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Ultraestructura del Ovocito Maduro y en Reabsorcion de Spondylus limbatus G. B. Sowerby II, 1847 (= S. calcifer) (Bivalvia: Spondylidae)/Ultrastructure of the Mature and in Resorption Oocytes of Spondylus limbatus G. B. Sowerby II, 1847 (= S. calcifer) (Bivalvia: Spondylidae).

INTRODUCCION

Las descripciones ultraestructurales del ovario, del proceso de ovogenesis y de la degeneracion ovocitaria en bivalvos han aumentado, evidentemente, a partir de finales de la decada de los 80's, enfocandose casi exclusivamente en especies que tienen interes para su comercializacion y consumo: Mytilus edulis (Pipe, 1987), Pinna nobilis (de Gaulejac et al., 1995), Crassostrea virginica (Eckelbarger & Davis, 1996), Cyclina sinensis (Chung et al., 2007), Spisula sachalinensis (Chung et al., 2008a), Sinonovacula constricta (Chung et al., 2008b) y Chamelea gallina (Erkan, 2009).

Sin embargo, a pesar de que Spondylus limbatus es de gran importancia comercial en el Pacifico americano, y esta bajo proteccion especial en Mexico desde el ano 2002 de acuerdo a los terminos de la ley NOM-059 (Secretaria de Medio Ambiente y Recursos Naturales, 2010), hasta el momento no existe ningun estudio histologico o citologico de la gonada femenina de esta especie ni de ningun otro miembro de la familia Spondylidae.

Los estudios de ultraestructura ovocitaria en bivalvos generan conocimientos fundamentales acerca de los gametos, incluyendo morfologia y tamano. Asimismo, se abordan basicamente las variaciones que ocurren en cada especie, en particular la funcion de las celulas foliculares en la maduracion gametogenica y los cambios que ocurren durante la degeneracion ovocitaria (atresia) que se presenta dentro de alguna de las fases del ciclo gonadico de estos organismos (Beninger & Le Pennec, 1997).

De la misma forma, los estudios de ultraestructura ovocitaria en bivalvos permiten llevar a cabo seguimientos especificos, con una gran capacidad de resolucion, de las diversas alteraciones que pueden presentar los gametos de ejemplares sometidos a condiciones anomalas como la presencia de parasitos o procesos de contaminacion medioambientales (Durfort et al., 1982). De lo anterior, deriva la importancia de contar con descripciones previas de organismos provenientes de entornos saludables que funcionen como linea base para futuras comparaciones.

Por lo tanto, esta investigacion tiene como objetivo caracterizar la morfologia ultraestructural de los gametos femeninos maduros y en degeneracion de Spondylus limbatus.

MATERIAL Y METODO

En el Parque Nacional Bahia de Loreto, Golfo de California, Mexico, se recolectaron durante la epoca reproductiva hembras adultas (>116 mm de altura de la concha, Villalejo-Fuerte et al. (2002), extraidas de Spondylus limbatus. Las gonadas de estos organismos fueron extraidas y se obtuvieron porciones de aproximadamente 5 mm, que fueron fijadas con glutaraldehido al 2,5 % (Electron Microscopy Sciences) en agua de mar filtrada (pH = 8) durante seis horas; transcurrido este tiempo se realizaron cinco lavados de diez minutos cada uno con solucion amortiguadora de Sorensen. La post-fijacion se realizo con tetraoxido de osmio al 1 % durante una hora y las muestras se lavaron con la solucion amortiguadora de la misma forma. La deshidratacion se realizo con una serie de soluciones de etanol de concentracion ascendente (30 grados a absoluto). La infiltracion de los tejidos se llevo a cabo con una solucion de oxido de propileno y resina epoxica durante tres horas, para posteriormente incluirse con resina EPON 812. Se obtuvieron cortes ultra finos de 70 nm con ayuda de un ultramicrotomo, los cuales fueron contrastados con acetato de uranilo y citrato de plomo. Finalmente, los cortes fueron examinados en un microscopio electronico de transmision Modelo JEM-1010 (60ky) y se obtuvieron micrografias de distintas porciones de la gonada.

Para caracterizar la morfologia de los gametos femeninos maduros se obtuvieron medidas del diametro total, del nucleo y del nucleolo y se seleccionaron distintas porciones celulares (nucleo, citoplasma y membrana citoplasmica) para analizar las estructuras especificas de cada region. En el caso de los ovocitos en degeneracion, se observaron las caracteristicas de la perdida de la integridad celular en las mismas regiones que los ovocitos maduros viables.

RESULTADOS

Posicion y morfologia del ovario. Spondylus limbatus es una especie gonocorica que presenta un ovario discreto bien definido, que al madurar adquiere un color rojo intenso y se extiende hacia la glandula digestiva cerca del musculo aductor. Microscopicamente, la gonada esta compuesta de numerosos foliculos dentro de los que se desarrollan los gametos.

Ovocitos maduros: Los ovocitos maduros de S. limbatus (60-70 [micro]m de diametro) son gametos que han completado el proceso de vitelogenesis y que frecuentemente se observan en el centro del acino como si tuvieran una forma polihedrica, causada por la fijacion y por la compresion de numerosos gametos acumulados en la gonada madura (Fig. 1A-B).

El nucleo (~30 [micro]m) presenta en su interior una vesicula germinal formada de cromatina laxa y un nucleolo (~5 [micro]m). La membrana nuclear forma numerosas lobulaciones sobre si misma, muestra abundantes poros y acumulos de material electrondenso (Fig. 2). Al mismo tiempo, la doble membrana nuclear da lugar a sistemas de lamelas anuladas (Fig. 3), derivacion relativamente frecuente en ovocitos maduros.

El citoplasma presenta electrodensidad intermedia debido a la abundancia de ribosomas. Sin embargo, se observan espacios o canaliculos dentro el reticulo endoplasmatico rugoso, los cuales aparecen como un sistema o red de conexion a traves de toda la celula (Figs. 4 A-C). Las vesiculas del reticulo endoplasmatico rugoso pueden dar lugar a sistemas de lamelas anuladas (Figs. 4B-C). Entre este complejo sistema trabecular aparecen numerosas mitocondrias de morfologia tipica distribuidas por todo el citoplasma (Fig. 4D). Asimismo, se observan numerosas plaquetas vitelinas electrondensas y abundantes gotas lipidicas, apreciables por su menor densidad electronica (Fig. 4C).

La membrana citoplasmica de los ovocitos maduros se desdobla hacia afuera para formar numerosas microvellosidades, las cuales en varios casos adquieren la forma de copa (Fig. 5A-B). Estas estructuras se encuentran embebidas en una matriz extracelular, que se extiende alrededor de todo el ovocito, llamada cubierta vitelina (~2 [micro]m), muy evidente en esta especie, la cual es una capa ligeramente fibrosa con acumulos electrondensos alrededor de las microvellosidades (Fig. 5B). Adyacente a la cubierta vitelina se observa la presencia de celulas foliculares en contacto con gametos maduros, a traves de las microvellosidades (Fig. 1B).

Ovocito maduro en reabsorcion. En los gametos femeninos maduros de S. limbatus se presenta un proceso conocido como degeneracion o atresia ovocitaria, el cual involucra inicialmente la vacuolacion del citoplasma ocasionado por la distension del reticulo endoplasmico rugoso (Fig. 6A). El nucleo y la membrana citoplasmica presentan un deterioro en las etapas iniciales para finalmente colapsarse y dispersar las microvellosidades (Fig. 6B). Finalmente, la cubierta vitelina se desintegra y esto libera el contenido del citoplasma y del nucleo en el lumen del acino. Celulas hemociticas macrofagas son observadas frecuentemente entre los restos de los ovocitos atresicos en el acino. Estas celulas exhiben numerosos granulos densos heterogeneos similares a fagosomas y varias vacuolas en el citoplasma (Fig. 6C-D).

DISCUSION

Las caracteristicas ultraestructurales generales de los ovocitos maduros y en degeneracion observadas en Spondylus limbatus han sido descritas previamente para otros bivalvos como Mytilus edulis (Pipe), Pinna nobilis (de Gaulejac et al.) y Neotrigonia margaritacea (Glavinic et al., 2012). Sin embargo, existen ligeras diferencias con las especies taxonomicamente mas cercanas como Pecten maximus (Dorange & Le Pennec, 1989) y Patinopecten yessoensis (Chung et al., 2005). Estas diferencias se refieren al tamano de la cubierta vitelina y a la presencia de celulas foliculares en contacto con ovocitos maduros.

Respecto a la cubierta vitelina, esta es una especializacion de la matriz extracelular caracteristica de los ovocitos maduros, el grosor de la cubierta vitelina varia de acuerdo a la especie, en S. limbatus mide (~2 [micro]m), mientras que en Pecten maximus la cubierta vitelina es mas gruesa (5-6 [micro]m), a pesar de que el tamano de los ovocitos postvitelogenicos es de 60-70 [micro]m (Chung et al., 2005), similar a S. limbatus.

Por otra parte, la relacion que pueden presentar las celulas foliculares con los gametos femeninos, difiere de acuerdo a las especies. En Mytilus edulis (Pipe) y P maximus (Dorange & Le Pennec), los ovocitos jovenes estan completamente rodeados de "celulas foliculares". Estas celulas se desprenden de la zona apical de los gametos femeninos cuando los ovocitos desarrollan un pedunculo. Mientras que en P. yessoensis y Crenomytilus grayana, el papel trofico de las "celulas foliculares" predomina cuando los ovocitos maduros estan libres en el lumen folicular. En esta etapa, los ovocitos se encuentran completamente rodeados por celulas nutritivas, las cuales transfieren metabolitos por pinocitosis (Chung, 2007); adicionalmente, participan en la digestion, a traves de un sistema lisosomal, durante la reabsorcion de los ovocitos residuales (Chung). En S. limbatus, los ovocitos maduros se encuentran comunicados con las celulas foliculares por medio de las microvellosidades a lo largo de la cubierta vitelina, posiblemente de la misma manera como sucede en especies como Sinonovacula constricta (Chung et al., 2008b), Meretrix lusoria (Chung), M. edulis (Pipe) donde las celulas foliculares desempenan un papel en la formacion de las microvellosidades. En S. limbatus la membrana citoplasmatica presento abundantes micro-vellosidades embebidas en la cubierta vitelina; a traves de esta capa la celula puede ingresar al citoplasma el material extracelular necesario para la sintesis del vitelo. Esto sugiere que las microvellosidades, son especializaciones de la membrana citoplasmatica destinadas a aumentar la superficie de absorcion de la celula.

El citoplasma presento abundantes plaquetas vitelinas en distinto grado de formacion, las cuales pueden originarse a traves de la endocitosis o bien, a partir de la sintesis y modificaciones posteriores de algunos organulos citoplasmaticos tal como ocurre en Cyclina sinensis (Chung et al., 2007). La presencia de modificaciones de la envoltura nuclear y el patron de organizacion nuclear altamente lobulado, y por consiguiente una gran superficie que asegura el intercambio nucleo-citoplasma, sugieren su incorporacion de forma estructural posiblemente relacionadas con el proceso de formacion del vitelo.

Por otro lado, en los ovocitos maduros de S. limbatus se observa una compleja morfologia de la membrana nuclear que da lugar a lobulaciones de la doble membrana, formando sistemas de espacios membranosos que se separan del nucleo y se incorporan al citoplasma. Al mismo tiempo se observa la acumulacion de material electrondenso en la superficie de la membrana nuclear externa. La aparicion de acumulos electrondensos producidos por emisiones del nucleo a traves de los poros nucleares y evaginaciones de la membrana nuclear fue descrita por primera vez por Anderson & Beams (1956) en ovocitos de insectos. Posteriormente, se han encontrado estas estructuras en ovocitos de muchas especies, incluyendo a los bivalvos Mytilus edulis (Durfort, 1973) y Tapes decussatus (Bozzo et al., 1996). Estos acumulos a menudo se asocian a grupos de pequenas mitocondrias (tal como se observo para S. limbatus), por lo que se les denomina cemento mitocondrial, y se piensa que participan activamente en la formacion de las plaquetas vitelinas. La gran plasticidad de la superficie del nucleo, permite que este ocupe una extension considerable de la celula y, como es habitual en los ovocitos, da origen a agrupaciones de lamelas anuladas, las cuales en este caso pueden formarse tambien a partir del reticulo endoplasmatico rugoso.

Las lamelas anuladas son formaciones relativamente frecuentes en el citoplasma de los ovocitos maduros y su origen puede ser a partir del reticulo endoplasmatico rugoso, como sucede en el poliplacoforo Trachydermon cinereus (Durfort, 1976), o de la membrana nuclear como se ha observado en el bivalvo M. edulis (Durfort, 1973). En los ovocitos de S. limbatus, el origen pareciera ser doble de acuerdo a las imagenes descritas. En cuanto a su funcion, una de las hipotesis plausibles es que se trate de una reserva de la membrana nuclear para las posteriores divisiones celulares o como un medio de incrementar el area de sintesis de proteinas (Pipe).

La atresia es el proceso por el cual los ovocitos se degeneran progresivamente y son reabsorbidos. Puede ocurrir como un proceso fisiologico natural o como resultado de condiciones naturales desfavorables (Jobling et al., 2002); el proceso de degeneracion ovocitaria descrito aqui para S. limbatus es un fenomeno comunmente observado en moluscos (Pipe) una vez que ha concluido el desove. Las modificaciones celulares observadas en el presente estudio son muy similares a las reportadas previamente en bivalvos (Pipe). Las celulas observadas entre los restos de los ovocitos atresicos corresponden a hemocitos macrofagos, de acuerdo a lo descrito por Dorange & Le Pennec para P. maximus. Estas celulas probablemente desempenen un papel en la reabsorcion de material lisado favorecido por la presencia en su interior de diferentes enzimas lisosomales capaces de digestion. Por lo tanto, es posible que los nutrientes puedan ser transferidos a los nuevos gametos por medio de la hemolinfa o del tejido conjuntivo intersticial (Dorange & Le Pennec).

Dado lo anterior, podemos decir que los ovocitos maduros de S. limbatus presentan el aspecto caracteristico de celulas metabolicamente activas y altamente sintetizadoras, pero que al no ser liberados durante el desove, pueden ser reabsorbidos como resultado de un proceso fisiologico que permite aprovechar los nutrientes acumulados durante el proceso de gametogenesis. Esta descripcion ultraestructural sirve como linea base para futuras comparaciones con organismos expuestos a condiciones desfavorables.

CAMACHO-MONDRAGON, M. A.; VILLALEJO-FUERTE, M.; CEBALLOS-VAZQUEZ, B. P.; LOPEZ-VILLEGAS, E. O.; URIA-GALICIA, E.; VELEZ-ARELLANO, N. & ARELLANO-MARTINEZ, M. Ultrastructure of the mature and in resorption oocytes of Spondylus limbatus G. B. Sowerby II, 1847 (= S. calcifer) (Bivalvia: Spondylidae). Int. J. Morphol., 37(2):694-700, 2019.

SUMMARY: Spondylus limbatus is a species under special protection in Mexico, of which there is little or no information in the literature of biological, histological or ultrastructural studies of the ovary. The objective of this research was to characterize the ultrastructural morphology of mature and degenerating female gametes. The female gonad of S. limbatus in mature state presented post-vitellogenic oocytes 60-70 [micro]m in diameter, which have characteristics of metabolically active and highly synthesizing cells. The cytoplasmic membrane has specializations designed to increase the absorption surface of the cell, the microvilli; the cytoplasm presents numerous membranous systems related to synthesis of reserve and secretion material as well as the highly lobed nuclear organization pattern; a large surface that ensures core-cytoplasm exchange, is structurally incorporated into the vitellogenesis process. Finally, ultrastructural changes resulting from the lysis of the oocytes are described: collapse of nuclear and cytoplasmic membranes, and the presence of macrophage hemocytic cells.

KEY WORDS. Reproduction; Gonad; Electron microscopy; Vitelo.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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Marian Alejandra Camacho-Mondragon (1); Marcial Villalejo-Fuerte (2); Bertha Patricia Ceballos-Vazquez (2); Edgar Oliver Lopez-Villegas (3); Esther Uria-Galicia (3); Nurenskaya Velez-Arellano (4) & Marcial Arellano-Martinez (2)

(1) Instituto Nacional de Pesca y Acuacultura, Centro Regional de Investigacion Acuicola y Pesquera, Carretera a Pichilingue Km 1 s/n Col. El Esterito. La Paz, Mexico.

(2) Instituto Politecnico Nacional, Centro Interdisciplinario de Ciencias Marinas. Av. Instituto Politecnico Nacional s/n, Col. Playa Palo de Santa Rita. C.P. 23096. La Paz, Baja California Sur, Mexico.

(3) Instituto Politecnico Nacional, Escuela Nacional de Ciencias Biologicas, Unidad Profesional Lazaro Cardenas. Prolongacion Manuel Carpio y Plan de Ayala s/n, Col. Santo Tomas C.P. 11340 Delegacion Miguel Hidalgo, Distrito Federal, Mexico.

(4) Centro de Investigaciones Biologicas del Noroeste. Av. Instituto Politecnico Nacional 195 Col. Playa Palo de Santa Rita Sur. La Paz, Mexico.

Corresponding autor:

Marcial Arellano Martinez

Laboratorio de Intervertebrados Marinos

CICIMAR

La Paz, Baja California Sur

MEXICO

Email: marellam@ipn.mx

Received: 10-10-2018

Accepted: 24-01-2019

CAMACHO-MONDRAGON, M. A.; VILLALEJO-FUERTE, M.; CEBALLOS-VAZQUEZ, B. P.; LOPEZ-VILLEGAS, E. O.; URIA-GALICIA, E.; VELEZ-ARELLANO, N. & ARELLANO-MARTINEZ, M. Ultraestructura del ovocito maduro y en reabsorcion de Spondylus limbatus G. B. Sowerby II, 1847 (= S. calcifer) (Bivalvia: Spondylidae). Int. J. Morphol, 37(2):694-700, 2019.
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Author:Camacho-Mondragon, Marian Alejandra; Villalejo-Fuerte, Marcial; Ceballos-Vazquez, Bertha Patricia; L
Publication:International Journal of Morphology
Date:Jun 1, 2019
Words:3129
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