Printer Friendly

Toxins and proteic profile of Actinobacillus suis samples from North American hog herds/Toxinas e perfil proteico de amostras de Actinobacillus suis provenientes de planteis suinos norte-americanos.

INTRODUCAO

Actinobacillus suis (A.suis) e um importante patogeno oportunista que pode causar doenca em suinos de todas as idades (OJHA et al., 2010). O microrganismo possui componentes semelhantes aos de outros Gram negativos, como os lipopolissacarideos (LPS) e poros constituintes de toxinas (SLAVIC et al., 2000). As toxinas hemoliticas/ citotoxicas produzidas pelo A. suis sao muito semelhantes geneticamente as toxinas do Actinobacillus pleuropneumoniae (App), ApxI e ApxII (KAMP et al., 1994). A similaridade na producao de toxinas pode ser o fator determinante nas semelhancas observadas entre os sinais clinicos de infeccoes por A. suis e infeccoes por App.

As toxinas ApxI e ApxII encontradas em especies consideradas menos virulentas como o A. suis foram denominadas de [ApxIA.sub.var suis] e [ApxIIA.sub.var suis] (BURROWS et al., 1992; OSTAAIJEN et al., 1997). Varios testes feitos por meio de reacao em cadeia de polimerase (PCR), que sao baseados nos genes que codificam as toxinas Apx, foram desenvolvidos para o diagnostico da pleuropneumonia suina (COLLARES, 2000; GRAM et al., 2000). Entretanto, a homologia com os genes das toxinas [ApxI.sub.var suis] e [ApxII.sub.var suis] de A. suis impede a aplicacao desses genes como alvo para o diagnostico do agente (OSTAAIJEN et al., 1997; SCHALLER et al., 2000).

O diagnostico e tradicionalmente realizado por meio de isolamento bacteriano, e a identificacao da especie por meio de testes bioquimicos (OLIVEIRA, 2007). Atualmente, nao existem vacinas comerciais disponiveis para o controle de A. suis, e a maioria dos veterinarios dependem de vacinas autogenas e antibioticos para controlar e prevenir mortalidade (GEIGER et al., 2008).

Devido a necessidade da criacao de uma vacina universal que tenha como caracteristica a similaridade entre o isolado usado na producao desta e o restante de A. suis presente nos planteis, o estudo teve como objetivos confirmar a producao das toxinas ApxI e ApxII, investigar a producao de toxina geneticamente semelhante a ApxIII pelo A. suis e analisar os perfis proteicos, verificando se existe similaridade entre os isolados provenientes de diferentes planteis de suinos norte-americanos.

MATERIAL E METODOS

Amostras

Foram avaliadas 70 amostras de isolados (por analises bioquimicas de hidrolise na esculina e na producao de catalase, oxidase, urease e acido a partir de arabinose, celobiose, lactose, salicina, sacarose, manitol e sorbitol) contendo A. suis congelados em sangue de carneiro esteril. As amostras provenientes de planteis suinos norte-americanos foram submetidas ao Laboratorio de Diagnostico Veterinario (Veterinary Diagnostic Laboratoy -VDL) da Universidade de Minnesota (University of Minnesota, Saint Paul) entre os anos de 2005 e 2008. Esses isolados foram originados de planteis suinos dos Estados de Illinois, IL (10), Iowa, IA (6), Kansas KS (1), Minnesota, MN (26), Missouri, MO (3), Carolina do Norte, NC (9), Oklahoma, OK (3), Dakota do Sul, SD (2) e Tennessee, TN (5). Para controle, foram utilizadas quatro cepas referencias--ATCC (American Type Culture Collection).

Cultivo de cepas de A. suis e extracao de DNA

Cepas de A. suis foram cultivadas em meio solido e agar sangue de carneiro a 5% por 24 horas, com temperatura de 37[degrees]C, em meio aerobio com 5% de C[O.sub.2]. Apos o crescimento, duas colonias de bacterias foram adicionadas a dois microtubos contendo 300[micro]L da solucao tampao PBS (50mM de fosfato de potassio e 150mM de NaCl; pH 7,2). Em seguida, os microtubos foram centrifugados por tres minutos, a 3000rpm, com temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado, e o pellet foi utilizado para extracao de DNA. Foram extraidos DNA das amostras utilizando o reagente Prepman (PrepMan Ultra sample preparation reagent-Applied Biosystems, USA), de acordo com instrucoes do fabricante.

Reacao em cadeia da polimerase-multiplex (PCR-multiplex)

PCR-multiplex foram realizadas para detectar genes codificadores das toxinas ApxI e ApxII como previamente descrito por RAYAMAJHI et al. (2005).

A solucao (mix) para realizacao da PCRmultiplex foi preparada com os seguintes componentes: 25[micro]l de mastermix (MastermixR--Qiagen multiplex PCR KIT HotStarTaq DNA Polymerase, Multiplex PCR Buffer: 6mM MgCh e dNTP Mix); 5[micro]l de cada iniciador (20[micro]M). Para amplificar o gene ApxI, foram utilizados os iniciadores APXIAF (ATC GAA GTA CAT CGC TCG GA); APXIAR (CGC TAA TGC TAC GAC CGA AC); APXIBF (TTATCG CAC TAC CGG CAC TT) e APXIBR (TGC AGT CAC CGA TTC CAC TA); para amplificar o gene ApxII, foram utilizados os iniciadores APXIIF (GCA ATC AGT CCA TTG GCG TT) e APXIIR (CGT AAC ACC AGC AAC GAT TA). Alem desses dois genes, foi amplificado o gene ApxIII, sendo utilizados os iniciadores APXTTTF (GCAATC AGT CCA TTG GCG TT) e APXIIIR (GAC GAG CAT CAT AGC CAT TC). Todos esses iniciadores foram previamente descritos por RAYAMAJHI et al. (2005). Por fim, utilizou-se 50ng do DNA a ser testado e o volume final foi ajustado para 50[micro]L com agua ultrapura previamente tratada com DNase.

Controles foram feitos com as mesmas solucoes e reagentes da PCR-multiplex, porem sem a presenca do molde de DNA (controle negativo) e com 50ng DNA extraido de App dos sorotipos 1, 2, 4 e 6, e cada amostra correspondeu a um microtubo separado. As condicoes de reacao foram: desnaturacao inicial a 95[degrees]C por 15 minutos, seguida de 30 ciclos de 94[degrees]C por 30 segundos, 60[degrees]C por 1 minuto e 72[degrees]C por tres minutos, e um passo final de extensao de 72[degrees]C por 10 minutos.

Eletroforese em gel de agarose

Os produtos da PCR-multiplex foram resolvidos em eletroforese, em gel de agarose 1%, submetido a uma voltagem de 110V por aproximadamente duas horas. Este foi visualizado e fotografado em um transluminador (BioDoc- IT Imaging System ultraviolet light camera, UPV). Os dados foram analisados pela presenca ou ausencia de bandas.

Extracao e padronizacao das concentracoes de proteina celular total.

Cepas de bacterias foram cultivadas em meio solido, agar sangue de carneiro a 5% e posteriormente incubadas por 24 horas, com temperatura de 37[degrees]C, em meio aerobio com 5% de C [O.sub.2] A extracao proteica foi feita conforme o metodo descrito por OLIVEIRA & PIJOAN, C. (2004), com pequenas modificacoes. As concentracoes de proteinas extraidas foram determinadas por espectrofotometria, em um espectrofotometro (BioPhotometer, Eppendorf model 613124242, German, a 280nm. Em seguida, as concentracoes foram padronizadas para 1mg [micro][L.sup.-1].

Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante SDS (SDS-PAGE)

Amostras de proteinas extraidas anteriormente foram submetidas a eletroforese em gel de poliacrilamida sob condicoes desnaturantes (SDS-PAGE) 12%. As condicoes da eletroforese foram as seguintes: 25mA por 30 minutos e 35mA por 4 horas e 10 minutos. A coloracao do gel ocorreu em solucao contendo acido acetico 10% (v/v), alcool metilico 40% (v/v) e Coomassie Brilliant Blue R-250 1%, durante uma noite. O gel foi descorado em solucao contendo 10% (v/v) de acido acetico e 40% (v/v) de alcool metilico. A analise do perfil de bandas ocorreu com auxilio do software BioNumerics, versao 2.5 (Applied Maths, Kortijk, Belgium), o qual detectou a presenca ou ausencia de bandas fazendo a comparacao entre cada amostra.

[FIGURE 1 OMITTED]

RESULTADOS E DISCUSSAO

Os resultados observados no gel de agarose 1% para avaliacao da PCR-multiplex demonstram a amplificacao de tres bandas para os quatro sorotipos de App (Figura 1). No sorotipo 1, as bandas apresentavam tamanhos aproximados de 723pb (ApxIa), 811pb (ApxIb) e 965pb (ApxII). Entretanto, os sorotipo 2, 4 e 6 mostraram bandas com tamanhos proximos de 396pb (ApxlII), 965pb (ApxII) e 811pb (ApxIB). Esses achados concordam com os experimentos feitos por RAYAMAJHI et al. (2005). Conforme tambem pode ser observado na figura 1, todos os isolados de A. suis foram positivos para a presenca de genes codificadores das toxinas ApxI e ApxII, pois apresentam as bandas com tamanhos aproximados de 723pb, 811pb e 965pb, que caracterizam, respectivamente, as toxinas ApxIa, ApxIb e ApxII (RAYAMAJHI et al., 2005). Assim, essas descobertas indicam uma similaridade entre as toxinas ApxI e ApxII produzidas por App, com toxinas hemoliticas/ citotoxicas produzidas por A. suis, o que apoia a ideia de Kamp (1994). Contudo, nao houve amplificacao do gene codificador da toxina ApxIII. Atualmente, ha necessidade de descobertas de novas formas diagnosticas capazes de diferenciar as duas doencas de maneira rapida e sensivel. Ate hoje, a historia clinica e as lesoes sao utilizadas para o diagnostico pressuposto de pleuropneumonia, o qual e facilitado pela suspeita de surtos agudos da enfermidade. Nesses casos, o diagnostico final e obtido pela observacao das lesoes caracteristicas, alem do isolamento do agente. Em casos cronicos, a identificacao de App e dificil (NICOLET, 1992; STEVENSON, 1998). Sao necessarios diagnosticos diferenciais de infeccoes causadas por A. suis e Salmonella choleraesuis ou a combinacao de outros agentes, como Mycoplasma hyopneumoniae, Pasteurella multocida e Mycoplasma hyorhinis; cujas lesoes decorrentes sao similares a pleuropneumonia (STEVENSON, 1998). Dessa forma, ApxIII poderia contribuir no diagnostico diferencial, pois os resultados indicam essa toxina e seu gene como marcadores moleculares capazes de diferenciar infeccoes provocadas por A. suis daquelas causadas por App dos sorotipos 2, 4 e 6.

A analise de proteinas totais realizada com 70 amostras diferentes de A. suis foi obtida por meio de SDS-PAGE. A figura 2 expoe o perfil de bandas de 13 das 70 amostras avaliadas pelo programa BioNumerics, versao 2.5, o qual identificou e comparou as bandas obtidas, comprovando que todas essas amostras apresentavam as mesmas bandas. Dessa forma, este trabalho confirmou que os isolados de A. suis, circulantes em rebanhos norte-americanos, sao altamente clonais, ou seja, similares entre diferentes individuos da mesma especie. Assim, essas bacterias podem produzir proteinas similares, tais como toxinas e outras proteinas celulares.

[FIGURE 2 OMITTED]

Este e o primeiro estudo que caracteriza de modo compreensivel o A. suis relacionado com doenca nos Estados Unidos, o que, em associacao com parametros, como campo de isolamento da bacteria, grau de lesao no animal e origem desta, ausencia de lesoes por outros patogenos, prevalencia no rebanho e ano de isolamento, pode representar a oportunidade para a criacao de uma vacina universal para A. suis. Destaca-se que, ate o momento, nao existem vacinas comerciais contra A. suis, e a vacinacao e uma opcao valida para o controle, em comparacao com os tratamentos intensivos com antibioticos, que podem interferir na colonizacao do trato respiratorio por membros na flora normal, alem de ser mais barata a prevencao com a vacinacao do que o tratamento com antibiotico (OLIVEIRA, 2007). As informacoes referentes a eficacia de vacinas autogenas sao escassas. Contudo, como demonstrado neste trabalho, a variabilidade fenotipica de A. suis e limitada, aumentando as chances de que uma vacina universal produza protecao contra isolados de campo. Entretanto, mais informacoes sobre a associacao entre virulencia, antigenos (capsula, proteinas de membrana, toxinas) e imunidade protetora sao necessarias para o desenvolvimento de vacinas eficazes.

CONCLUSAO

As cepas de A. suis presentes nos planteis de suinos norte-americanos podem ser clonais, por apresentarem perfis proteicos identicos, alem disso, todas possuem genes semelhantes ou identicos aos genes que codificam as proteinas ApxI e ApxII, e nao possuem o gene semelhante ou identico codificador da toxina ApxIII. Todos esses genes foram encontrados em App.

O gene da proteina ApxIII pode ser utilizado como marcador para desenvolver um diagnostico diferencial entre infeccoes causadas por A. suis e infeccoes causadas por App dos sorotipos 2, 4 e 6.

REFERENCIAS

BURROWS, L.L.; LO, R.Y. Molecular characterization of an RTX toxin determinant from Actinobacillus suis. Infection and Immunity, v.60, n.6, p.2166-2173, 1992. Disponivel em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC257139/ ?report=abstract>. Acesso em: 20 nov. 2008.

COLLARES, R.M. Analise molecular dos genes para as toxinas de A. pleuropneumoniae em isolados de campo. 2000. 85f. Dissertacao (Mestrado em Ciencias Veterinarias) Curso de Pos-graduacao em Ciencias Veterinarias, Universidade Federal do Rio Grande do Sul,RS. Disponivel em: <http:// www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S010384782004000400057>. Acesso em: 16 set. 2008.

GEIGER, J. et al. Lowering the prevalence of Actinobacillus suis. In: International Pig Veterinary Society Congress, 20., 2008, Durban, South Africa. Proceedings ... Dublin, 2008. AASV Swine information CD- ROM catalog. Disponivel em: <http:/ /www.pigprogress.net/public/file/IPVS oral%20presentations/ Bacterial%20Diseases/Actinobacillus/ Lowering%20the%20prevalence %20of%20Actinobacillus%20suis.pdf>. Acesso em: 10 nov. 2009.

GRAM, T. et al. An A. pleuropneumoniae PCR typing system based on the apx and omla genes-evaluation of isolates from lungs and tonsils of pigs. Veterinary Microbiology, v.75, p.43-57, 2000. Disponivel em: <http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TD6-40J1DVM5&_user=687360&_coverDate =07%2F03%2F2000&_alid=1222175595&_rdoc=1 &_fmt=high&_orig=search&_cdi=5190 &_sort=r&_st=4&_docanchor=&_ct=11&_acct=C000037900&_ version=1&_urlVersion=0&_userid=687360&md5=6f6c0ff98ab 74766008ef05eac3eeff1>. Acesso em: 17 out. 2009. doi:10.1016/ S0378-1135(00)00206-6.

KAMP, E.M. et al. Production of Apx toxins by field strains of Actinobacillus pleuropneumoniae and Actinobacillus suis. Infection and Immunit, v.62, n.9, p.4063-4065, 1994. Disponivel em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/ PMC303069/>. Acesso em: 10 jun. 2009.

NICOLET, J. Actinobacillus pleuropneumoniae. In: LEMAN, A.D. et al. Diseases of swine. Iowa: Wolfe, 1992. Cap.31, p.401-408.

OJHA, S. et al. Characterization of colonization-deficient mutants of Actinobacillus suis. Veterinary Microbiology, v.140, p.122-130, 2010. Disponivel em: <http://www.sciencedirect.com/ science?_ob = ArticleURL&_udi = B6TD6-4WR66FD7&_user = 687360&_coverDate = 01%2F06%2F2010 &_alid=1320790143&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_cdi= 5190&_sort=r&_docanchoi^&view=c&_ct=31&_acct=C000037900&_ version=1&_urlVersion = 0& _userid = 687360&m d5=2f64d19a99a19b7246a707167a822cbd>. Acesso em: 20 abr. 2010. doi:10.1016/j.vetmic.2009.07.014.

OLIVEIRA, S. Actinobacillus suis diagnostics, epidemiology and control--on the path from good to great. In: AMERICAN ASSOCIATION OF SWINE VETERINARIANS ANNUAL MEETING, 38., 2007, Orlando, Florida, USA. Proceedings. AASV, 2007. p.371-376.

OLIVEIRA, S.; PIJOAN, C. Computer-based analysis of Haemophilus parasuis protein fingerprints. Canadian Journal Veterinary Reserch, v.68, n.1, p.71-75, 2004. Disponivel em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/ PMC1142133/>. Acesso em: 23 jun. 2009.

OSTAAIJEN, J.V et al. Actinobacillus suis strains isolated from healthy and diseased swine are clonal and carry apxICABDvar.suis and apxIICAvar.suis toxin genes. Journal of Clinical Microbiology, v.35, n.5, p.1131-1137, 1997. Disponivel em: <http://jcm.asm.org/ cgi/content/abstract/35/5/1131>. Acesso em: 15 ago. 2009.

RAYAMAJHI, N. et al. Development and use of multiplex polymerase chain reaction assay based on Apx toxin genes for genotyping of Actinobacillus pleuropneumoniae isolates. Journal of Veterinary Diagnostic and Investigation, v.17 p.359-362, 2005. Disponivel em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ sites/entrez>. Acesso em: 15 ago. 2009.

SCHALLER, A. et al. Characterization of Apx IVA, a new RTX determinant of A. pleuropneumoniae. Microbiology, v.145, p.2015-2016, 1999.

SCHALLER, A. et al. Apx toxins in Pasteurellaceae species from animals. Veterinary Microbiology, v.74, p.47-62, 2000. Disponivel em: <http://www.sciencedirect.com/ science?_ob = ArticleURL&_udi = B6TD6-40 9 6 3 1T7&_user=687360&_coverDate=06%2F12%2F2000&_rdoc=1&_ fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c& _searchStrId=1222238480&_rerunOrigin=google&_acct=C 000037900&_version=1&_urlVersion=0&_userid=687360&md5= 3e0345257e1ab85738a1045ddb38013a>. Acesso em: 20 out. 2009. doi:10.1016/S0378-1135(00)00204-2.

SLAVIC, D. et al. Comparative pathogenicity of different Actinobacillus suis O/K serotypes. Canadian Journal of Veterinary Research, v.64, p.81-87, 2000. Disponivel em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1189589/>. Acesso em: 20 out. 2009.

STEVENSON, G. W. Bacterial pneumonia in swine. In: INTERNATIONAL PIG VETERINARY SOCIETY CONGRESS, 1998, Birmingham. Proceedings ... Birmingham: International Pig Veterinary Society, 1998. p.11-20.

Rafael Silveira Carreon (I) Simone Rodrigues Oliveiran * Rone Cardoso (I) Joao Helder Frederico de Faria Naves (I) John Tomaszewski (II) Anna Monteiro Correia Lima Ribeiro (I)

(I) Laboratorio de Doencas Infectocontagiosas, Faculdade de Medicina Veterinaria, Universidade Federal de Uberlandia (UFU), Uberlandia, MG, Brasil.

(II) Veterinary Diagnostic Laboratory College of Veterinary Medicine University of Minnesota, 1333 Gortner Avenue St. Paul, MN, USA. 55108-1098. E-mail: oliv0107@umn.edu. * Autor para correspondencia.

Recebido para publicacao 03.05.10 Aprovado em 13.08.10 Devolvido pelo autor 23.08.10 CR-3523
COPYRIGHT 2010 Universidade Federal de Santa Maria
No portion of this article can be reproduced without the express written permission from the copyright holder.
Copyright 2010 Gale, Cengage Learning. All rights reserved.

Article Details
Printer friendly Cite/link Email Feedback
Author:Carreon, Rafael Silveira; Oliveira, Simone Rodrigues; Cardoso, Rone; Naves, Joao Helder Frederico de
Publication:Ciencia Rural
Date:Sep 1, 2010
Words:2672
Previous Article:Harmonic model for estimating the average monthly air temperature in different locations of Rio Grande do Sul State, Brazil/Modelo harmonico para a...
Next Article:Vegetative growth and intensity of green color of the leaves of acid lime trees 'Tahiti' girdled and treated with gibberellic acid/Crescimento...

Terms of use | Privacy policy | Copyright © 2020 Farlex, Inc. | Feedback | For webmasters