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Toxicidad aguda y actividad analgesica del extracto acuoso de hojas de Vismia baccifera L. var. dealbata (Guttiferae) en animales de experimentacion.

RESUMEN

En este trabajo se reporta la toxicidad aguda y actividad analgesica del extracto acuoso de Vismia baccifera var. dealbata (VIB) en animales de experimentacion. La dosis toxica media obtenida en la determinacion de la toxicidad aguda fue de 420 mg/Kg., exhibiendo los animales el signo de caminata en alzada como efecto toxico mas representativo, no observandose letalidad a ninguna de las dosis ensayadas. Actividad analgesica significativa fue observada a los 30 minutos post-tratamiento a la dosis de 210 mg/kg de extracto acuoso de hojas de VIB con respecto al control (p<0,05), mostrando un efecto analgesico similar al del acido acetilsalicilico (ASA, analgesico de referencia) a ese tiempo, pero menor al de la morfina (analgesico opiode de referencia). Se requiere estudios adicionales a fin de establecer el posible mecanismo de este efecto analgesico.

PALABRAS CLAVES

Vismia baccifera, Guttiferae, toxicidad aguda y actividad analgesica.

ABSTRACT

In the present investigation the analgesic activity and acute toxicity of the Vismia baccifera var. dealbata (VIB) aqueous extract using experimental animals is being reported. In the acute toxicity assay the medium toxic dose observed was 420 mg/kg where the experimental animals exhibited the lifting up walking as the most representative effect. Mortality was not observed in any of the doses tested. Significant analgesic activity was observed at 30 min post administration, at the dose of 210 mg/kg for VIB leaves aqueous extract in relation to the control (p<0,05), exhibiting an analgesic effect similar to Acetylsalicylic acid (ASA, reference analgesic) at this time but less than Morphine (opioid reference analgesic). Further investigation is required in order to establish the possible mechanism of this analgesic effect.

KEY WORDS

Vismia baccifera, Guttiferae, sharp toxicity and analgesic activity.

INTRODUCCION

El genero Vismia pertenece a la Orden Guttiferales, familia Guttiferae (Clusiaceae o Hypericaceae), tribu Vismieae. Este genero comprende cerca de 50 especies distribuidas en America y Africa tropical. La especie Vismia baccifera es un arbol de 5 a 12 m de altura, tronco ramificado y corteza externa de color marron-rojizo, conocida popularmente como lancetillo, carate, pinta mozo, mancha ropa, lacre, sangrito, onotillo, manchador, puntelanza y cedrillo (Ewan, 1962). En Sur America se tienen reportes de tres variedades de esta especie, las cuales se encuentran distribuidas como se describe a continuacion: Var. dealbata localizada en Surinam, Guyana Francesa, Colombia, Brasil y Venezuela (Estados: Merida, Tachira, Trujillo, Carabobo, Distrito Federal y Anzoategui); var. ferruginea localizada en Colombia y Venezuela (Estados: Carabobo, Miranda, Amazonas y Ciudad Bolivar) y la var. subcuneata localizada en Peru y Bolivia (Ewan, 1962).

Estudios fitoquimicos realizados en especies del genero Vismia han demostrado la presencia de quinonas, xantonas, antranoides prenilados, lignanos, esteroles, benzofenonas, entre otros (Nagem y Alves, 1995; Nagem y D[acute accent]Oliveira, 1997). De la especie V. baccifera se ha aislado la ferruginina A, B y C; la ferrantrona; la vismiona A y B; la vismiaquinona A y C; la diacetilvismona A y la diacetilvismona H (Delle Monache, 1985; Hussein et al, 2003). En estudios realizados en nuestro laboratorio se aislaron a partir de las hojas de V. baccifera var. dealbata los compuestos vismiaquinona, friedelina y sesamina, los cuales habian sido reportados en estudios anteriores en otras especies (Camele et al, 1982; Delle Monache, 1985) sin embargo, es la primera vez que se reportan para la especie en estudio.

Algunas especies de Vismia tienen importancia en la medicina tradicional por el latex de color naranja que se desprende al realizar un corte en varias partes de la planta. Este latex ha sido utilizado por algunas tribus del Amazonas para el tratamiento de heridas, herpes y en infecciones por hongos en la piel (Pasqua et al, 1995). Recientemente Kuete y colaboradores, reportaron la actividad antibacteriana y antifungica de varios compuestos aislados de la V. laurentii, tales como: la vismiaquinona, la friedelina, la bivismiaquinona y vismiaquinona C (Kuete et al, 2007). Debido a que estas sustancias son comunes en varias especies de Vismia (Nagem y D' Oliveira, 1997; Hussein et al, 2003) era de esperarse que el tratamiento de infecciones por hongos y heridas sea efectivo, tal como esta reportado en la medicina tradicional del Amazonas (Pasqua et al, 1995).

Por otra parte, el efecto citotoxico de varias plantas pertenecientes al genero Vismia sobre algunas lineas celulares humanas de cancer ha sido ampliamente estudiado. Hussein y colaboradores, estudiaron el efecto antiproliferativo del extracto metanolico de V. baccifera, observando actividad citotoxica sobre lineas celulares de cancer de mama, pulmon y sistema nervioso central. La ferruginina A, B y C; la vismiona B; la diacetilvismona A y la diacetilvismona H; tambien fueron activas sobre estas lineas celulares (Hussein et al, 2003). El extracto de raices de V. guianensis ha mostrado citotoxicidad en celulas de carcinoma oral y adenocarcinoma de colon, asimismo, la vismiona A, un constituyente de esta especie, tambien ha sido reportado como antineoplasico (Delle Monache 1985; Suffredini et al, 2007). De las especies V. japurensis, V. reichardtiana y V. decipiens se han aislado otros antranoides prenilados conocidos como vismionas A, B, H, D y F; los cuales poseen actividad citotoxica contra diferentes celulas tumorales, ademas de exhibir potente actividad insecticida contra Lepidoptera larvae y Locusta migratoria (Delle Monache 1985; Cassinelli y Geroni, 1986). Otras especies, tales como V. jefensis y V. macrophylla, tambien ejercen actividad citotoxica sobre lineas celulares de cancer de mama, pulmon y sistema nervioso central (Hussein et al, 2003).

La relacion entre cancer e inflamacion es bien conocida. La produccion de prostaglandinas proinflamatorias a partir del acido araquidonico mediante la accion de las ciclooxigenasas, juega un papel importante en el desarrollo de la metastasis y estan involucradas en la proliferacion de diversos tipos de cancer (Balkwill y Coussens, 2004; Fulton et al, 2006; Lawrence, 2007). Las prostaglandinas de tipo E2 ([PGE.sub.2]) son mediadoras de la progresion tumoral y ademas, son las principales moleculas involucradas en el proceso inflamatorio y nociceptivo; mas aun, la inhibicion de la produccion de estas sustancias es el principal mecanismo analgesico de los antiinflamatorios no esteroideos (Zeilhofer, 2007; Wang et al, 2007). Sin embargo, las distintas especies de Vismia que producen actividad citotoxica y antiproliferativa no han sido evaluadas desde el punto de vista de la inflamacion y la nocicepcion. Cabe destacar que la sesamina, uno de los constituyentes de la V. baccifera, ha demostrado inhibicion de la produccion de prostaglandinas, asi como tambien del factor de necrosis tumoral alfa (TNF[alfa]), el cual esta involucrado en los mecanismos del dolor y la inflamacion (Utsunomiya et al, 2000). En este trabajo se evaluo la toxicicidad aguda, actividad analgesica y actividad antiinflamatoria del extracto acuoso de las hojas de Vismia baccifera (var. dealbata) en modelos animales. Dado que hasta la presente no se conocen estudios previos de estas actividades para la especie, estos resultados representan un aporte a la farmacologia de la misma.

PARTE EXPERIMENTAL

Material botanico:

La especie V. baccifera var. dealbata L. (Triana & Planch.), Guttiferae, fue recolectada en la finca "Los Topes", Aldea San Juanito, Parroquia Chiguara, Municipio Sucre, altura 1250 m.s.n.m., Merida-Venezuela. Una muestra del material recogido luego de su identificacion, fue depositada en el herbario de la Facultad de Farmacia y Bioanalisis (MERF) de la Universidad de Los Andes, bajo el numero JR 21.

Obtencion del extracto acuoso:

Las hojas (550 g) de V. baccifera fueron secadas, molidas y sometidas a extraccion continua en un soxhlet durante 3 dias usando agua como solvente. Luego de la liofilizacion se obtuvo 90 g del extracto seco.

Animales de Experimentacion:

Para la evaluacion de la toxicidad aguda y actividad analgesica se utilizaron 68 ratones de la cepa BALB/c, de sexo masculino, con 15 [+ o -] 3 g de peso corporal (todos machos), provenientes del Bioterio de la Facultad de Farmacia de la Universidad Central de Venezuela. Para la evaluacion de la actividad antiinflamatoria se utilizaron 15 ratas de la cepa Sprague-Dawley (210 [+ o -] 24g) provenientes del Bioterio del Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel".

Farmacos usados en los ensayos:

Acido acetilsalicilico (Bayer, Venezuela; CAS A 3160) y sulfato de morfina (Sigma, USA; CAS M9524), ambos suministrados por la Coordinacion del Postgrado de Farmacologia de la Universidad Central de Venezuela. La fenilbutazona y la [lambda]-carragenina tipo IV fueron adquiridas en Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, USA).

Evaluacion de la toxicidad aguda del extracto acuoso de Vismia baccifera en ratones.

Para determinar la toxicidad aguda del extracto acuoso de V. baccifera (VIB) en ratones, se utilizo el metodo observacional descrito por (Irwin, 1962) (Campbell y Ritcher, 1967). La dosis toxica media ([DT.sub.50]) fue determinada por el metodo de (Litchfield y Wilcoxon, 1949). Los animales de experimentacion se dividieron en 6 grupos de 8 ratones cada uno (n=8). Todos los grupos, con excepcion del grupo control, se trataron con una dosis del extracto acuoso de las hojas de VIB, siguiendo el esquema que se presenta a continuacion:

Grupo A: 8 mg/kg intraperitoneal (i.p.); Grupo B: 32 mg/kg (i.p); Grupo C: 128 mg/kg (i.p); Grupo D: 512 mg/kg (i.p); Grupo E; 1024 mg/kg (i.p.) y Grupo F: Control, NaCl 0,9% i.p. (volumen requisito). Una vez administradas el extracto, los ratones se observaron y analizaron a los 10, 30, 60 y 90 minutos, registrandose el signo toxico mas representativo. La [DT.sub.50] se determino mediante la construccion de una curva dosis-efecto toxico y el empleo de nomogramas probabilisticos.

Evaluacion de la Actividad Analgesica del extracto acuoso de Vismia baccifera en ratones.

Para determinar la actividad analgesica se aplico un estimulo termico doloroso en la cola de los ratones y se cuantifico el tiempo que tarda el animal en retirar la cola (tiempo de reaccion) (Davies et al, 1946). Los animales se distribuyeron en 4 grupos de 5 animales cada uno y se pre-trataron como sigue: Grupo A: control, (NaCl 0,9% i.p.); Grupo B: sulfato de morfina, 3 mg/kg (i.p); Grupo C: acido acetilsalicilico (ASA), 20 mg/kg p.o. (en carboximetilcelulosa al 2%) y Grupo D: VIB, 210 mg/kg (1/2 [DT.sub.50]). El ASA y la morfina se utilizaron como analgesicos de referencia. Los ratones se sometieron a un estimulo termico en una pequena area de la cola mediante un analgesimetro (LETICA, Scientific Instruments, LE 7106, Espana), el cual mide el tiempo que transcurre entre la aplicacion del estimulo de luz radiante hasta que el animal retira la cola. El tiempo que tarda el animal en retirar la cola se considera el tiempo de reaccion (latencia). Este periodo de latencia fue medido a los 15, 30, 60, y 90 segundos despues de la administracion de los tratamientos. El tiempo maximo de reaccion fue de 15 segundos. Los resultados se expresan como la media [+ o -] el error estandar del promedio ([bar.x] [+ o -] eem). Las diferencias se calcularon por el metodo de analisis de varianza (ANOVA) de una sola via y por la prueba de Dunnett. Valores de p menores que 0,05 (p<0,05) fueron considerados significativos.

RESULTADOS Y DISCUSION

En la evaluacion de la toxicidad aguda del extracto acuoso de las hojas de V. baccifera var. dealbata, se establecio el signo de caminata en alzada como efecto toxico mas representativo (Irwin, 1962), el cual ocurrio a partir de la dosis de 32 mg/kg de VIB (2 ratones de 8), observandose un 100 % del efecto toxico en los animales (8 de 8 ratones), con la dosis de 1024 mg/kg. En la tabla 1 se observa el numero de ratones que presentaron el efecto toxico de caminata en alzada a las diferentes dosis y tiempos (10, 30, 60 y 90 min.) ensayados. La caminata en alzada pertenece a los signos de incoordinacion motora, por lo que es considerada como marcha anormal en animales de experimentacion (Irwin, 1962). El efecto pico se observo a los 30 minutos (Fig. 1). La [DT.sub.50] de VIB fue de 420 mg/kg con limites fiduciarios de 172,3 a 506,1 mg/kg, calculados por el metodo de (Litchfield y Wilcoxon, 1949). No se observo letalidad en ninguna de las dosis ensayadas, lo que indica buena seguridad para el uso de este extracto en otras pruebas in vivo.

[FIGURA 1 OMITIR]

Por otro lado, a pesar de la presencia de la sesamina en el extracto, este no fue capaz de inhibir el desarrollo del edema de la pata de la rata inducido por la [lambda]-carragenina. Cabe destacar que la sesamina, al igual que otros lignanos, es constituyente de algunas plantas con propiedades antiinflamatorias y analgesicas (Utsunomiya et al, 2000). Sin embargo, es necesario evaluar otras dosis y otras vias de administracion de VIB para llegar a resultados mas concluyentes. Existen evidencias que senalan a la sesamina como un compuesto antioxidante que inhibe la produccion de PGE2 y de citoquinas (Utsunomiya et al, 2000; Jeng et al, 2005). Asimismo, se le atribuye la disminucion del acido araquidonico (precursor de eicosanoides pro-inflamatorios) debido al aumento y acumulacion del acido dihomo-[lambda]-linolenico, resultante de la inhibicion de la [[DELTA].sup.5]-desaturacion de los acidos grasos de seis atomos de carbono (Fujiyama-Fujiwara et al, 1995; Chavali et al, 1998). Por lo que se espera, que las plantas que contienen este lignano, exhiban efecto antiinflamatorio y/o analgesico.

En contraste, el extracto de V. baccifera produjo una moderada actividad analgesica a los treinta minutos post-tratamiento con respecto al control (p<0,05). Mostrando un efecto analgesico similar al ASA, pero diferente a la morfina (Figura 2). Lo cual tomando en cuenta la disminucion de la produccion de prostaglandinas por la sesamina (Utsunomiya et al, 2000), se especula que el extracto produzca el efecto antinociceptivo por esta misma via.

[FIGURA 2 OMITIR]

CONCLUSIONES

En el ensayo de toxicidad aguda se determino una [DT.sub.50] de 420 mg/kg, exhibiendo los animales de experimentacion el signo de caminata en alzada como el efecto toxico mas representativo, no observandose letalidad en ninguna de las dosis ensayadas, lo que da un margen de seguridad aceptable para el uso de este extracto en otras pruebas in vivo. El extracto de VIB mostro actividad analgesica moderada a la dosis de 210 mg/kg, sin embargo la dosis de 80 mg/kg fallo en producir un efecto antiinflamatorio en el modelo de edema de la pata de la rata inducido por [lambda]-carragenina. Este resultado abre la posibilidad de ensayar dosis mayores del extracto y evaluar sus constituyentes, en especial la sesamina, en varios modelos de inflamacion y nocicepcion. Asi como tambien estudiar el efecto del extracto de VIB en la produccion de prostanoides y citoquinas tanto in vivo como in vitro.

AGRADECIMIENTOS

Los autores desean expresar su agradecimiento al Fondo Nacional de Ciencia, Investigacion y Tecnologia (Fonacit), por su aporte economico a traves del contrato numero 00001548. Al Consejo de Desarrollo Cientifico Humanistico y Tecnologico (CDCHT), de la Universidad de los Andes, por el financiamiento a traves del proyecto codigo FA-3070-308-Em.

Recibido Octubre 2006 - Aceptado Mayo 2007

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FABIOLA SALAS (a), CARLOS CIANGHEROTTI (b), MARGARITA SALAZAR-BOOKAMAN (b), JANNE ROJAS (a) *, ANTONIO MORALES (a)

(a) Grupo de investigacion Biomoleculas Organicas. Instituto de Investigaciones de la Facultad de Farmacia y Bioanalisis. Universidad de los Andes, Merida. Venezuela.

(b) Laboratorio de Farmacologia. Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela. Caracas. Venezuela. * Autor de contacto, e-mail janner@ula.ve
TABLA 1

Animales con manifestacion toxica inducida por el
extracto acuoso de Vismia baccifera.

Extracto acuoso de              No de ratones **
V. baccifera (mg/kg)
                       10 *      30 *       60 *       90 *
        08              0          0          0          0
        32              0          2          2          1
       128              2          3          2          2
       512              3          6          4          4
       1024             6          8          7          5

* Tiempo tomado en minutos

** Numero de ratones que presentaron el signo de caminata en Alzada
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Author:Salas, Fabiola; Ciangherotti, Carlos; Salazar-Bookaman, Margarita; Rojas, Janne; Morales, Antonio
Publication:Revista de la Facultad de Farmacia
Date:Jan 1, 2007
Words:3359
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