Printer Friendly

TITANYUM DIOKSIT NANOPARCACIKLARININ YAC-1 LENFOMA HUCRE SOYU CANLILIGI VE INCE YAPISI UZERINE ETKILERI / THE EFFECTS OF TITANIUM DIOXIDE NANOPARTICLES ON VITALITY AND ULTRASTRUCTURE OF YAC-1 LYMPHOMA CELL LINE.

GIRIS

Nanoteknoloji, boyutlari 100 nm'den kucuk olan nanometre olcegindeki materyalin uretimini, fiziksel ve kimyasal ozelliklerini ve islevlerini arastiran tekniktir (1). Nanoparcaciklarin (NP), gunluk yasamda yaygin kullanim alani bulmaktadir ve bu durum partikullere maruz kalma duzeyini arttirir (2). Titanyum dioksit dusuk sitotoksik etkileri oldugu dusunulen bir parcaciktir. Boya, tekstil, kagit, plastik, gunes koruyucu, kozmetik, dis macunu, yemek urunleri gibi genis kullanim alani bulunan Ti[O.sub.2] beyaz bir pigmenttir (3). Uluslararasi kanser arastirma ajansi Ti[O.sub.2]'i Grup 2 kanserojen olarak siniflandirmistir (4). Ote yandan, nanoparcaciklar ve Ti[O.sub.2]'in bir baska kullanim alani da kanser terapisidir. Kanser tedavisinde tek baslarina ya da cesitli antikanser ilaclari ile birlikte kullanilmaktadir. Bu amacla nano tasiyici olarak kullanilan nanoparcaciklarin, ilac reaktivitesini, dayanikliligini, elektriksel ozelliklerini degistirme ozellikleri bulunmaktadir (5).

Nanoparcaciklarin antitumoral etki mekanizmalari, reaktif oksijen turevlerinin (ROT) uretimi, apoptoz ya da nekroz yolu ile olabilir. Farkli metal oksit NP'lerinin normal hucrelerde herhangi bir etki gostermezken kanser hucrelerinde sitotoksisiteyi uyardigi gosterilmistir (6). Calismamizin amaci oldukca genis kullanim alani olan titanyumdioksit nanoparcaciklarinin (Ti[O.sub.2]-NP) YAC-1 lenfoma hucre soyu uzerindeki olasi sitotoksik etkilerini arastirmaktir.

GEREC VE YONTEM

Calismamizda anataz/rutil kristal fazda ve 150 nm'den kucuk boyutta nanoparcaciklar ve Moloney murine losemi virusu (Mo-MuLV, Manassas, Virginia, ABD) ile uyarilmis mus musculus kokenli YAC-1 lenfoma hucreleri kullanildi. Bu calismada uygulanan tum prosedurler, ulusal ve kurumsal komitelerin etik standartlarina ve 2008 yilinda revize edilen Helsinki Deklarasyonu 1975 ile uyumludur.

Hucre Kulturu Calismasi

Hucreler 75[cm.sub.2]'lik kultur siselerinde DMEM medyumu (Sigma, St. Louis, Missouri, ABD) ile suspansiyon halde kulture edilerek 37[degrees]C etuvde (Sanyo MCO-20AIC, Osaka, Japonya), %5 C[O.sub.2] ortaminda inkube edildi. Hucreler 24'lu kultur kuyucuklarina mililitrede 100.000 hucre olacak sekilde ekildi. Ti[O.sub.2]-NP (Sigma Aldrich Cas number 13463-67-7, St. Louis, Missouri, ABD) iki farkli derisimde (0,1mg/mL ve 0,5mg/mL) olacak sekilde deney gruplarinda kullanilacak medyuma eklendi ve nanoparcaciklarin kumelenmesini engellemek icin 30 dakika boyunca vorteks ile calkalandi. 24 ve 48 saat sonrasi hucreler toplanarak canlilik ve elektron mikroskobu calismasi icin hazirlandi. Canlilik calismasi icin hucreler santrifuj ile cevrilerek sayma kamarasinda sayim yapildi.

Elektron mikroskop calismasi

Hucreler santrifuj ile cevrildi, pellet halindeki hucreler %2,5'lik gluteraldehit ile 1 saat sureyle tespit edildi. Fosfat tampon ile yikama sonrasi ozmik asit ile 1 saat +4 derecede ikincil tespit gerceklestirildi. Yukselen aseton serilerinden gecirilen hucreler kapsul icinde epon plastik ortamina (Fluka-45359, St. Louis, Missouri, ABD) gomuldu. Kapsuller epon polimerizasyonu icin inkubatorde (Heraeus B-5042, Hanau, Almanya) 60 derecede 18 saat inkube edildi. Ultramikrotom (Leica EM UC7, Wetzlar, Almanya) ile alinan ince kesitler 100 meshlik bakir gridler uzerine alindi. Kesitler uranil asetat ve kursun nitrat ile kontrastlama sonrasi JEM Jeol 1011-B gecirimli elektron mikroskobu (Massachusetts, Amerika Birlesik Devletleri) ile incelendi. Goruntuler Megaview III dijital kamera kullanilarak Soft Imaging System (SIS) Analysis programi ile elde edildi.

Istatistiksel Analiz

Canlilik testi icin gruplar arasi anlamlilik olup olmadigini belirlemek uzere elde edilen verilen SPSS programinda (IBM, New York, Amerika Birlesik Devletleri) Tukey-Kramer coklu karsilastirma testi ile degerlendirildi.

BULGULAR

Yirmi dorduncu saatte kontrol ve 0,1 mg/mL grubu arasinda cogalma indeksinde fark bulunmazken (p>0,05) kontrol ve 0,5mg/mL grubu arasinda anlamli fark (p<0,05) goruldu. Kirk sekizinci saatte, kontrol grubu ile 0,1 ve 0,5 mg/mL'lik gruplar arasinda cogalma indeksindeki dusus cok yuksek seviyede anlamli (p<0,001) goruldu. Her iki deney grubu arasinda hem 24. saatte hem de 48. saatte istatistiksel olarak anlamli bir fark (p>0,05) gorulmedi (Resim 1).

Elektron mikroskobik incelemede hem 24. hem de 48. saate ait kontrol gruplarindaki hucreler oval ya da yuvarlak sekilliydi. Cekirdek zari ve nukleer porlar belirgindi. Kromatin materyali kenarda heterokromatik alanlarin eslik ettigi okromatik ozellikteydi. Cekirdekcik belirgindi. Sitoplazma icerisinde lenfositleri lenfoma hucrelerine donusturmek uzere uygulanan Moloney murine losemi virusu izlendi. Sitoplazmada mitokondri yogunlugu fazlaydi ve mitokondrinin kristasi belirgindi. (Resim 2 a-d).

0.1mg/mL Ti[O.sub.2]-NP uygulanan hucrelerde 24 saatte kromatin materyali ve cekirdek zarinda herhangi bir degisiklik izlenmedi. Sitoplazma icerisinde Ti[O.sub.2]-NP bulunan degisken boyutta vakuoller mevcuttu. Kirk sekiz saatlik grupta bazi hucrelerde genetik materyalin asiri yogun oldugu ve perinukleer aralikta acilmalarin bulundugu izlendi. Sitoplazmada organeller belirgin izlenemiyordu. Ayrica sitoplazma icerisinde nanoparcacik iceren vakuoller mevcuttu. Butunlugunu halen koruyan hucrelerin yani sira plazma zari parcalanmis, nekrotik hucrelere de rastlandi. Bu hucrelerin sitoplazmasinda Ti[O.sub.2]-NP'lerini iceren buyuk vakuoller vardi. Sitoplazmada yapisi bozulmus ve krista kaybina ugramis mitokondri ve Ti[O.sub.2]-NP iceren cesitli boyutlarda vakuollere rastlandi (Resim 3 a-d).

0.5mg/mL Ti[O.sub.2]-NP uygulanan hucreler incelendiginde sitoplazmada Ti[O.sub.2]-NP birikimi iceren otofajik vakuoller mevcuttu. Mitokondri zarlarinda ayrilma ve krista kaybi izlendi. Hucrelerde buzusme mevcuttu. Bazi hucrelerde nukleer kondansasyon, mitokondri dejenerasyonu ve sitoplazmada kabarcik olusumu ile ayirt edilen apoptotik hucre olumunun tetiklenmis oldugu goruldu. Sitoplazmada cevresinde nanoparcacik birikimine ayrica NP iceren otofajik vakuollere de rastlandi (Resim 4 a-f).

TARTISMA

Ti[O.sub.2]-NP'leri hucreye ozgun toksisite gosterir. Ti[O.sub.2]-NP'lerinin insan keratinosit HaCat hucreleri uzerindeki etkileri incelendiginde hucre canliliginin doza bagli olarak dustugu ve ROT uretiminin arttigi bildirilmistir (7).

Thevenot ve ark. (8) farkli konsantrasyonlarda Ti[O.sub.2]-NP'leri ile cesitli tipte hucreler uzerindeki etkilerini inceledikleri calismada Ti[O.sub.2]-NP'leri en yuksek doz olan 10mg/mL'de 3T3 fibroblast hucrelerinde sitotoksik etki gostermemistir. Fakat prostat tumor hucresi (JHU) ve Lewis akciger karsinom (LLC) hucrelerinde 10mg/ml konsantrasyonda %50 ve %75 oraninda hucre olumune sebep oldugu bildirilmistir. Insan monoblastoid hucrelerinde Ti[O.sub.2]-NP'lerinin yuksek konsantrasyonlarda 24. ve dusuk konsantrasyonlarda 48. saatte nekrozu tetikledigi bildirilmistir (9). Calismamizda hucre canliligi uzerine elde ettigimiz bulgular onceki calismalar ile uyumludur. Ti[O.sub.2]-NP'lerinin fibrosarkom hucreleri uzerinde Bax/Bak aracili apoptotik yolaga bagli olmayarak hucre olumunu tetikledigi bildirilmistir (10). Gumus nanoparcaciklarinin Dalton lenfoma hucrelerinde kaspaz 3 aktivasyonunu tetikleyerek antitumoral aktivite gosterdigi bilinmektedir (11). Ti[O.sub.2]-NP'lerinin hucre sitoplazmasina klatrin ve kaveolin aracili endositoz ile girdigi cesitli calismalarla gosterilmistir (12). Sarhan ve Hussein'in yaptiklari calismada (13) Ag-NP'lerinin endositoz ile karaciger Kupffer hucreleri icerisine alindigi endozom ve lizozomlardaki elektron mikroskobik goruntuleri ile bildirilmistir. Titanyum dioksit gibi metal oksit nanoparcaciklarinin diger nanoparcaciklara gore otofaji olusturmada daha etkili olduklari bilinmektedir. Bunun nedeni hucrelerde oksidatif stres ve katyonik hasari arttirma ozelliklerine baglidir. Lopes ve ark. (14) yaptiklari calismada Ti[O.sub.2]-NP'leri ile muamele edilen HaCat hucrelerinde filopod olusumu ve 24. saat ve sonrasinda ise sitoplazmanin her yerinde ve perinukleer alanin cevresinde otofagozomlar ile sarili NP birikimlerine rastladiklarini bildirmislerdir. Gecirimli elektron mikroskobu ile yapilan incelemede Ti[O.sub.2]-NP'lerinin beyin endotel hucrelerinde sitoplazma icerisinde kucuk ve buyuk endozom ve lizozomlarda biriktigi ve otofajiyi tetikledikleri bildirilmistir (15). Calismamizda literatur ile uyumlu olarak Ti[O.sub.2]-NP'leri uygulanmis olan gruplarda hucrelerin sitoplazmalarinda otofajik vakuollerin icerisinde Ti[O.sub.2]-NP'lerinin birikmis oldugunu gorduk.

Otofaji, duruma bagli olarak hucrenin yasamina devam etmesini saglayabilecegi gibi hucreyi olume de goturebilen bir surectir. Otofaji cift zarli otofagozomlarin olusmasi ve sonrasinda lizozomlar ile birleserek olusturulan otofagolizozomlarda icerigin asit hidrolazlar ile parcalanmasidir. Oksidatif stres, aclik, DNA hasari, mitokondri hasari gibi stres durumlarinda otofaji hucrenin canliligini surdurebilmesi icin girdigi bir surectir. Bu durumda otofaji ile elde edilen amino asit ve yag asitleri yeni protein ve ATP uretimi icin kullanilir ve hucre yasamaya devam etmeye calisir (16,17,18). Otofaji, hucrenin kendisini strese karsi savunma mekanizmasi olarak gorunse de stresin fazla miktarda olmasi veya uzun sure devam etmesi durumunda hucre olumune sebep olabilir ve ayrica uyariya ve hucre tipine bagli olarak apoptoz ya da nekroz gibi hucre olum tiplerini tetikleyebilir (19). Otofaji hucrelerin yasadiklari mikro cevreye gelen ve bir stres unsuru olan nanoparcaciklari ortadan kaldirmak uzere verdikleri bir tepki olabilir. Bununla birlikte ortamda asiri nanoparcacik varligi hucreyi asiri zorlayarak otofaji kaynakli hucre olumunu tetikleyebilir (16,20). Biz calismamizda hucrelerde nanoparcacik iceren otofajik vakuol birikimlerinin yaninda doza bagli olarak hucrelerde nekrotik ve apoptotik hucre olumlerine ait bulgulara rastladik. Calismamizda kullandigimiz Ti[O.sub.2]-NP'leri immun sisteme ait olan lenfoma hucrelerinde hucre savunma sureci olan otofaji uzerinden farkli cesitlilikte hucre olumleri tetikliyor olabilir. Wang ve ark. (21) A549 hucrelerinde in vitro Ti[O.sub.2]-NP uygulamasinin hucre canliligini azalttigini ve apoptotik cisim olusumunu tetiklendigini bildirmislerdir. Yapilan diger cesitli calismalarda da Ti[O.sub.2]-NP'lerinin BEAS-2B hucrelerinde (22), kemirgen mikroglia N9 hucrelerinde (23) ve fare epidermal JB6 hucre soyunda (24) konsantrasyon ve zamana bagli olarak hucre canliligini azalttigi ve apoptozu tetikledigi bildirilmistir. Vamanu ve ark. (9) Ti[O.sub.2]-NP'lerinin U937 hucreleri uzerindeki olasi toksik etkilerini incelerken nukleer fragmantasyon, zarlarda kabarcik olusumu, kromatin kondansasyonu gibi apoptotik modifikasyonlarin yani sira en dusuk doz uygulamalarinda hucre sismesi, nukleer dekondansasyon ve hucre parcalanmasi gibi nekrotik hucre olumu bulgularina rastladiklarini da bildirmislerdir. Bulgularimiz bu calismalarda elde edilmis sonuclar ile uyumludur.

SONUC

Ti[O.sub.2]-NP'leri gunluk hayatimizda yaygin olarak kullanilmakta ve cevremizi ve bizi dolayli ve dogrudan etkilemektedir. Lenfoma hucreleri uzerinde calismamizda hucre duzeyinde toksik etki gosteren dusuk dozlarin hucre dongusu uzerindeki etkilerini hangi mekanizma ile gerceklestirdigi yeni calismalarla aydinlatilmasi gereken bir soru olarak kabul edilebilir.

Etik Komite Onayi: Yazarlar calismanin World Medical Association Declaration of Helsinki "Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects") prensiplerine uygun olarak yapildigini beyan etmislerdir.

Hasta Onami: Calismamiz deney hayvani ya da klinik insan calismasi olmadigi ve in vitro kultur ortaminda YAC-1 lenfoma hucre soyu kullanilarak yapildigi icin hasta onami gerekmemektedir.

Hakem Degerlendirmesi: Dis bagimsiz.

Yazar Katkilari: Fikir--T.K., A.E., H.S.M., S.D., S.S.; Tasarim--T.K., A.E., H.S.M., S.D., S.S.; Denetleme --T.K., A.E., H.S.M., S.D., S.S.; Kaynaklar--S.D.; Malzemeler - S.D.; Veri Toplanmasi ve/veya Islemesi--T.K., A.E., H.S.M., S.D.; Analiz ve/veya Yorum--T.K., A.E., H.S.M.; Literatur Taramasi--T.K.; Yaziyi Yazan--T.K.; Elestirel Inceleme--T.K., S.S.

Cikar Catismasi: Yazarlar cikar catismasi bildirmemislerdir.

Finansal Destek: Yazarlar bu calisma icin finansal destek almadiklarini beyan etmislerdir.

Ethics Committee Approval: Authors declared that the research was conducted according to the principles of the World Medical Association Declaration of Helsinki "Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects".

Informed Consent: Informed consent is not necessary since our study was performed using the YAC-1 lymphoma cell line in vitro and conducted neither on animals nor as a clinical trial.

Peer-review: Externally peer-reviewed.

Author Contributions: Concept--T.K., A.E., H.S.M., S.D., S.S.; Design--T.K., A.E., H.S.M., S.D., S.S.; Supervision - T.K., A.E., H.S.M., S.D., S.S.; Resources--S.D.; Materials--S.D.; Data Collection and/or Processing--T.K., A.E., H.S.M., S.D.; Analysis and/or Interpretation - T.K., A.E., H.S.M.; Literature Search - T.K.; Writing Manuscript - T.K.; Critical Review - T.K., S.S.

Conflict of Interest: No conflict of interest was declared by the authors.

Financial Disclosure: The authors declared that this study has received no financial support.

REFERENCES

(1.) Bajaj VK, Goyal A, Sharma G, Sharma KB, Gupta RS. Synthesis of CdS nanoparticle and reveal its effect on reproductive system of male Albino rats. BioNanoSci 2013;3(1):58-66. [CrossRef]

(2.) Zhang X, Li W, Yang Z, Toxicology of nanosized titanium dioxide: an update. Arch Toxicol 2015;89(12):2207-2217. [CrossRef]

(3.) Shi H, Magaye R, Castranova V, Zhao J, Titanium dioxide nanoparticles: a review of current toxicological data. Part Fibre Toxicol 2013;10:15 [CrossRef]

(4.) IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risk to Humans. Cobalt in hard metals and cobalt sulfate, gallium arsenide, indium phosphide and vanadium pentoxide. Lyon (FR): International Agency for Research on Cancer; 2006. (IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, No. 86.).

(5.) Bharali DJ, Khalil M, Gurbuz M, Simone TM, Mousa SA. Nanoparticles and cancer therapy: A concise review with emphasis on dendrimers. Int J Nanomedicine 2009;4:1-7.

(6.) Vinardell MP, Mitjans M. Antitumor activities of metal oxide nanoparticles. Nanomaterials (Basels) 2015;5(2):1004-21. [CrossRef]

(7.) Xue C, Wu J, Lan F, Liu W, Yang X, Zeng F, et al. Nano titanium dioxide induces the generation of ROS and potential damage in HaCaT cells under UVA irradiation. J Nanosci Nanotechnol 2010; 10(12):8500-7. [CrossRef]

(8.) Thevenot P, Cho J, Wavhal D, Timmons R.B, Tang L. Surface chemistry influence cancer killing effect of TiO2 nanoparticles. Nanomedicine 2008;4(3):226-236. [CrossRef]

(9.) Vamanu CI, Cimpan MR, Hol PJ, Sornes S, Lie SA, Gjerdet NR. Induction of cell death by TiO2 nanoparticles: Studies on a human monoblastoid cell line. Toxicol in Vitro 2008;22(7):1689-1896. [CrossRef]

(10.) Zhu Y, Eaton JW, Li C. Titanium dioxide (TiO2) nanoparticles preferentially induce cell death in transformed cell in a Bak/Bax- independent fashion. PLoSONE 2012;7(11):1-11. [CrossRef]

(11.) Luo YH, Chang LW, Lin P. Metal-Based Nanoparticles and the Immune System: Activation, Inflammation, and Potential Applications. BioMed Res Int 2015;143720 [CrossRef]

(12.) Thurn KT, Arora H, Paunesku T, Wu A, Brown EMB, Doty C, et al. Endocytosis of titanium dioxide nanoparticles in prostate cancer PC-3M cells. Nanomedicine 2011;7(2):123-130. [CrossRef]

(13.) Sarhan OMM, Hussein RM. Effects of intraperitoneally injected silver nanoparticles on histological structures and blood parameters in the albino rat. Int J Nanomedicine 2014;9:1505-1517.

(14.) Lopes VR, Vesa Loitto V, Audinot JN, Bayat N, Gutleb AC, Cristobal S. Dose dependent autophagic effect of titanium dioxide nanoparticles in human HaCaT cells at non cytotoxic levels. J Nanobiotechnology 2016;14:22. [CrossRef]

(15.) Halamoda KB, Chapuis BC, Guney-Ayra S, Juillerat-Jeanneret L. Induction of oxidative stress, lysosome activation and autophagy by nanoparticles in human brain-derived endothelial cells. Biochem 2012;441(3):813-821. [CrossRef]

(16.) Chen Y, Azad MB, Gibson SB. Superoxide is the major reactive oxygen species regulating autophagy. Cell Death and Differ 2009;16(7):1040-52. [CrossRef]

(17.) Levine B, Yuan J. Autophagy in cell death: an innocent convict? J Clin Invest 2005;115(10):2679-88 [CrossRef]

(18.) Glick D, Barth S, Macleod KF. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. Journal Pathol 2010;221(1):3-12. [CrossRef]

(19.) Krysko DV, Kaczmarek A, Vandenabeele P. Molecular Pathways of Different Types of Cell Death: Many Roads to Death. Phagocytosis of Dying Cells: From Molecular Mechanisms to Human Diseases; 2009:p.3-31.

(20.) Azad MB, Chen Y, Gibson SB. Regulaton of autophagy by reactive oxygen species (ROS): implications for cancer pregression and treatment. Antioxid Redox Signal 2009;11(4):777-90. [CrossRef]

(21.) Wang Y, Cui H, Zhou J, Li F, Wang J, Chen M, et al. Cytotoxicity, DNA damage, and apoptosis induced by titanium dioxide nanoparticles in human non-small cell lung cancer A549 cells. Environ Sci Pollut Res Int 2015;22(7):5519-30. [CrossRef]

(22.) Parka EJ, Yib J, Chungc KH, Ryud DY, Choie J, Park K. Oxidative stress and apoptosis induced by titanium dioxide nanoparticles in cultured BEAS-2B cells. Toxicol Lett 2008;180(3):222-9. [CrossRef]

(23.) Li XB, Xu SQ, Zhang ZR, Schluesener HJ. Apoptosis induced by titanium dioxide nanoparticles in cultured murine microglia N9 cells. Chinese Sci Bull 2009;54(20):3830-36. [CrossRef]

(24.) Zhao J, Bowman L, Zhang X, Vallyathan V, Young SH, Castranova V, et al. Titanium dioxide (TiO2) nanoparticles induce JB6 cell apoptosis through activation of the caspase-8/Bid and mitochondrial pathways. J Toxicol Environ Health A 2009;72(19):1141-9. [CrossRef]

Tugba KOTIL, Asli ERDOGAN, Hasan Serdar MUTLU, Sibel DOGAN, Seyhun SOLAKOGLU

Istanbul Universitesi, Istanbul Tip Fakultesi, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dali, Istanbul, Turkiye

(Iletisim kurulacak yazar/Corresponding author: tubakotil@msn.com)

Dergiye geldigi tarih/Date received: 02.01.2018--Dergiye kabul edildigi tarih/Date accepted: 07.02.2018
COPYRIGHT 2018 AVES
No portion of this article can be reproduced without the express written permission from the copyright holder.
Copyright 2018 Gale, Cengage Learning. All rights reserved.

Article Details
Printer friendly Cite/link Email Feedback
Title Annotation:ARASTIRMA/ RESEARCH
Author:Kotil, Tugba; Erdogan, Asli; Mutlu, Hasan Serdar; Dogan, Sibel; Solakoglu, Seyhun
Publication:Journal of Istanbul Faculty of Medicine
Date:Mar 1, 2018
Words:2662
Previous Article:THE ROLE OF 21-HYDROXYLASE DEFICIENCY IN THE PATHOGENESIS OF BEHCET DISEASE / BEHCET HASTALIGI PATOGENEZINDE 21-HIDROKSILAZ EKSIKLIGININ ROLU.
Next Article:EFFECT OF MULTIDISCIPLINARY BOARD ON THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF ENDOCRINE DISEASES / MULTIDISIPLINER KURULUN ENDOKRIN HASTALIKLARIN TANI VE...
Topics:

Terms of use | Privacy policy | Copyright © 2019 Farlex, Inc. | Feedback | For webmasters