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Uso de la reaccion en cadena de la polimerasa para Borrelia burgdorferi en lesiones de esclerodermia localizada (Morfea), en pacientes venezolanos.

Using the polymerase chain reaction to Borrelia burgdorferi infection in localized scleroderma injure (morphea), in Venezuelan patients.

INTRODUCCION

Borrelia burgdorferi es el agente causal de la Borreliosis de Lyme, una enfermedad infecciosa multisistemica transmitida al humano por la picadura de garrapatas del genero Ixodes. Los primeros reportes de la enfermedad fueron publicados en Europa, a finales del siglo XIX, pero no fue sino hasta 1975 cuando todas estas tempranas descripciones cobraron importancia, con la epidemia de artritis ocurrida en Lyme, Connecticut, USA, de donde toma el nombre de enfermedad de Lyme, posteriormente cambiado a Borreliosis de Lyme, a partir del aislamiento de la bacteria Borrelia burgdorferi por William Burgdorfer, en 1982 (1, 2).

A pesar de que esta patologia ocurre en todo el mundo, la incidencia real y la distribucion es todavia incierta, ya que la mayoria de los reportes provienen de paises desarrollados (2,3). Solo en ellos se ha aislado el agente etiologico a partir de muestras humanas, de los reservorios y de las garrapatas. En Norteamerica y en Europa, la infeccion transmitida por la picadura de artropodos es la mas frecuente. China, Japon, Australia, Africa y Sudamerica tambien la reportan (3); sin embargo, la presencia de anticuerpos para esta espiroqueta solo ha sido demostrada mediante cultivo en el hemisferio norte.

Desde su aislamiento inicial en 1982, se han identificado cientos de cepas de B. burgdorferi. Los analisis moleculares de dichas cepas indican la existencia de diferencias geneticas y fenotipicas entre las mismas. Por esta razon se definio un grupo o complejo que comprende las distintas especies o grupos genomicos de Borrelia asociados con la Borreliosis de Lyme, el cual ha sido denominado complejo Borrelia burgdorferi sensu lato. Dentro de ese complejo existen 10 especies, de las cuales hasta la fecha, solo tres se consideran patogenas para los humanos: B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii y B. afzelii (3).

Las distintas especies de Borrelia estan distribuidas en diferentes areas geograficas; B. sensu stricto se distribuye en Norteamerica y Europa Occidental, B. afzelii se encuentra en Europa Occidental, Central y en Rusia y B. garinii se localiza en Europa, Rusia y Norte de Asia (4).

Diversos estudios demuestran que las manifestaciones clinicas de la enfermedad pueden variar de acuerdo a la genoespecie infectante de B. burgdorferi sensu lato:en pacientes con artritis, las cepas mas comunmente aisladas pertenecen a B. burgdorferi sensu stricto; mientras que B. garinii esta mas involucrada en casos donde predominan las manifestaciones neurologicas y las cepas de B. afzelii son mas prevalentes en las formas cutaneas de la enfermedad, como son la acrodermatitis cronica atrofica (ACA) (5).

Por otra parte, las manifestaciones clinicas varian entre los pacientes de Norteamerica y los de Europa y Asia. Por ejemplo, la encefalomielitis severa y la ACA son mas comunes en Europa, en contraste con la artritis que es mas frecuente en Norteamerica. Este hecho es explicado, en parte, por las diferentes genoespecies de Borrelia responsables de la enfermedad en las distintas regiones geograficas que pueden tener variados tropismos tisulares, posiblemente por diferencias geneticas entre las poblaciones afectadas (3, 4).

Las garrapatas del genero Ixodes son los vectores o transmisores de la enfermedad; se han descrito diferentes especies transmisoras: Ixodes ricinus en Europa; Ixodes persulcatus en Asia y en el este de Europa; Ixodes pacificus e Ixodes scapularis (antes llamado Ixodes dammini) en Norteamerica (1). En Venezuela se han encontrado garrapatas del genero Ixodes: Ixodes iatrellei, Ixodes ioricatus e Ixodes venezuelensis, que pudieran representar vectores potenciales de la enfermedad en la region (6).

La Borreliosis de Lyme es una enfermedad infecciosa compleja, que ataca piel, articulaciones, corazon y sistema nervioso. Las manifestaciones clinicas son variadas y solapadas, debido a la multiple afectacion de organos en las diferentes etapas, simulando enfermedades infecciosas y no infecciosas (2).

La esclerodermia localizada o morfea, es un desorden caracterizado por engrosamiento e induracion de la piel y del tejido celular subcutaneo debido a un deposito excesivo de colageno (7). Morfea tiene una incidencia de 27 nuevos casos anuales por millon de habitantes. La incidencia real puede ser mayor, ya que muchos pacientes no buscan atencion medica debido a la naturaleza benigna de la condicion (8). La etiologia de la esclerodermia localizada se ha asociado a la infeccion por B. burgdorferi, sin embargo la informacion publicada hasta la fecha no provee resultados definitivos (9).

En Sudamerica se han detectado anticuerpos frente a B. burgdorferi en pacientes con morfea, en Venezuela (estado Zulia) (6) y en Colombia (10). En cuanto a la epidemiologia de los casos positivos en el estado Zulia la mayoria de los casos provenian de zonas rurales boscosas y montanosas como la Sierra de Perija y el contacto con animales de granja usualmente fue positivo.

En la actualidad se disponen de diferentes metodos de laboratorio, los cuales en combinacion con los antecedentes epidemiologicos y los hallazgos clinicos, permiten confirmar el diagnostico de la infeccion por B. burgdorferi (2, 11). Dos de estos metodos se considera que proporcionan evidencia definitiva de la infeccion espiroquetal: el cultivo y la prueba reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), siendo el primero de ellos el "gold standard" del diagnostico, pero pocos laboratorios cuentan con el medio de cultivo especifico (Barbour-Stoenner-Kelley (BSK-I))

El metodo mas sensible disponible para hacer diagnostico de laboratorio son las pruebas serologicas, las cuales, representan el medio mas practico para confirmar la enfermedad, debido a su menor costo y facil realizacion. Presentan una moderada especificidad (72-89%), debido a su falta de estandarizacion responsable de variaciones interlaboratorios y a la existencia de reacciones cruzadas con otros microorganismos (Treponema pallidum, Borrelia recurrentis, Helicobacter pylori, Ehrlichia, Babesia), enfermedades autoinmunes (lupus eritematoso sistemico) y sindromes virales (virus Epstein-Barr) (12).

La amplificacion de secuencias especificas del ADN de la espiroqueta usando la reaccion en cadena de polimerasa (PCR), a partir de muestras de biopsias de piel, sangre, orina, liquido cefaloraquideo (LCR) y liquido sinovial, proporciona evidencia definitiva de la infeccion en fluidos corporales y es particularmente util en individuos que se encuentran en las etapas temprana diseminada y tardia (13, 14). Esta prueba se utiliza como marcador definitivo de enfermedad en los paises donde previamente se haya cultivado previamente la bacteria de muestras como sangre, LCR o liquido articular.

En vista de la localizacion en el estado Zulia de regiones rurales con caracteristicas ecologicas propias para el desarrollo de las garrapatas y de animales que pueden ser reservorios potenciales; la evidencia previa de anticuerpos especificos en la poblacion regional y la existencia de pacientes con manifestaciones clinicas de tipo dermatologico asociadas con la enfermedad, quienes reciben tratamiento sin tener un diagnostico etiologico preciso, se hace necesario el diagnostico de la infeccion por Borrelia burgdorferi en dichos pacientes mediante la utilizacion de una tecnica que proporcione evidencia definitiva de la infeccion como lo es la reaccion en cadena de la polimerasa.

El objetivo de este estudio fue buscar evidencia definitiva de la infeccion por Borrelia burgdorferi en pacientes con morfea, mediante la deteccion del ADN bacteriano en muestras de piel de pacientes con el diagnostico clinico e histologico de morfea.

MATERIALES Y METODOS

Se diseno una investigacion descriptiva, prospectiva, transversal que pretendio establecer si las manifestaciones dermatologicas (morfea) de los pacientes correspondian o no a la infeccion por B. burgdorferi, a traves de la realizacion de la prueba de biologia molecular reaccion en cadena de la polimerasa, en muestras de piel que fueron recolectadas en un solo momento durante la visita del paciente al laboratorio de investigacion.

Poblacion de estudio

Se estudiaron 21 sujetos de diferentes edades y sexo quienes acudieron entre marzo del 2004 y agosto del 2005, al Laboratorio HLA y Biologia Molecular del Banco de Sangre de Maracaibo, Venezuela, quienes fueron seleccionados mediante la tecnica de muestreo intencionado a partir de las consultas de infectologia y dermatologia de los hospitales publicos y privados del estado Zulia. Los criterios de inclusion fueron: presencia de esclerodermia localizada (morfea) y una prueba de anticuerpos mediante la tecnica de ELISA positiva para B. burgdorferi. Se excluyeron todas aquellas personas que presentaban manifestaciones clinicas diferentes a la ante mencionada.

Los pacientes se diagnosticaron como esclerodermia localizada (morfea) mediante criterios clinicos: lesiones localizadas inflamatorias con borde violaceo, con bordes bien delimitados, alopecia y anhidrosis, hiperpigmentadas o hipopigmentadas, con fibrosis y atroficas e histopatologicos: atrofia epidermica y un engrosamiento e induracion de la dermis, dado por excesivo deposito de colageno (15).

Se realizo una entrevista personal a todos los sujetos de la poblacion de estudio con la finalidad de llenar una historia clinica, para investigar antecedentes de picadura de garrapatas, visita a regiones rurales o boscosas, signos y sintomas compatibles con la patologia, tiempo de evolucion y tratamiento medico recibido.

Obtencion de las muestras

Muestra de piel (biopsia): Previa asepsia y antisepsia del area donde se encontro la lesion de morfea, se aplico anestesia local subcutanea (cifarcaina al 1%) y se realizo biopsia en saca bocados de 2 mm de diametro del borde de la lesion; posteriormente se suturo el area y se cubrio con gasa esteril. La biopsia fue colocada en un tubo de ensayo con 1 mL de buffer TE (0,5 mL M Tris-HCL, pH 9,0; 0,02 M EDTA; 0,01 M NaCl) y llevada al laboratorio para proceder a la extraccion del ADN.

Lisis celular y extraccion del ADN de piel

Las biopsias de piel fueron retiradas de los tubos de nsayo y luego cortadas con tijeras quirurgicas para dividirlas en pequenos fragmentos. Estos ultimos se transfirieron a un tubo conico de 15 mL y se procedio a la extraccion del ADN mediante el protocolo de extraccion con fenol-cloroformo recomendado por 12 Taller Internacional de Histocompatibilidad (16).

Prueba diagnostica reaccion en cadena de la Polimerasa

Se realizo una "nested PCR" a partir de biopsias de piel, con primers especificos para el gen de la flagelina de B. burgdorferi (17). Las secuencias de los "primers" utilizados y los subfragmentos amplificados se muestran en la Tabla I.

En estudios previos se demostro que los "primers" utilizados no hibridan con el gen de la flagelina de otras bacterias como Treponema pallidum, Treponema denticola, Yersinia enterocolitica y Escherichia coli (17). La especificidad de las secuencias de estos "primers" fue comprobada mediante revision en el programa Blast (Basic Local Alignment Search Tool) del NCBI (National Center for Biotecnology Information).

Los parametros utilizados en el ensayo de PCR fueron: 40 ciclos en la PCR externa y 30 ciclos en la PCR interna. Las temperaturas y tiempos que se utilizaron en los ciclos fueron: desnaturalizacion: 94[grados]C por 30 segundos, hibridacion: 48[grados]C por 1 minuto y elongacion: 72[grados]C por 2 minutos (17).

Procedimiento de la nested PCR

La mezcla de reaccion de 25 [micron]l usada en la PCR externa contenia: 1) 12,5 [micron]L PCR master mix (Promega[R]): Taq ADN Polymerasa, dNTPs, Mg[Cl.sub.2] y buffer de reaccion (Promega[R], 2004), 2) 5 [micron]l. ADN extraido y 3) 25 picomoles de cada uno de Set de "primers" externos (A1A2).

La mezcla de reaccion de 25 [micron]L usada en la PCR interna contenia: 1) 12,5 [micron]L. PCR master mix (Promega [R]), 2) 5 [micron]L del Producto amplificado y 3) 25 picomoles de cada uno de Set de primers internos (B1B2).

Se procesaron ademas como control positivo, ADN genomico de la cepa B31 de B. burgdorferi obtenido de la American Type Culture Collection (ATCC 35210) y como control interno, se realizo la amplificacion del gen de la Beta-globina humana. Los primers utilizados para la amplificacion del gen de la Beta-globina humana fueron: 5'-CAACTTCATCCACGTTCACC-3' y 5'-GA AGAGCCAAGGACAGGTAC-3'. El subfragmento amplificado del gen de la Beta-globina humana tiene un tamano de 268 pb (18). En la fase de estandarizacion de la PCR se incluyo el estudio de pacientes aparentemente sanos (n = 10) y con otras patologias, dermatologicas o no, como sifilis (n=5), acrodermatitis cronica atrofica (n=3), fascitis eosinofilica (n=1), artritis reumatoide (n = 4), ehrlichiosis (n=2), tuberculosis (n=7) y hemiatrofia facial (n=2) (19) .

Electroforesis en gel

La verificacion de los productos de amplificacion se hizo mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% de la siguiente manera:

Se cargaron los pozos del gel con marcador de peso molecular pGEM (Promega[R]) (5 [micron]L), 1 pozo, ADN control (5 [micron]L), 1 pozo, producto amplificado (4 [micron]L) resto de los pozos. A cada pozo se anadio 1 [micron]L de buffer de carga (loading dye blue/orange 6x) (Promega[R]) y se corrio a 100 mv y 60 miliamperios durante 1 hora y 30 minutos.

Analisis estadistico

Los resultados obtenidos se expresaron en valores absolutos y porcentajes.

RESULTADOS

Todos los pacientes en estudio se encontraban en la etapa tardia o cronica de la enfermedad, es decir, presentaban mas de un ano de evolucion. Asi mismo todos los sujetos refirieron el antecedente de la visita o permanencia en areas rurales.

En relacion con la picadura de garrapatas, dos de los individuos estudiados refirieron dicho antecedente (9,52%).

En cuanto a la administracion de tratamiento antibiotico se encontro que 14 sujetos (66,66%) recibieron antibioticos antes de empezar el estudio y 7 (33,33%) no los recibieron. Los antibioticos recibidos fueron doxiciclina (tetraciclina) y ceftriaxone, ambos con actividad contra Borrelias. En estudios serologicos previos el uso de antibioticos no modifico los resultados de las pruebas inmunologicas y no tenemos evidencias si estos podrian negativizar una prueba de PCR, porque aunque los antibioticos destruyen la bacteria, todavia fragmentos de ADN pueden persistir en los tejidos (20).

El ensayo nested PCR de las biopsias de piel de pacientes con morfea no mostro amplificacion de las secuencias seleccionadas del gen de la flagelina: subfragmentos de 730 bp (PCR Externa) y 290 bp (PCR interna); como se muestra en la Fig. 1. En los carriles correspondientes a las muestras de ADN de los pacientes solo puede apreciarse la banda de 268 pb correspondiente al gen de la Beta-globina humana, usada como control interno de amplificacion.

DISCUSION

Desde que la relacion entre B. burgdorferi y morfea fue sugerida por primera vez en 1985 por Aberer y col. (21), muchas investigaciones han sido conducidas para establecer una posible asociacion entre ambas patologias. Algunos estudios, la mayoria europeos, usando diferentes tecnicas como inmunohistoquimica (22), cultivo (23-25), serologia (23, 25-28) y reaccion en cadena de la polimerasa (17, 24, 29) han demostrado dicha asociacion. Por el contrario, los estudios realizados en Norteamerica (10, 29, 30, 31) han fallado en ese proposito (30-32). La asociacion entre las diferentes manifestaciones clinicas de Borreliosis de Lyme y las distintas genoespecies de B. burgdorferi puede parcialmente explicar estos resultados controversiales. Balmetti y Pifferetti (5) reportaron asociacion entre sintomas cutaneos (EM, ACA) y la genoespecie B. afzelii, Fujiwara y col. (31), detectaron B. afzelii y B. garinii (genoespecies Europeas), pero no B. burgdorferi sensu stricto, en biopsias de pacientes de Alemania y Japon con morfea, usando reaccion en cadena de la polimerasa. Es importante senalar que la genoespecie predominante en Norteamerica, B. burgdorferi sensu stricto, no ha sido relacionada hasta la fecha, con manifestaciones cutaneas de la enfermedad (32).

[FIGURA 1 OMITIR]

Aunque ninguna de las especies de B. burgdorferi ha sido aislada en Suramerica, se han obtenido pruebas serologicas positivas en pacientes venezolanos y colombianos con manifestaciones dermatologicas asociadas a Borreliosis de Lyme. Arocha y col. (6), detectaron anticuerpos frente a la bacteria en 6 de 14 pacientes venezolanos con morfea usando la tecnica ELISA. Sanchez y col. (datos no publicados), reportaron el caso de un infante proveniente del estado Tachira con eritema migrans cronico (lesion patognomonica de la enfermedad) y anticuerpos frente a la espiroqueta. Pocos casos de eritema migrans cronico han sido detectados en el estado Zulia pero una asociacion entre esta condicion y la infeccion por B. burgdorferi no ha sido demostrada todavia. En Colombia, Palacios y col. (32), detectaron muestras positivas mediante IgG Western Blot, en 2 de 9 pacientes con morfea.

Burkot y col. (33) reportan que la interpretacion de las serologias positivas en paises tropicales, donde no se ha aislado ninguna especie de Borrelia burgdorferi o el agente transmisor, se debe hacer con cuidado, debido a la posibilidad de falsos positivos, por reactividad cruzada. Los niveles elevados de inmunoglobulinas y anticuerpos de reaccion cruzada frente a otros patogenos (Treponema pallidum, Borrelia recurrentis, Helycobacter pylori, Ehrlichia, Babesia, virus Epstein-Barr) y enfermedades autoinmunes como lupus eritematoso sistemico, son causa de falsos positivos en pruebas serologicas de residentes de regiones tropicales.

El planteamiento anterior lleva a considerar la posibilidad de que los resultados positivos obtenidos en la localidad por el grupo de Arocha y col. (6), hayan sido falsos positivos debidos a reactividad cruzada, en especial porque en dicho trabajo las pruebas ELISA positivas no fueron confirmadas por otras tecnicas de mayor especificidad como el Western Blot o la Reaccion en Cadena de la Polimerasa (PCR).

Los resultados negativos obtenidos en el ensayo PCR realizado en esta investigacion no soportan la evidencia de infeccion por B. burgdorferi en los pacientes estudiados, pero tampoco excluyen la posibilidad de la existencia de una genoespecie distinta de B. burgdorferi sensu stricto, de una especie de Borrelia diferente del complejo B. burgdorferi sensu lato o de otro organismo espiroquetal, como el agente causal de Borreliosis de Lyme en Suramerica. Un estudio realizado en Colombia que uso la tecnica Western blot, reporto reactividad parcial en el suero de pacientes con sifilis y esclerodermia localizada, aportando evidencia de una posible asociacion entre las lesiones escleroticas y un organismo espiroquetal (33). Otra posibilidad es que la esclerodermia localizada no sea una enfermedad infecciosa y que tenga un origen inmunologico (autoinmune) o traumatico (34).

Tambien es importante senalar que la poblacion de pacientes estudiada fue pequena, resultando pertinente llevar a cabo otro estudio con una mayor poblacion, para obtener conclusiones definitivas. Es importante realizar cultivos en los pacientes con lesiones dermatologicas compatibles con Borreliosis de Lyme y en garrapatas provenientes de las regiones donde habitan estas personas, tratando de identificar una posible nueva genoespecie del complejo B. burgdorferi.

Recibido: 01-05-2008. Aceptado: 08-04-2010.

REFERENCIAS

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Fabiola Espinoza-Leon [1], Francisco Arocha [1], Manzur Hassanhi [2] y Julio Arevalo [3].

[1] Catedra de Bacteriologia y Virologia, [2] Catedra de Inmunologia y [3] Departamento de Clinica Quirurgica. Facultad de Medicina, Universidad del Zulia. Maracaibo, Venezuela.

Autor de correspondencia: Fabiola Espinoza-Leon. Catedra de Bacteriologia y Virologia, Facultad de Medicina, Universidad del Zulia. Maracaibo, Venezuela. Correo electronico: fabiolaespinoza@yahoo.com.
TABLA I
SECUENCIAS DE LOS "PRIMERS" UTILIZADOS Y SUBFRAGMENTOS AMPLIFICADOS

Gen blanco        Primer                 Secuencia

Flagelina    Primer externo A1   5'-CTGCTGGCATGGGAGTTTCT-3'
             Primer externo A2   5'-TCAATTGCATACTCAGTACT-3'
             Primer interno B1   5'-AAGGAATTGGCAGTTCAATC-3'
             Primer interno B2   5'-ACAGCAATAGCTTCATCTTG-3'

Gen blanco        Primer         Subfragmento
                                 amplificado
Flagelina    Primer externo A1
             Primer externo A2   730 bp

             Primer interno B1
             Primer interno B2   290 pb
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Author:Espinoza-Leon, Fabiola; Arocha, Francisco; Hassanhi, Manzur; Arevalo, Julio
Publication:Investigacion Clinica
Date:Sep 1, 2010
Words:4354
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