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Sulforeduction and desulfurization reactions by thermophilic bacteria isolated from hydrothermal mud at las trincheras, Venezuela/Actividades sulforeductora y desulfurizadora por bacterias termofilas aisladas de lodos hidrotermales de las trincheras, Venezuela/Atividades de reducao de sulfato y dessulfurizacao por bacterias termofilas de lodos hidrotermais de las trincheras, Venezuela.

SUMMARY

A relevant and expensive process for refining crude oil is the elimination of sulfur atoms from organic molecules usually present in it or its derived products. For achieving such a goal, hydrodesulfurization reactions must be executed under severe temperature and pressure conditions, in the presence of metallic catalysts. A biotechnological alternative to solve this situation could be the use of bacteria endowed with appropriate enzymatic systems to perform the reactions under milder experimental conditions, at lower cost, and without catalysts. For such purposes, bacterial populations isolated from hydrothermal mud at Las Trincheras, Venezuela, were grown on chemically defined media complemented with hexane, heptane and dibenzothiophene (DBT) as carbon sources, and under anaerobic conditions they carried out sulfate reduction reactions. The enzymatic activity was detected on a wide range of temperatures (42-75[degrees]C) and it was stimulated by adding lactate to the media. An isolated strain (RD), Gram positive bacilli, used DBT as the sole carbon and sulfur source under anaerobic condition at 55[degrees]C. The DBT degradation (desulfurization) evaluated by gas chromatography without and with mass spectrography, was also achieved by cell free growing media previously used by the strain RD. This fact indicated that the DBT degrading enzymatic system can work in the extracellular medium, and the possibility exists that it could be secreted to the culture medium. Besides, in both systems, bacteria and cell free growing media, biphenyl was detected as the unique intermediary molecule in the DBT desulfurization reaction.

RESUMEN

Uno de los procesos de mayor relevancia y tosto en la refinacion del petroleo es la eliminacion de atomos de azufre en moleculas organicas constituyentes del mismo o de sus combustibles derivados. Para alcanzar tal fin, se requiere de reacciones de hidrodesulfurizacion (HDS) que deben tener lugar bajo condiciones severas de temperatura y presion, y con catalizadores metalicos. Una alternativa biotecnologiea a este proceso lo constituye el uso de bacterias con sistemas enzimaticos capaces de efectuar tales reacciones en condiciones experimentales de baja severidad, sin catalizadores metalicos y a mas bajo costo. A tales efectos, poblaciones bacterianas aisladas de lodos hidrotermales de Las Trincheras, Venezuela, incubadas en medios quimicamente definidos usando hexano, heptano y dibenzotiofeno (DBT) como fuentes de carbono, baio anaerobiosis, efectuaron reacciones de sulforeduccion. La actividad detectada en un amplio intervalo de temperaturas (42[grados]-75[grados]C) fue estimulada por la incorporacion de lactato al medio. Una cepa aislada (RD) de bacilos Gram positivos, utilizo DBT como fuente de carbono y azufre en cultivos anaerobicos a 55[grados]C. La degradacion (desulfurizacion) de DBT, evaluada por cromatografia de gases sin y con espectrometria de masa, fue tambien efectuada por el medio de cultivo libre de celulas (FLC), previamente utilizado por la cepa, indicando que el sistema enzimatico degradador de DBT puede funcionar extracelularmente y es probablemente excretado al medio de cultivo durante el crecimiento bacteriano. Tanto en el sistema bacterial como en el FLC, se detecto bifenilo como unico intermediario en el proceso de desulfurizacion del DBT.

RESUMO

Um processo relevante e custoso para o refinamento de petroleos pesados e a eliminacao de atomos de enxofre de moleculas organicas usualmente presentes naqueles ou em seus produtos derivados. Para alcancar tal meta, reacoes de hidrodessulfurizacao (HDS) devem ser executadas sob condicoes severas de temperatura, pressao e em presenca de canalizadores metalicos. Uma alternativa biotecnologica para solucionar esta situacao poderia implicar o uso de bacterias dotadas de sistemas enzimaticos apropriados capazes de efetuarem as reacoes sob condicoes de temperatura e pressao menos severas e em ausencia de canalizadores. Para esse efeito, populacoes bacterianas isoladas de lodo hidrotermal de Las Trincheras, Venezuela, foram cultivadas em meios quimicamente definidos suplementados com hexano, heptano e dibenzotiofeno (DBT), como fontes de carbono, e, sob anaerobiose, efetuaram reacoes de reducao de sulfato. A atividade enzimatica foi detectada num amplo intervalo de temperaturas (42-75[degrees]C) e, estimulada pela incorporacao de lactato ao meio de cultivo. Uma cepa isolada, bacilos Grato positivos, utilizou DBT como fonte exclusiva de carbono e enxofre em cultivos anaerobicos a 55[degrees]C. A degradacao de DBT (dessulfurizacao) pela bacteria foi avaliada atraves de cromatografia gasosa e espectometria de massas acoplada a cromatografia gasosa, e a reacao foi tambem alcancada pelo meio de cultivo livre de celulas, previamente utilizado pela cepa. Isso indica que o sistema enzimatico degradador de DBT pode funcionar extracelularmente e e provavelmente excretado para o meio de cultivo durante o crescimento bacteriano. Tanto no sistema bacteriano como no filtrado livre de celulas, foi detectado bifenilo como um intermediario no processo de dessulfurizacao do DBT.

Palabras clave / Bacterias / Desulfurizacion / Dibenzotiofeno / Termofilos /

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La capacidad de efectuar reacciones de sulforeduccion por bacterias esta bien documentada (Kim et al., 1996; Castro et al., 1999; Roychoudhury, 2004) y su importancia es obvia en el ciclo del azufre en la naturaleza (Le Fau et al., 1990; Madigan, 1998; Mohebali y Ball, 2008). El suelo constituye una fuente abundante de microorganismos con capacidad de degradar/transformar compuestos organicos de diferentes estructuras (Altamirano y Pozo, 2000). Para Venezuela, con sus abundantes recursos petroleros, serra importante la busqueda de cepas bacterianas capaces de utilizar como fuentes de carbono (C) y azufre (S) a compuestos organicos presentes particularmente en crudos pesados (Kim et al., 1996). Estos crudos constituyen una mezcla heterogenea de hidrocarburos alifaticos y aromaticos, muchas de cuyas moleculas incluyen atomos de S unidos covalentemente a su esqueleto carbonado. Estas moleculas se encuentran preferencialmente presentes en la fraccion conocida como asfaltenos, de las cuales una de las mejor estudiadas es el dibenzotiofeno (DBT), una molecula aromatica sulfurada (Galarraga y Perez, 1991; Mc Farland, 1999). La presencia de tales especies sulfuradas es indeseable debido a los altos costos requeridos para su eliminacion en productos derivados del petroleo y a los erectos contaminantes para los ambientes naturales originados despues de su combustion y la posterior precipitacion de lluvias acidas (Bubrenick et al., 1983; Ramson y Rivas, 1999). Una alternativa valida para la eliminacion de estos compuestos del petroleo o de sus derivados, o para sanear habitats contaminados con hidrocarburos, podria constituirlo el uso de bacterias capaces de utilizar tales moleculas como fuentes de C y S para sustentar su crecimiento (Kurita et al., 1971; Monticello y Finnerty, 1991; Konishi et al., 1997; Pineda-Flores y Mesta-Howard, 2001; Mohebali y Ball, 2008). La existencia de bacterias y hongos capaces de degradar estos compuestos sulfurados ha sido reportada en la literatura (Reuter et al., 1994; Tanimoto y Bak, 1994; Kim et al., 1996; Ming So y Young, 1999; Onodire-Yamada et al., 2001; Franzmann, 2002; Baldi et al., 2003). Varios trabajos sefialan la degradacion de DBT por diferentes generos de microorganismos, entre los que se reporta Gordona cepa CYKS1 (Rhee et al., 1998), Rhodococcus erithropolis (Izumi et al., 1994; Oda y Ohta, 2002; Yu et al., 2006), Desulfovibrio desulfuricans (Kim et al., 1990), Sulfolobus acidocaldarius (Kargi y Robinson, 1983), Brevibacterium sp. (van Afferden et al., 1990), Corynebacterium sp. (Omori et al., 1992), variados Mycobacterium sp. (Kayser et al., 2002; Li et al., 2003, 2005, 2007; Ishii et al., 2005), Sphingomonas sp. (Gai et al., 2007), y Bacillus subtilis (Oshiro et al., 2005). Tambien han sido postuladas las posibles vias de degradacion de compuestos sulfurados (Kodama et al., 1973; Kilbane, 1990; van Afferden et al., 1993; Lizama et al., 1995). El objetivo del presente trabajo fue demostrar la capacidad de cepas bacterianas, aisladas del manantial hidrotermal de Las Trincheras, para efectuar la remocion de atomos de S de moleculas aromaticas tipo dibenzotiofeno, usualmente presentes en crudos pesados y sus derivados.

Materiales y Metodos.

Material biologico

Muestras de lodos provenientes de pozos con temperaturas entre 55 y 60[grados]C fueron trasladadas en recipientes termicamente aislados, previamente desinfectados, desde el Centro Termal Las Trincheras, Estado Carabobo, Venezuela a los laboratorios ubicados en la Escuela de Medicina de Barbula, Universidad de Carabobo.

Crecimiento bacteriano

Caldo nutritivo (CN). Cantidades de Iodo colocadas sobre papel de filtro, previamente esterilizado por irradiacion con luz ultravioleta, fueron resuspendidas en 100ml de caldo nutritivo MO88 HIMEDIA, suministrado por Didacta, Caracas, Venezuela. La incubacion se efectuo por 24h a 55[grados]C, en aerobiosis y con agitacion constante. Posteriormente, alicuotas de 1ml fueron transferidas a 100ml de CN, bajo iguales condiciones y se siguio el crecimiento mediante la absorbancia a 540nm hasta 24h, registrandose, las 6-7 primeras lecturas a intervalos de ~2h. Alicuotas de este cultivo fueron trasferidas a cunas de agar y almacenadas a 4[grados]C hasta su posterior uso.

Medio I. Porciones de lg de lodo o alicuotas de 1ml provenientes de cultivos crecidos en CN, fueron transferidas a 12ml de medio I, el cual contenia los siguientes componentes (gx[l.sup.-1]): 0,013 Mg[Cl.sub.2]; 0,06 Ca[Cl.sub.2].2[H.sub.2]O; 0,5 K[H.sub.2]P[O.sub.4]; 1 NaCl; 0,01 Fe[(N[H.sub.4]).sub.2][(S[O.sub.4]).sub.2].6[H.sub.2]O; 7 [(N[H.sub.4]).sub.2]S[O.sub.4]; 4 lactato Na; 0,36 citrato Na.2[H.sub.2]O; y 1g de extracto de levadura; con pH 7,8. Las incubaciones se efectuaron entre 42 y 75[grados]C, en estufa, en anaerobiosis y sin agitacion, por 24-72h. En posteriores experimentos la totalidad de los componentes carbonados del medio I fueron reemplazados (medio minimo mineral, MM) por hexano (Hx), heptano (Hp) o dibenzotiofeno (DBT). Las condiciones de anaerobiosis fueron establecidas al cerrar los tubos de rosca con un tapon de algodon/gasa impregnado con unas gotas de pirogalol 1% y tapa de bakelita. Para detectar la actividad sulforeductora se agrego a cultivos paralelos 1ml de FeS[O.sub.4] 0,1M; la aparicion de una coloracion oscura de FeS era indicativo de sulforeduccion positiva (Mora y Morales, 2002).

Medios DBTs y DBT. Alicuotas de 1ml de cultivos bacterianos previamente crecidos en CN y en aerobiosis, fueron transferidas a 12ml de medio DBTs, el cual contenia medio MM y 3,3mgx[l.sup.-1] de dibenzotiofeno (17,9[micro]M) como unica fuente de C disponible para el crecimiento bacteriano bajo las condiciones establecidas para el medio I. Posteriormente, los sulfatos tambien fueron eliminados del medio salino, de tal manera que el DBT constituyo la unica fuente de C y S disponible para el crecimiento bacteriano; este medio denominado DBT presento pH 7,8. Para detectar la actividad sulforeductora/desulfurizadora, se implementaron dos incubaciones adicionales: un control positivo al cual se adiciono inoculo bacteriano, DBT y 1ml FeS[O.sub.4] y un control negativo al cual no se adiciono bacterias, pero si DBT y 1ml FeS[O.sub.4] (Daza, 2003).

Placas de Petri. Alicuotas provenientes de los cultivos bacterianos en CN y medio DBT fueron sembradas por extension sobre placas de agar cuenta estandar, incubandose hasta por 90h en anaerobiosis (camara Gas Pack) a 55[grados]C. Esto se llevo a cabo para determinar la morfologia macroscopica y microscopica de las bacterias aisladas (Daza, 2003).

Obtencion y procesamiento de filtrados libres de celulas (FLC)

Volumenes apropiados (4-8ml) de cultivos bacterianos crecidos por 0, 24 y 72h en medio DBT, fueron filtrados (con vacio) a traves de membranas microbiologicas (0,45[micro]m de diametro de poro) y 4ml de cada filtrado fue extraido con 4ml de tolueno. Los extractos organicos fueron analizados con cromatografia de gases (CG) y cromatografia de gases acoplada a espectrometria de masas (CG/MS), para la determinacion de DBT remanente.

Actividad degradadora de DBT por extractos libres de celulas

Alicuotas de 1ml de FLC provenientes de cultivos bacterianos en medio DBT fueron adicionadas a 12ml de medio DBT e incubadas de acuerdo a lo establecido arriba. Despues de 72h de incubacion se procedio a la extraccion de los FLC con tolueno.

Cromatografia de gases (CG)

Alicuotas de 0,5[micro]l de los extractos organicos de FLC fueron analizadas por cromatografia de gases empleando un cromatografo VARIAN 3800 con una columna Chromopack de 30m, con 0,25mm y 0,25[micro]m de diametro interno y espesor de capa, respectivamente. El equipo fue acoplado a un detector de ionizacion a la llama FID, (Hernandez, 2004; Gonzalez, 2004). La corrida se realizo con [N.sub.2] como gas de arrastre, a 150[grados]C y 7psi/min, durante 15min. Los resultados se tabularon y registraron graficamente. Mediante una curva de calibracion relacionando las unidades de area en funcion de la molaridad de DBT, se estimo la cantidad remanente de DBT (Gonzalez, 2004).

Cromatografia de gases acoplada a espectrometria de masas (CG/EM)

Alicuotas de 0,5[micro]l fueron inyectadas en un cromatografo de gases HP5890, serie II, dotado con un detector de masa 5971 y una columna HP-1, a una temperatura de horno de 40[grados]C por 15min. La rampa de calentamiento se efectuo por 3min entre 10 y 270[grados]C. Los resultados se registraron graficamente (Gonzalez, 2004).

Resultados

Crecimiento bacteriano

A fin de incrementar la biomasa y disponer de suficiente inoculo bacteriano para los experimentos, la muestra de 1g de lodo fue inoculada en caldo nutritivo bajo condiciones de aerobiosis y, posteriormente, alicuotas de tales cultivos fueron transferidas a caldo nutritivo, incubandose en las condiciones descritas. En presencia de medio I y aerobiosis, tanto la muestra de lodo como la poblacion bacteriana crecida en CN no efectuaron la reaccion de sulforeduccion; no obstante, en anaerobiosis, la reaccion fue detectada en medio I y en medio MM suplementado con hexano (Hx), heptano (Hp) o medio DBTs, a diferentes temperaturas y en ausencia o presencia de lactato (Tabla I). La reaccion fue evaluada cualitativamente por inspeccion visual de la intensidad de la coloracion oscura debida a la formacion de FeS en los cultivos. La reaccion fue evidente en las tres temperaturas ensayadas (42, 65 y 75[grados]C) al su ministrar al menos uno de los sustratos carbonados senalados. La maxima estimulacion se observo en el medio con Hx-DBT a 42 y 65[grados]C. El lactato estimulo la reaccion en todos los medios y temperaturas. Para constatar la viabilidad de las bacterias e incrementar la biomasa bacteriana capaz de efectuar reacciones de sulforeduccion, alicuotas de los cultivos a 65[grados]C fueron transferidas a caldo nutritivo e incubadas a 55[grados]C, en aerobiosis y agitacion. En la Figura 1 se muestra el crecimiento en CN de las bacterias provenientes del medio DBT, caracterizado por una fase de latencia (4-6h), un crecimiento exponencial hasta 24h y luego una fase estacionaria hasta 196h, sin evidencia de mortalidad. El aislamiento de colonias de este cultivo mostro un solo tipo de colonias circulares, brillantes, planas, de bordes rizados y amarillentas; la observacion microscopica evidencio bacilos Gram positivos (Figuras 2a, b). La cepa bacteriana aislada fue denominada RD. En estos experimentos iniciales el origen del sulfuro generado por los cultivos en medio DBTs no pudo atribuirse al DBT, debido a la presencia en el medio de sulfato ferroso amoniacal y de amonio. Para subsanar la situacion, el medio fue preparado omitiendo los sulfatos; de igual manera luego de las incubaciones respectivas se detecto la presencia de FeS, lo que demostro el uso del S del DBT por las bacterias. Esto indica que la cepa RD fue capaz de efectuar reacciones de sulforeduccion porque en el medio de cultivo habia sulfatos y las fuentes carbonadas, Hx, Hp y Lactato, las cuales no contienen S; en el medio DBT, carente de sulfatos, se detecto la presencia de sulfuro, el cual necesariamente debio provenir de la desulfurizacion del DBT. Alicuotas de estos cultivos transferidas a placas de agar cuenta estandar, si bienal principio mostraron colonias muy pequenas, al transcurrir el tiempo fueron progresivamente adquiriendo la morfologia caracteristica de las bacterias provenientes de cultivos en CN y posteriormente crecidas en agar cuenta estandar (Figuras 2c-f).

[FIGURA 1 OMITIR]

[FIGURA 2 OMITIR]

Degradacion de DBT por cultivos bacterianos

La Figura 3 y Tabla II muestran la determinacion, mediante CG, de DBT remanente en FLC proveniente de cultivos bacterianos en presencia de DBT como unica fuente de C y S. A tiempo cero (t= 0) de incubacion se evidencio una serial de 9 904 077 unidades de area (15,446[micro]M) con un tiempo de retencion de 12min, correspondiente a DBT (Figura 3a); a las 24h (3b) se observo una disminucion de DBT (2 448 304 unidades de area; 4,577[micro]M) y la aparicion de una nueva serial a los 9min, asignada a bifenilo, y a las 72h (3c) la senal de DBT se redujo a 184245 unidades (1,277[micro]M), lo cual representa una degradacion del 91,7% del DBT al inicio de la incubacion (Tabla II), mientras el bifenilo incremento considerablemente. Estos datos demuestran la desaparicion de DBT del medio de cultivo y a su vez aportan evidencia de uno de los compuestos, el bifenilo, implicados en el proceso metabolico y desulfurizacion del DBT por las bacterias. Mediciones del pH en los cultivos hasta por 190h de incubacion, indicaron variaciones entre 7,80 y 8,05. La incorporacion en el medio de cultivo de K[H.sub.2]P[O.sub.4] proporciono la capacidad amortiguadora del pH.

[FIGURA 3 OMITIR]

Finalmente, en la Figura 4 se muestran los cromatogramas obtenidos mediante CG/ EM, de FLC provenientes de cultivos bacterianos. El solvente puro utilizado mostro una serial a los 6,5min (a) la cual corresponde a tolueno; en el extracto a t= 0 de incubacion (b) se observo basicamente una serial a los 12,29min, correspondiente a DBT (con una abundancia superior a 200 000 unidades); a las 24h de incubacion (c) se evidenciaron tres senales, la primera a 6,5min correspondiente al tolueno utilizado como solvente extractor; la segunda a 10,2min correspondiente a bifenilo (abundancia ~30000 unidades) y la tercera a 12,3min asignada al DBT (abundancia ~30 000 unidades). A las 72h de cultivo (d) el bifenilo incremento su abundancia a 320 000 unidades, mientras el DBT fue <10000 unidades. Notese que la abundancia del tolueno en los cromatogramas a y c resulto ser muy similar, ~30 000 unidades, lo cual es de esperar pues el tolueno es adicionado como agente extractor a los FLC. La reduccion de la cantidad de DBT despues de 72h de incubacion fue >95%, mientras el bifenilo alcanzo las 320000 unidades, siendo inicialmente cero.

[FIGURA 4 OMITIR]

Degradacion de DBT por filtrados libres de celulas (FLC)

Posteriormente se realizaron experimentos a fin de evaluar la posible degradacion extracelular del DBT (Figura 5 y Tabla III). Alicuotas de filtrados libre de celulas (FLC) provenientes de cultivos bacterianos de 72h de incubacion en

medio DBT se incubaron con medio DBT sin previo uso por otras 72h a las condiciones ya establecidas. Paralelamente un sistema a t= 0 fue procesado para determinar la actividad degradadora de DBT por extractos de FLC mediante CG. En la Figura 5a se aprecia las dos senales detectadas a t= 0 de incubacion, la serial de 9min corresponde a bifenilo y la de 12min a DBT. La presencia de bifenilo a t= 0 en estos experimentos se justifica porque en los FLC provenientes de incubaciones previas, dicha molecula es el producto final del proceso biodegradativo. La presencia de DBT es obvia pues es incorporado por el medio DBT. A las 72h de incubacion, mientras la serial del DBT disminuyo en 91,1% (de 15,156 a 1,343[micro]M, Tabla III), la correspondiente a bifenilo aumento (Figura 5b).

Discusion

La presencia de poblaciones bacterianas provenientes de las aguas termales de Las Trincheras, consumidoras de hidrocarburos alifaticos (hexano y heptano) y aromaticos sulfurados (dibenzotiofeno; DBT), y que ademas efectuan reacciones de sulforeduccion, ha sido demostrada. Estas bacterias pueden considerarse como organismos aerobios facultativos por su capacidad de crecer en medios aerobicos (CN) y anaerobicos (medios I, DBTs y DBT). La curva de crecimiento de la poblacion bacteriana proveniente de medio DBT, crecida en medio CN, presento una fase de latencia y otra de crecimiento exponencial de 4-6h y 24h, respectivamente, mientras la fase estacionaria se prolongo hasta 196h sin aparente mortalidad, lo que demuestra la viabilidad de las bacterias despues de la incubacion en medio DBT. Las reacciones de sulforeduccion y desulfurizacion se detectaron a las 24h de incubacion en condiciones de anaerobiosis y en un intervalo de temperaturas relativamente amplio (42[grados]-75[grados]C). La estimulacion inducida por lactato en la intensidad de la reaccion podria explicarse ya que el lactato, una molecula mas facilmente degradable por las bacterias, suministraria el C para sustentar las necesidades metabolicas de las celulas, mientras el S seria suministrado por el DBT (Kurita et al., 1.971). Este ultimo actuaria como el unico aceptor de electrones durante el crecimiento bacteriano, originando [H.sub.2]S (Lizama et al., 1.995). Ademas, el bifenilo originado en la reaccion de desulfurizacion del DBT es una molecula muy refractaria a la biodegradacion, por lo que las celulas preferiran al lactato para satisfacer su necesidad de C. No obstante, en experimentos previos se constato que en medio DBT 17,9[micro]M, la poblacion bacteriana alcanzaba la fase estacionaria a las 72-90h de incubacion, pero la adicion de cantidades apropiadas de DBT a los cultivos cada 72h estimulo la division bacteriana y permitio su crecimiento por periodos mayores (240h), manteniendose el pH del cultivo en valores cercanos a 8, lo cual es indicativo de la utilizacion del C del DBT para sustentar los requerimientos metabolicos bacterianos (Hernandez, 2004). Ademas, en presencia unicamente de DBT, la acumulacion de bifenilo en el medio de cultivo fue constante y muy abundante, sin detectarse intermediarios a los tiempos ensayados. Pareciese que el DBT es directamente desulfurado a bifenilo y [H.sub.2]S. Kim et al., (1.990) senalan que en la desulfurizacion de DBT en anaerobiosis se produce bifenilo mercaptano, el cual es inmediatamente transformado a bifenilo por accion de una hidrogenasa, liberandose [H.sub.2]S. Al respecto, Brugna et al. (1.999) reportan evidencia de una hidrogenasa en la bacteria sulforeductora Desulfuromonas acetoxidans. En los presentes experimentos (CG y CG/MS) no fue detectado tal intermediario, situacion que podria implicar un sistema enzimatico propio de la cepa RD para la desulfurizacion de compuestos sulfurados.

[FIGURA 5 OMITIR]

La cepa aislada de medio DBT, un bacilo Grato positivo, transformo el compuesto aromatico a niveles de 70% a las 24h de incubacion, y a las 72h la degradacion alcanzo el 91%. El sistema enzimatico responsable de la degradacion de DBT fue capaz de realizar la transformacion en condiciones extracelulares, pues extractos libres de celulas provenientes de la cepa crecida en medio DBT, incubados con medio DBT sin previo uso, fueron capaces de efectuar la reaccion de desulfurizacion. Estos eventos fueron demostrados mediante la deteccion de DBT remanente en los sobrenadantes libres de celulas obtenidos de tales sistemas. A las 72h de incubacion, el sistema libre de celulas, redujo la cantidad de DBT en mas del 90%. No obstante, estos experimentos no descartan la posibilidad de que el sistema enzimatico degradador de DBT no pudiese funcionar intracelularmente, aunque los resultados indican que el sistema enzimatico responsable de la degradacion de DBT funciona extracelularmente, y que probablemente es excretado al medio de cultivo, para lograr degradar la molecula organica (DBT) presente en el mismo. Sin embrago, existe la posibilidad de que la actividad enzimatica presente en los medios pudiese originarse por lisis bacteriana, lo cual no fue evaluado. Este es un punto en discusion, ya que hay reportes indicativos de que la degradacion de DBT se efectua intracelularmente, mientras otros sostienen que la desulfurizacion ocurre en la interfase pared celular y medio extracelular, o membrana plasmatica-pared celular (Kayser et al., 1993; Oldfield et al., 1997; Patel et al., 1997; Kilbane y Le Borgne, 2004). Independientemente de donde actue el sistema enzimatico, las bacterias podrian incorporar productos sulfurados y carbonados a vias metabolicas que le asegurasen la sintesis de productos indispensables para satisfacer sus necesidades metabolicas.

De acuerdo a los resultados obtenidos, el DBT es transformado en bifenilo, acumulandose en el medio de cultivo e indicando que la via de degradacion seria la no destructiva y reductiva, la cual procede a traves de la remocion del S del DBT por ruptura de los enlaces C-S-C en la molecula, y el S se liberaria como [H.sub.2]S. La formacion de [H.sub.2]S se evidencio por la coloracion oscura desarrollada en los sistemas bacteriano y libre de celulas y por el fuerte y caracteristico olor generado por las incubaciones.

Estos resultados indican que la cepa bacteriana RD posee la maquinaria enzimatica necesaria para efectuar reacciones de sulforeduccion, usando hidrocarburos como unicas fuente de C y los sulfatos presentes en el medio de cultivo. Ademas, debe poseer la actividad desulfurizadora, pues en ausencia de sulfatos y usando DBT como unica fuente de C y S, efectuo la remocion del heteroatomo. Si se asume la intervencion del [H.sub.2] en el proceso, el DBT aceptaria electrones de este, reduciendose, y el bifenilo y [H.sub.2]S serian los receptores del hidrogeno oxidado.

La biodesulfurizacion (BDS) aventaja a la hidrodesulfurizacion (HDS) en varios aspectos. Mientras la HDS debe llevarse a cabo a altas temperaturas (200-450[grados]C), la BDS ocurre a bajas temperaturas (30-60[grados]C); HDS requiere altas presiones (150-200psig) y BDS ocurre a presion atmosferica; HDS requiere fuentes exogenas de hidrogeno y catalizadores metalicos, lo cual es innecesario en BDS. Ademas, en BDS no se generan productos colaterales que eventualmente incrementarian los costos de refinacion (Mohebali y Ball, 2.008). Finalmente, la molecula producto de la desulfurizacion, el bifenilo, es de un alto valor agregado, entre otros para elevar el octanaje en gasolinas. No obstante, la complementacion de ambas metodologias constituye aun una estrategia valida para la remocion de S en hidrocarburos y sus derivados.

Adicionalmente, disponer de organismos termofilos que realicen desulfurizaciones a temperaturas relativamente altas (55-65[grados]C) proporciona condiciones experimentales deseables respecto a los sistemas mesofilos (30-40[grados]C); las relativas altas temperaturas induciran una menor viscosidad del medio de reaccion, habra una mayor solubilizacion de los reactantes, se incrementara la velocidad de reaccion y se reducira al minimo la posibilidad de contaminacion microbiana (Gray et al., 2003; Soleimani et al., 2007).

Finalmente, el aislamiento de una cepa bacteriana pura, termofilica, degradadora de DBT, suministra la posibilidad de ser usada, al menos en primera instancia, para descontaminar habitats terrestres o acuaticos contaminados por derrames petroleros o por productos derivados de hidrocarburos. Adicionalmente, la presencia del sistema enzimatico activo en el medio extracelular, podria plantear su inmovilizacion para la desulfurizacion de productos provenientes del petroleo y otras fuentes, sin la necesidad de usar cultivos bacterianos o sistemas solubles libres de celulas.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen la colaboracion de Luis Amaiz y Dario Valbuena. Este trabajo fue financiado por la subvencion CDCH-UC (No. 1014-04); FACYT-UC (partida 4.07) y por el CIMA-UC, de la Universidad de Carabobo.

REFERENCIAS

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Oscar Valbuena. Licenciado en Biologia, Universidad Central de Venezuela (UCV). Ph.D. en Biologia Molecular, University of Pennsylvania, EEUU. Profesor, Universidad de Carabobo (UC), Venezuela. Direccion: Departamento de Biologia, Facultad de Ciencias y Tecnologia (FACYT-UC), Universidad de Carabobo, Venezuela, e-mail: ovalbuena@uc.edu.ve

Juan Carlos Pereira. Licenciado y M.Sc. en Quimica, UCV, Venezuela. Doctor en Quimica, Universidad de los Andes, Venezuela. Profesor, FACYT-UC, Venezuela.

Rebeca Daza. Licenciada en Quimica, UC, Venezuela.

Freddy Gonzalez. Licenciado en Quimica, UC, Venezuela.

Angelina Hernandez. Licenciada en Quimica, UC, Venezuela.

Monica Mora. Licenciada en Quimica, UC, Venezuela.

Graciela Morales. Licenciada en Quimica, UC, Venezuela.

Luis Medina, Licenciado en Biologia, UCV, Venezuela. Doctor en Biologia Celular, Universite de Grenoble, Francia. Profesor, Facultad de Ciencias de la Salud, UC, Venezuela.
TABLA I
SULFOREDUCCION
A DIFERENTES TEMPERATURAS Y
DIFERENTES COMPUESTOS CARBONADOS *

  Compuesto carbonado       Temperatura ([grados]C)

                             42     65     75

Hexano                       +      +      +
Heptano                      +      +      +
Dibenzotiofeno               +      +      +
Hexano + Lactato             ++     ++     ++
Heptano + Lactato            ++     ++     ++
Dibenzotiofeno + Lactato     ++     ++     ++
Dibenzotiofeno + Hexano     +++    +++     ++

* Las cruces indican la intensidad de la coloracion oscura producida
por el FeS. Un sistema control constituido por medio I
sin inoculo bacteriano (lodo) no desarrollo coloracion. Las
muestras de lodos (lg) se resuspendieron en 12ml medio MM
suplementado con los compuestos senalados, incubandose en
anaerobiosis, sin agitacion a las temperaturas indicadas.

TABLA II
DEGRADACION DE DBT POR BACTERIAS *

Tiempo de incubacion    DBT remanente    Tiempo de retencion
         (h)             ([micro]M) *           (min)

0                           15,446              12,05
24                           4,577              11,99
72                           1,277              11,97

* El DBT se determino por cromatografia de gases. Las cifras indican
el DBT remanente en el medio de cultivo, calculado mediante la curva
de calibracion obtenida por regresion lineal (Y = -691881+685981X;
r = 0,9978). Las incubaciones se efectuaron en 12ml medio DBT,
en anaerobiosis, sin agitacion y a 55[grados]C, por los tiempos
indicados.

TABLA III
DEGRADACION DE DBT POR FILTRADOS LIBRES
DE CELULAS (FLC) *

Tiempo de incubacion    DBT remanente    Tiempo de retencion
         (h)             ([micro]M) *           (min)

0                           15,156              12,00
72                           1,343              12,11

* El DBT se determino por cromatografia de gases. Las cifras indican
el DBT remanente en el medio de cultivo, calculado mediante la curva
de calibracion obtenida por regresion lineal (Y= -691881+685981X;
r= 0,9978). Medio DBT (12m1) se inoculo con 1ml de FLC proveniente
de cultivos bacterianos previos en medio DBT, incubdndose en
anaerobiosis, sin agitacion, a 55[grados]C, por los tiempos
indicados.
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Author:Valbuena, Oscar; Pereira, Juan Carlos; Daza, Rebeca; Gonzalez, Freddy; Hernandez, Angelina; Mora, Mo
Publication:Interciencia
Date:Jun 1, 2010
Words:6107
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