publication:Revista Universitas Medica
Date:Jul 1, 2009
Words:9426
Previous Article:Analisis mutaciomal del gem MSX1 em pacientes con FLPNS e hipodomeia.
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