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Theoretical molecular model of the G protein-coupled [5HT.sub.2A] serotonergic receptor/Modelo molecular teorico del receptor serotoninergico [5HT.sub.2A] acoplado a proteina G./Modelo molecular teorico do receptor serotoninergico [5-HT.sub.2A] acoplado a proteina G.

Introduccion

En la busqueda constante por identificar nuevas moleculas de fuentes naturales o sinteticas, que generen actividad terapeutica, cumpliendo un papel agonista o antagonista frente a los procesos mediados por receptores, la identificacion del blanco molecular se plantea como una de las primeras etapas en la terapia dirigida a blanco, ademas de la evaluacion de su posible sitio de interaccion, donde se generara el efecto y las caracteristicas de union de la nueva molecula con su blanco terapeutico.

Para entender el proceso de union del ligando con el receptor se hace indispensable conocer el rol que desempena el ligando con los diferentes blancos biologicos en la fisiologia y bioquimica. Dentro de los diferentes blancos existen proteinas con funciones de: estructura de la membrana celular, mediadores de electrolitos como canales ionicos, sistemas enzimaticos que al estimularse catalizan reacciones, o tambien aquellos que modifican la produccion y/o estructura de diversas proteinas modificando los procesos de transcripcion y sintesis proteicas (1). Entre estos blancos existen los sistemas de proteinas G, los cuales pueden ejercer todas las funciones mencionadas anteriormente mediante la estimulacion puntual de sus blancos moleculares activos. Estos sistemas son de interes farmacologico debido a que son sitios clave donde los farmacos pueden interactuar con el organismo. La accion final del ligando como farmaco se ve mediada por la activacion de la proteina G generando segundos y terceros mensajeros (1). Por tal razon, el conocimiento de la estructura tridimensional es vital si se desea comprender a fondo el mecanismo de interacciones moleculares y asi formular un posible diseno racional de farmacos de nuevas moleculas que ligadas a su receptor ejerzan una actividad terapeutica deseada.

En la determinacion experimental de proteinas existen tres metodos para la elucidacion de estructuras terciarias y cuaternarias con resoluciones que permiten identificar las posiciones de las moleculas que lo conforman tales como lo son la resonancia magnetica nuclear (RMN), la difraccion de rayos X y la criomicroscopia con difraccion de electrones; sin embargo, estos presentan problemas puntuales como: La tecnica de RMN, que se focaliza en su baja resolucion al determinar estructuras de proteinas mayores a 35 KDa; la cristalografia con difraccion de rayos X, que requiere en primer lugar, cristales con un alto grado de ordenamiento lo cual implica una gran dificultad en el caso de proteinas de membrana, debido a las fuertes interacciones hidrofobicas presentes en las proteinas y la necesidad de trabajar en medios con agentes tensoactivos; la criomicroscopia con difraccion de electrones, produce imagenes que se obtienen de promediar varias imagenes independientes; para el caso de proteinas de membrana este ultimo se ha utilizado haciendo uso de cristales bidimensionales, el problema se define en su baja resolucion (2).

Hoy en dia, las estructuras tridimensionales obtenidas experimentalmente y publicadas se pueden obtener de la base de datos de Brookhaven conocida como PDB (Protein Data Bank), donde diariamente surgen investigaciones con nuevas estructuras; en la actualidad poseen 79356 (Febrero de 2012) (3). No obstante, la gran mayoria de estructuras que se encuentran en la base de datos de PDB corresponden a proteinas inmersas en medios acuosos y tan solo una porcion de ellas se refiere a proteinas que se encuentran dentro de una membrana, lo cual dificulta el estudio de interacciones de algunos principios activos con sus blancos terapeuticos. Es por esto que, al no disponer de una estructura obtenida experimentalmente, se acude a tecnicas de modelaje molecular con las cuales se pretende obtener un modelo teorico de la estructura de la proteina o receptor validado para el estudio de interacciones moleculares aplicado al diseno de nuevos farmacos, esto conlleva a los metodos de prediccion de proteinas como alternativa (4).

Hasta 2007 la estructura de rodopsina de bovino (1U191GZM), fue la unica proteina disponible para la realizacion de modelos homologos de receptores acoplados a proteina G (GPCR); hoy en dia se dispone de mas estructuras de GPCR, tales como el receptor [beta]2 adrenergico de humano (2RH1), rodopsina de calamar (2Z73), receptor [beta]1 adrenergico de pavo (2V74), opsina de bovino (3CAP) y receptor de adenosina A[2.sub.A] de humano (3EML), las cuales dan amplia informacion de la estructura y diferencias entre rodopsina de bovino con respecto a las otras clases de GPCR subtipo A, particularmente en la orientacion y posicion de las helices transmembranales y en la region de la estructura de los bucles (5). El uso de rodopsina de bovino fue planteado por Ballesteros y Weinstein en 1995, donde se contempla el uso del mapa de densidad electronica de rodopsina de bovino como topologia transmembranal, identificando aminoacidos conservados en la familia de GPCR subclase A (6).

El modelaje de proteinas G acopladas a receptor es un proceso incierto, por lo tanto, es importante evaluar la calidad del modelo obtenido para evitar errores en la conformacion obtenida debidos a malos alineamientos, dificultad en el modelamiento de regiones de bucles, asi como tambien en el proceso de refinamiento utilizado. La calidad estereoquimica del modelo puede ser evaluada mediante graficos de Ramachandran, los cuales nos indican la correcta posicion de los aminoacidos de acuerdo al estandar de los angulos phi y psi de estos para la formacion de helices alfa ([alpha]), hojas Beta ([beta]) y bucles (7). Es asi que el modelo es valido para estudios biomoleculares y/o aceptado con un 90 % de sus aminoacidos en regiones permitidas segun el grafico de Ramachandran (5, 7, 8).

Entre los receptores acoplados a proteinas G se encuentran los receptores de serotonina estudios realizados han identificado numerosos receptores de serotonina en el sistema nervioso central (SNC), desde el 5H[T.sub.1] hasta 5H[T.sub.7]. Los receptores de serotonina difieren en su funcion, en su respuesta a diversos compuestos, en sus efectos sobre el sistema de segundo mensajero o en su capacidad excitatoria o inhibitoria; en especifico, los receptores [5HT.sub.2A] se expresan en grandes cantidades en diversas regiones corticales, estos receptores son esenciales para la accion de la serotonina 5HT en un gran numero de procesos del SNC en donde se ven involucrados la regulacion de la conducta, la agresion, estado de animo, la modulacion de la percepcion, el dolor y la ansiedad, entre otros procesos fisiologicos. Debido a que las drogas alteran la conducta, se ha pensado que dichas alteraciones son producto de una modificacion en la comunicacion intraneuronal; gran cantidad de psicofarmacos, incluyendo antipsicoticos atipicos, antidepresivos y ansioliticos, actuan sobre [5HT.sub.2A], en ello radica la importancia de conocer el mecanismo por el cual se pueda generar un efecto agonista o antagonista para regular la expresion de dicho receptor con respecto a aminas biogenicas en enfermedades que involucran trastornos psiquiatricos; por tal motivo se hace relevante la investigacion y diseno de nuevos farmacos con el fin de brindar ayuda a aquellos que padecen este tipo de patologias. (9, 10, 11). Basados en la informacion obtenida, el blanco terapeutico central a elucidar teoricamente en la presente investigacion es la estructura terciaria del receptor [5HT.sub.2A] por medio de metodos computacionales validados.

En este trabajo se ha construido un modelo teorico del receptor [5HT.sub.2A], utilizando multiples alineamientos de la secuencia con estructuras [alpha] y [beta] adrenergicas obtenidas experimentalmente como plantillas, fusion de dos propuestas de modelos basados en su estructura y sometido a su respectiva validacion.

Materiales y metodos

Para el modelo teorico se partio de la identificacion de la secuencia de aminoacidos del receptor [5HT.sub.2A] de Homosapiens. (NCBI Reference Sequence: NP_000612.1 PUBMED http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed), se abordo la tecnica de topologia de membrana debido a que esta contempla la realizacion de modelos homologos con un porcentaje de identidad inferior al 30% entre la secuencia en estudio con respecto a estructuras obtenidas experimentalmente (4, 5, 6, 8)

Alineamiento de la secuencia de aminoacidos

Se identificaron los residuos mas conservados usando el esquema numerico establecido por Ballesteros y Weinstein, (Tabla 1) (6, 12, 13, 14). Para la generacion del modelo se empleo como herramienta el servidor de prediccion de proteinas I-TASSER (http://zhanglab.ccmb.med.umich. edu/I-TASSER/ [Fecha de calculo: 09/03/2011]) del cual se ha comprobado su eficacia en los experimentos de CASP7, CASP8, CASP9 (15,16). Para iniciar el proceso de modelado de la secuencia de aminoacidos se registra en el servidor, donde se establecen restricciones en los aminoacidos CYS 110 y CYS 187 en la estructura de rodopsina de bovino (1GZMA) como posible plantilla propuesta desde el usuario al servidor para conservar el puente disulfuro. El servidor contempla alineamientos multiples con diferentes plantillas para la construccion de un esqueleto base (Tabla 2), conformado por carbonos [alpha] y sus cadenas laterales que vienen de la identificacion de regiones o sectores homologos de la secuencia con las plantillas y que tomara su forma y estructura por la superposicion de la secuencia con respecto a las regiones identificadas de estructuras obtenidas experimentalmente y las regiones no alineadas con estructuras experimentales son calculadas por metodos ab initio (especialmente las regiones de los bucles) estructuradas por intercambio de simulaciones de Monte Carlo; 160 modelos son generados por 8 servidores contenidos en LOMETS -con sus algoritmos propios de calculo de probabilidad cada servidor- (herramienta de I-TASSER) donde cada servidor genera 20 modelos ordenados por sus Z-scores en cada algoritmo. Los diez mejores modelos se escogen de acuerdo a una funcion de puntuacion con respecto a su geometria, desviacion estandar y diferencia entre el calculo de la estructura nativa y el calculo de la estructura propuesta (17).

Tambien en este protocolo se contemplo el analisis de perfiles de hidrofobicidad para identificar regiones inmersas en la membrana y regiones expuestas a un medio hidrofilico. De los cinco modelos obtenidos por I-TASSER del receptor [5HT.sub.2A] los cuales provienen de alineamientos multiples (Tabla 2), se evaluo su conformacion estereoquimica por medio de graficos de Ramachandran y se fusionaron los modelos 1 y 2 manteniendo en la fusion la estabilidad del puente disulfuro (Maestro, version 9.1, Schrodinger, LLC, New York, NY, 2010.), (18).

Refinamiento de bucles

Se considero la prediccion de los bucles (bucle del citoplasma CL, bucle Extracelular EL) debido a que sus posiciones conformacionales dentro del grafico de Ramachandran se encontraban en regiones de alta energia en el medio siendo no permitidas para las posiciones estandar de los angulos phi y psi (7), usando el metodo de restricciones espaciales propuesto por Andrei Fiser y colaboradores en el 2003, contenido en el programa ModLoop-MODELLER (http:// modbase.compbio.ucsf.edu/modloop/ [Fecha de Calculo: 15/03/2012]) (19), se refinaron bucles extracelulares (BE1 137-147, BE2 211-227A 227-235B, BE3 349-360) y bucles citoplasmaticos (BC1 101-108, BC2 177-189, BC3 256-315) con una longitud maxima de 12 aminoacidos por segmento a excepcion del bucle extracelular No 2 el cual contiene 24 aminoacidos y la cisteina presente en este bucle es la que enlaza a la helice transmembranal No 3 formando el puente disulfuro. Se adicionaron protones en la estructura utilizando la herramienta de MOLPROBITY previo analisis de graficos de Ramachandran.

Minimizacion de energia

El proceso de minimizacion se llevo a cabo luego de haber obtenido una estructura con arreglos conformacionales y/o refinamiento de esta, con el fin de disminuir los impedimentos estericos de la estructura de la proteina obtenida. La minimizacion de energia del receptor se realizo por mecanica molecular, utilizando como campo de fuerza OPLS-2005 (20) en 100 pasos con radio de corte de 10 [Angstrom] para interacciones no enlazantes, el cual permite arreglar la proteina haciendo un reordenamiento espacial a su geometria disminuyendo asi la energia en su conformacion; lo que finalmente se busca es que mas del 90% de los aminoacidos de la estructura se encuentren en regiones permitidas, en la evaluacion por graficos de Ramachandran (http://molprobity.biochem.duke.edu/ [Fecha de calculo: 21/03/2011]) (5, 6, 7, 21).

Resultados y discusion

La construccion del Modelo 3D Teorico de la estructura terciaria del receptor [5HT.sub.2A] contempla la topologia de membrana de rodopsina de bovino y multiples alineamientos. Los aminoacidos mas conservados de la secuencia en estudio y de las plantillas son parte esencial para la identificacion de las regiones biologicamente mas conservadas y homologas en las proteinas G acopladas a receptor. De acuerdo con los alineamientos propuestos por el servidor se observa la conservacion de los aminoacidos establecidos segun Ballesteros y Weinstein, incluyendo el puente disulfuro, indicando que las plantillas seleccionadas se acomodan para la construccion del esqueleto base utilizando estructuras experimentales de ultima generacion las cuales han mejorado su resolucion (Tabla 1).

Generalmente, el primer paso en el reconocimiento de estructuras es la busqueda sistematica por algoritmos heuristicos, los cuales se generan por el programa BLAST con la base de datos del PDB, mostrando las plantillas que representan resultados significativos en su busqueda, identificando sus porcentajes de identidad y las mas homologas de acuerdo al logaritmo empleado. Sin embargo, en estas busquedas se encontro que estas estructuras presentan el inconveniente que su identidad esta focalizada a algunas regiones de la secuencia problema no cubriendo en su totalidad los 471 aminoacidos del receptor ([5HT.sub.2A] Homo Sapiens); o cuando cubre gran parte de la secuencia problema su identidad se encuentra por debajo del 30% (alrededor de 21 %), dificultando realizar una superposicion, ya que estructuralmente se estaria representado la plantilla (6); tambien en algunos casos no conservan los aminoacidos propuestos por Ballesteros y Weinstein ni el puente disulfuro, es asi que empleando la tecnica de multiples alineamientos de secuencias se escogen las proteinas que contengan mayor estructura y que conserven los aminoacidos de acuerdo al esquema establecido por Ballesteros y Weinstein, para tomar de cada una de ellas un segmento de la estructura experimental y acoplarla a la secuencia en estudio (receptor [5HT.sub.2A]) (Figura supl. A), hasta cubrir gran parte de la secuencia problema, para dar un acercamiento a la representacion teorica con respecto a estructuras experimentales. Debido a que estas proteinas G comparten caracteristicas estructurales evolutivas, se propone el uso del mapa de densidad electronica de rodopsina--la cual ha sido preestablecida por anos como plantilla de proteinas G, para el estudio de proteinas transmembranales debido a su dificultad en la extraccion (8)--basandose principalmente en la conservacion de dominios especificos para cada helice transmembranal como huella dactilar y patron evolutivo (Tabla 1), (5, 6, 12, 13, 14).

De acuerdo con los alineamientos propuestos por el servidor, calculados con el algoritmo TM-ALIGN, se observa la conservacion de los aminoacidos propuestos por Ballesteros y Weinstein incluyendo el puente disulfuro, indicando que las plantillas seleccionadas se acomodan para la construccion del esqueleto base utilizando estructuras experimentales de ultima generacion diferentes de las usualmente utilizadas: las rodopsinas. Las identidades por debajo del 30 % y la cobertura que no supera el 85%, la gran mayoria se encuentran entre el 75% y 68%, sobre la secuencia [5HT.sub.2A] son muy pequenas para hacer uso de una sola plantilla como estructura base, por tal razon se contemplan multiples plantillas basadas en el parametro Z-score, definiendo asi la energia de separacion entre el plegamiento nativo de la estructura experimental con respecto al conjunto de unidades calculadas del plegamiento de la secuencia [5HT.sub.2A] y usando como algoritmo TM-Align contemplando alineamientos globales y locales para el ensamble de la estructura base donde extraen de cada proteina experimental fragmentos altamente relacionados con la secuencia adaptando los plegamientos con mayor similitud estructural (Tabla 2), (Figura supl. A).

Una vez obtenidos los modelos se observa que el primero de ellos con C-score = -1.60, presenta una desviacion estandar de 10,9 [+ or -] 4,6A, debido a las caracteristicas estructurales que conservan sus aminoacidos, los cuales originan orientaciones diferentes en los segmentos transmembranales modificando la posicion de los bucles, que es la region donde es mas notoria la desviacion estandar con respecto a las estructuras experimentales (Figura 1). Tambien, se debe tener en cuenta que la estructura [5HT.sub.2A] no tiene relacion estructural cercana con las plantillas utilizadas a lo largo de toda la secuencia, estas conservan el sitio de enlace ortoesterico que en su estado inactivo se encuentra enlazado formando el puente disulfuro v que su ruptura conlleva a cambios conformacionales activando el receptor desde los sitios alostericos generando cascadas de senalizacion como segundos mensajeros, pero comparadas con rodopsina, el sitio de enlace es mas grande y abierto al espacio extracelular. Por esto se realiza una comparacion con el mapa de densidad electronica de la familia de rodopsina de bovino, se hace una comparacion estructural con proteinas relacionadas disminuyendo el valor de RMSD (Raiz Media Cuadratica de la Desviacion Estandar) a 1.2 [Angstrom] en promedio, acercandose el modelo a estructuras experimentales sin sobreponer sus plantillas como homologos. (Figura supl. B)

[FIGURE 1 OMITTED]

Se plantea el analisis del perfil de hidrofobicidad, representado en el grafico de Kyte & Doolittle, este contempla las caracteristicas fisicoquimicas de los aminoacidos que conforman la proteina dandole funcion o estructura y establecen los limites para la generacion de estructura (helices a y bucles) (Tabla 3), donde regiones por encima de cero son hidrofobicas y regiones por debajo de cero son hidrofuicas, se observa la probabilidad propuesta por el perfil de hidrofobicidad que los aminoacidos de la secuencia poseen caracteristicas fisicoquimicas que determinan la conformacion estructural, confirmando que la secuencia estudiada ([5HT.sub.2A]) contiene propiedades de proteina integral con 7 helices identificadas por su caracter hidrofobico, y los respectivos bucles citoplasmaticos y extracelulares por sus caracteristicas hidrofilicas (Figura 2).

[FIGURE 2 OMITTED]

Por otro lado, del modelo obtenido con C-Score = -1.60, se obtuvo los limites transmembranales propuestos para cada helice y para los respectivos bucles dentro de la conformacion se encontraron 3 bucles citoplasmaticos y 3 bucles extracelulares enlazados a las helices de transmembrana; uno de los bucles (BE 2), compuesto por 24 aminoacidos, el cual representa un reto en el modelaje, puesto que se enfrenta en modelar adecuadamente el bucle evitando impedimentos estericos y en mantener el enlace puente disulfuro, uno de los mas importantes en la conformacion de la proteina, pues, es en este donde se presenta el enlace propuesto para la formacion de cistina (enlace ortoesterico) en los aminoacidos CYS 148 de la HTM 3 y la CYS 227 del bucle BE2ab que inicia en la HTM 4 y termina en la HTM 5; la importancia del enlace ortoesterico radica en que es un sitio activo estructural que enlazado se encuentra en su estado inactivo pero al estimular el receptor en regiones alostericas sufre ruptura del puente disulfuro activando el receptor, modificando la orientacion de las helices transmembranales y generando alguna cascada de senalizacion para segundos mensajeros o apertura de canales ionicos. En otras investigaciones han contemplado el modelaje directo de los aminoacidos que conforman el puente desde la HTM 3 y el bucles BE2a Y BE2b construyendo un nuevo residuo CYS-S-S-CYS ensamblandolos con restricciones en las HTM para asegurar la conformacion (22).

En este trabajo se planteo la fusion de dos modelos generados por I-TASSER (modelo 1 C-score = -1,60 y modelo 2 = -1,66, ya que se encontraba en cada uno de ellos estructuras que mantenian el puente disulfuro formado entre las CYS 148 y CYS 227 a una distancia de 2.05 [Angstrom]; uno de los hallazgos fue la identificacion del puente sujetando la CYS227 sobre una hoja [beta] en el modelo 2 ya que en el modelo 1 las hojas [beta] se encontraban, pero eran mas pequenas y no mantenian la CYS sobre la hoj a b. Es asi que se observar una mayor estabilidad sobre la hoja [beta] del modelo 2 que evita interacciones con los otros bucles debido a los arreglos conformacionales y la longitud de dicha hoja [beta], impidiendo asi la ruptura del puente disulfuro que se puede generar en la minimizacion de energia. En simulaciones previas se encontraron estos inconvenientes pero fueron solucionados por la hoja [beta], (Tabla 3, Figura 3, Figura supl C).

Refinamiento estructural

En este proceso encontraron todos aquellos aminoacidos que generan distorsiones e impedimentos estericos, se identifican por medio de graficos de Ramachandran que miden la posicion de los aminoacidos en angulos phi y psi, prediciendo las regiones favorables en la conformacion geometrica. El modelo 1 obtenido por el servidor, fue verificado por graficos de Ramachandaran (modelo con C-Score = -1,60), obteniendose 83,4% de aminoacidos en regiones favorables de acuerdo a parametros del grafico de este modelo preliminar. Se identifica que la gran mayoria de aminoacidos presentes en estas regiones no favorables corresponden a los bucles, los cuales, por falta de forma definida y sus caracteristicas fisicoquimicas como el caracter hidrofilico, determinan su flexibilidad en medios polares (Figura Supl D).

Uno de los problemas que se presento en el modelo 1 al realizarle arreglos conformacionales de los bucles fue la perdida de estabilidad en el sitio ortoesterico (puente disulfuro), sufriendo ruptura. De su estabilidad depende su forma para ser sometido a estudio de acoplamiento a receptor ya que se requieren los sitios alostericos identificados sin impedimentos estericos que generen interferencia frente al ligando por errores de conformacion. La fusion de los modelos 1 y 2 obtenidos por I-TASSER, se contemplo debido a la presencia de estructuras definidas tales como helices a (en mayor proporcion), y que una de las hojas [beta] se encontraba la CYS 227, la cual enlaza con la CYS 148, manteniendo el puente disulfuro. Esta fusion fue evaluada mediante graficos de Ramachandran, obteniendose 85,7% de los aminoacidos en regiones favorables, evidenciando mejora conformacional con respecto al modelo 1 o modelo preliminar (Figura Supl E). El refinamiento de los bucles se llevo mediante software MODELLER ModLoop, por metodo de restricciones espaciales en un numero maximo de 12 aminoacidos por bucle, corrigiendo todos los impedimentos estericos y errores de conformacion.

[FIGURE 3 OMITTED]

Minimizacion de energia

Una vez ubicados todos los aminoacidos dentro de regiones permitidas del grafico Ramachandran, se realiza minimizacion de energia utilizando el campo de fuerza OPLS_2005, el cual esta definido por parametrizaciones de interacciones no enlazantes por simulaciones de Monte Carlo, debido a que en el proceso de refinamiento se producen movimientos en los bucles y helices transmembranales generando cambios conformacionales representados en energia libre alrededor del modelo. En las minimizaciones de energia no es recomendable hacer uso excesivo del campo de fuerza ya que este conlleva a las estructuras a un reordenamiento y posterior empaquetamiento, esto se ve representando en las posiciones tomadas por los aminoacidos en el grafico de Ramachandran, encontrandose por fuera de las regiones favorables. La eleccion del campo de fuerza se atribuye a los arreglos geometricos leves de forma que no inducen al modelo construido al empaquetamiento, ya que el uso de otros campos de fuerza tales como AMBER y CHARMM modifican significativamente la estructura del modelo obtenido rompiendo el puente disulfuro generando asi cambios conformacionales sobre el grafico de Ramachandran, induciendo al modelo a un empaquetamiento; en los estudios experimentales estos rompimientos no se presentan (excepto cuando se ligan los agonistas), es decir, que si en los modelos construidos no existe el puente disulfuro en el estado inactivo de la proteina se impide hacer uso del modelo propuesto en ensayos de acoplamiento (docking)

[FIGURE 4 OMITTED]

Durante los diversos procesos de modelaje tales como, la generacion de estructuras por el servidor I-TASSER, la fusion de los modelos 1-2, el refinamiento y minimizacion de energia de la estructura, todos fueron sometidos a evaluacion de geometria conformacional por medio de graficos de Ramachandran como indicador mediante la herramienta

MOLPROBITY.

Del modelo final minimizado se obtuvo en la validacion 91,7 % de los aminoacidos ubicados en regiones favorables de su geometria conformacional (Figura supl F). EL RMSD del modelo final minimizado, comparado con estructuras cristalinas relacionadas con el receptor [5HT.sub.2A] fue en promedio 0,95 [Angstrom]. Otro aspecto relevante en la validacion, durante toda la construccion del modelo se enfatizo en la conservacion del sitio ortoesterico (puente disulfuro) en una distancia inferior a 2,8 [Angstrom] que es la distancia requerida para un enlace S-S, ya que este brinda caracteristicas estructurales y funcionales a esta clase de proteinas, despues de minimizada la energia se verifico la conservacion del puente disulfuro de las CYS 148- CYS 227 (Figura 3). Estos resultados demuestran que la estructura terciara del modelo molecular teorico del receptor [5HT.sub.2A] de Homo Sapiens fue construido y mantiene las caracteristicas propias de este tipo de receptores acoplados a proteina G (Figura 4).

Conclusiones

En el presente trabajo se ha seguido el protocolo planteado por Ballesteros y Wenstein en el ano de 1995 establecido para la construccion de modelos teoricos de receptores acoplados a proteina G, enfocados en: aminoacidos especificos que son conservados en cada una de las helices que atraviesan la membrana; perfiles de hidrofobicidad que demuestran las caracteristicas quimicas de los aminoacidos dando posibilidades de los limites transmembranales; asegurar la correcta conformacion de la estructura por medio de la evaluacion geometrica (Grafico Ramachandran). Cumplir con los parametros planteados, el uso de algoritmos, estructuras 3 adrenergicas obtenidas experimentalmente y el uso de un campo de fuerza mas preciso y adecuado para este tipo de proteinas, permitio construir el modelo del receptor [5HT.sub.2A] de Homo sapiens, demostrando la vigencia de dicho protocolo utilizandolo con planteamientos teoricos de ultima generacion aplicados a herramientas computacionales que permiten generar un modelo teorico 3D propuesto para el estudio de acoplamiento de ligando a receptor.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Departamento de Fisica de la Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana y al Grupo de Biofisica y Bioquimica Estructural por haber permitido el uso de los equipos y el tiempo dedicado al desarrollo de este trabajo.

Financiacion

Este trabajo fue financiado por los autores, como parte del proyecto de grado para la obtencion del titulo de quimico farmaceutico de la Universidad de ciencias aplicadas y ambientales (U.D.C.A.).

Conflicto de intereses

Los autores manifiestan no tener conflicto de intereses.

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Rafael Eduardo Malagon Bernal [1], Manuel Alejandro Fernandez Navas [1], Orlando Emilio Acevedo Sarmiento [2]

[1] Facultad de Ciencia y Tecnologia, Departamento de Quimica Farmaceutica, Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales, Bogota D.C., Colombia.

[2] Departamento de Fisica, Pontificia Universidad Javeriana, Bogota D.C., Colombia.

* ramalagon@udca.edu.co

Recibido: 29-03-2012; Aceptado: 12-08-2012
Tabla 1. Residuos mas conservados localizados en la familia de las
rodopsinas.

                    Resultados modelo [5HT.sub.2A]

Dominio helice       Tipo de      Numero de residuo
transmembranal       residuo       en rodopsina (1)
(TM)

TM1                     N                 55
TM2                     D                 83
TM3                  (D/E)RY        134, 135, 136
TM4                     W                161
TM5                     P                215
TM6                   CWXP        264, 265, 266, 267
                                 304, 303, 305, 306,
TM7                   NPXXY              307
PUENTE S-S              C              110-187

                    Resultados modelo [5HT.sub.2A]

Dominio helice              Numero de residuo
transmembranal                en [5HT.sub.2A]
(TM)

TM1                                 92
TM2                                 120
TM3                            172, 173, 174
TM4                                 200
TM5                                 246
TM6                          335, 336, 337 338

TM7                       376,377, 378, 379, 380
PUENTE S-S                        148-227

-Residuos en negrilla numeros y letras, siempre se tienen que
conservar.

Tabla 2. Plantillas alineadas de secuencias con mayor porcentaje de
similitud con respecto a secuencia [5HT.sub.2A]

Rango a    Secuencia identificada PDB               iden1 b    iden2 c

1          2ks9A                                      18%      19%
           Receptor de Sustancia P

2          3pb1A                                      32%      25%
           Plasminogeno Activador inhibidor 1

3          2y00A                                      35%      23%
           Receptor [beta]1 Adrenergico

4          3em1A Nucleosido difosfato kinasa          22%      22%

5          2ks9A                                      17%      19%
           Receptor de sustancia P

6          2rh1A                                      28%      24%
           Receptor [beta]2 Adrenergico

7          3d4sA                                       3%      24%
           Receptor [beta]2 Adrenergico

8          2rh1A                                      19%      24%
           Receptor [beta]2 Adrenergico

9          3ny8A                                      28%      24%
           Receptor [bet]2 Adrenergico

10         2vt4B                                      37%      23%
           Receptor [beta]1 Adrenergico

                                                                Norm.
Rango a    Secuencia identificada PDB                Cov d     Z-score
                                                                  e

1          2ks9A                                      76%       2,29
           Receptor de Sustancia P

2          3pb1A                                      67%       5,39
           Plasminogeno Activador inhibidor 1

3          2y00A                                      59%       4,98
           Receptor [beta]1 Adrenergico

4          3em1A Nucleosido difosfato kinasa          69%       3,67

5          2ks9A                                      76%       3,58
           Receptor de sustancia P

6          2rh1A                                      68%       4,53
           Receptor [beta]2 Adrenergico

7          3d4sA                                      68%      11,29
           Receptor [beta]2 Adrenergico

8          2rh1A                                      85%       3,83
           Receptor [beta]2 Adrenergico

9          3ny8A                                      68%       4,98
           Receptor [bet]2 Adrenergico

10         2vt4B                                      57%       3,95
           Receptor [beta]1 Adrenergico

a) El rango de las plantillas, representan las mejores diez
plantillas utilizadas por I-TASSER para realizar multiples
alineamientos. b) Iden1: Es el porcentaje de identidad de la secuencia
consultada con respecto a las plantillas en regiones especificas.
c) Iden2: Es el porcentaje de identidad de la secuencia consultada
con respecto a toda la cadena de las secuencias de aminoacidos
alineados. d) Cov: representa la cobertura de los alineamientos
propuestos y es igual al numero de residuos alineados dividido por
la longitud de la proteina consultada. e) norm z-score: Es el
estandar del z-score de los aminoacidos introducidos. Alineamientos
con un z-score estandarizado > 1 significa un buen alineamiento
y viceversa.


[Supplementary FIGURE A OMITTED]

[Supplementary FIGURE B OMITTED]

[Supplementary FIGURE C OMITTED]

[Supplementary FIGURE D OMITTED]

[Supplementary FIGURE E OMITTED]

[Supplementary FIGURE F OMITTED]
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Title Annotation:Articulo original
Author:Bernal, Rafael Eduardo Malagon; Navas, Manuel Alejandro Fernandez; Sarmiento, Orlando Emilio Acevedo
Publication:Revista Universitas Scientarum
Date:May 1, 2012
Words:5351
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