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Silenciamiento genico postranscripcional: mecanismo de defensa antiviral en plantas.

Silenciamiento genico postranscripcional. Caracteristicas generales

El silenciamiento genico postranscripcional (PTGS, del inglespostranscriptional gene silencing) es un fenomeno natural que ocurre en plantas, nematodos (Caenorhabditis elegans), moscas (Drosophila melanogaster) y, aunque ha emergido como un topico de interes general en los ultimos anos, la primera evidencia de este fenomeno se tuvo en 1928 cuando plantas de tabaco infectadas con Tobacco ringspot virus se recuperaron de la infeccion, sin que en aquel momento se supiera cual era el mecanismo por el cual la planta habia logrado recobrarse. En plantas, han sido descubiertas tres rutas del silenciamiento segun los analisis geneticos y moleculares. Todas estas vias involucran el corte del ARN doble cadena (ARNdc) en ARNs pequenos de 21 a 26 nucleotidos por una enzima ARNasa tipo III nombrada Dicer. Estos ARNs son conocidos como ARNs pequenos interferentes (siRNAs, del ingles short interfering RNAs) y microARNs (miRNAs, del ingles microRNAs). Ademas, las pequenas moleculas de ARN simple cadena son incorporadas en complejos efectores del silenciamiento, provocando la degradacion de todo ARN que complemente con las moleculas de 21 a 26 nucleotidos (Baulcombe, D., 2004).

Una de las tres rutas es la del silenciamiento por siRNA en el citoplasma (Hamilton y Baulcombe, 1999). Esta via es importante en celulas de plantas infectadas con virus donde el ARNdc puede ser un intermediario replicativo o una estructura secundaria caracteristica de virus con genoma ARN. En el caso de los virus ADN de plantas, el ARNdc puede ser formado por union de transcriptos complementarios que se superponen.

La segunda ruta es la del silenciamiento de ARNs mensajeros endogenos por miRNAs. Estos miRNAs regulan negativamente la expresion genica por apareamiento de bases a ARNs mensajeros especificos, que resulta tanto en el corte como en la detencion de la traduccion. Como los siRNAs, los miRNAs son ARNs pequenos de 21 a 24 nucleotidos producidos por el corte por Dicer de un precursor. Los miRNAs en plantas se identificaron como un subconjunto de la poblacion de ARNs pequenos, con las caracteristicas moleculares de los ARNs let-7 y lin-4 en Caenorhabditis elegans (Bartel, 2004): <<Los miRNAs son derivados de un precursor de ARN con secuencias repetidas invertidas con regiones de doble cadena parcial, y ellos hacen diana en un ARNm complementario de simple cadena. Sin embargo, existen diferencias entre los miRNAs de plantas y animales (Baulcombe, 2004).

La tercera ruta de silenciamiento de ARN en plantas esta asociada con la metilacion del ADN y la represion de la transcripcion. La primera evidencia de este tipo de silenciamiento fue el descubrimiento en plantas de que la introduccion de secuencias foraneas y ARNs virales guia a la metilacion del ADN en secuencias nucleotidicas especificas (Mette et al., 2000; Jones et al., 2001; Wassenegger et al., 1994): <<Ademas, la metilacion del ADN promovida por los siRNAs en plantas esta asociada a modificacion de histonas y, en levaduras de fision, a la formacion de heterocromatina y limite del centromero (Volpe et al., 2002; Zilberman et al., 2003). El papel del silenciamiento del ARN a nivel de cromatina es probablemente proteger el genoma contra danos causados por transposones (Baulcombe, 2004).

Proteinas hospedantes involucradas en el silenciamiento

En plantas, animales y hongos, las proteinas AGO han sido implicadas en los tres tipos de rutas de silenciamiento. Por ejemplo, en Arabidopsis thaliana, mutantes de AGO1 tienen afectaciones en las rutas de silenciamiento de ARN citoplasmatico y miRNA, y mutantes de AGO4 presentan problemas con el silenciamiento de la cromatina. Parece ser que las proteinas AGO son componentes del complejo efector del silenciamiento que une siRNA y miRNA (Baulcombe, 2004). Asi, la proteina AGO2 de Drosophila melanogaster une siRNA por medio de su dominio PAZ (siglas del ingles piwi-argonaute-zwille), y esta en el complejo ribonucleasa RISC (<<complejo de silenciamiento inducido por ARN>>, del ingles RNA-induced silencing complex) que corta el ARNm diana (Hammond et al., 2001; Lingel et al., 2003). Se piensa que esta proteina es la ribonucleasa <<slicer>> en RISC, segun experimentos con la proteina AGO2 de ratones (Liu et al., 2004). AGO1 es probablemente un componente de RISC en A. thaliana porque mutantes hipomorficos retienen la habilidad de acumular miRNA; pero el correspondiente ARNm blanco no es cortado (Vaucheret et al., 2004). En levaduras de fision, una proteina AGO es encontrada en el complejo de silenciamiento transcripcional inducido por ARN (RITS, del ingles RNA-induced transcriptional silencing complex) que interviene en la heterocromatinizacion (Verdel et al., 2004). En Tetrahymena, los siRNAs y un homologo de AGO se han encontrado en un complejo implicado en un mecanismo relacionado con el silenciamiento que guia al reordenamiento del genoma (Mochizuki et al., 2002; Taverna et al., 2002).

El papel de AGO en los complejos efectores del silenciamiento hace pensar que tal proteina se involucra en todos los mecanismos de ese tipo. Es probable que muchas, si no todas las proteinas AGO, esten relacionadas con el silenciamiento. Si este fuera el caso, al menos algunas de las diez homologas de AGO en el genoma de Arabidopsis thaliana deben estar asociadas con complejos efectores de silenciamiento de ARN. Es probable que RICS o RITS, que contienen proteinas AGO, silencien genes en celulas especializadas o en estadios particulares de desarrollo (Hunter et al., 2003).

Las diversas rutas de silenciamiento de ARN no deben estar completamente separadas. Algunas proteinas, por ejemplo AGO1 y zwille (AGO10), actuan en mas de una ruta. Los mutantes de AGO1 en A. thaliana tienen un fenotipo que indica defectos en las rutas citoplasmaticas de miRNA y siRNA (Fagard et al., 2000; Vaucheret et al., 2004). Las mutaciones en otro gen (hen1) relacionado con el silenciamiento indican superposicion en las diferentes rutas del silenciamiento. Mutantes de hen1 son defectuosos tanto en el silenciamiento de miRNA como siRNA citoplasmatico (Boutet et al., 2003).

La familia genica Dicer en A. thaliana tiene solo cuatro miembros, por tanto, si hay mas de cuatro rutas de silenciamiento que involucran proteinas AGO, algunas Dicer estaran activas en mas de una de ellas (Schauer et al., 2002; Baulcombe, 2004). Se conoce la funcion de dos proteinas Dicer: Dicer-like (DCL) 1 es requerida para la biogenesis de miRNA (Finnegan et al., 2003; Papp et al., 2003; Xie et al., 2004); DCL3, por su parte, produce siRNAs a partir de retroelementos y retrotransposones y es requerida para el silenciamiento de la cromatina (Xie et al., 2004). Los productos de DCL3 corresponden a una clase de siRNA que esta asociada con transposones y son mas largos (24 en lugar de 21 nucleotidos) que los productos DCL1 tipicos (Hamilton et al., 2002; Tang et al., 2003). El papel de otras dos proteinas Dicer, DCL2 y DCL4 ha sido mas dificil de definir. La primera ha sido involucrada en la produccion de siRNA viral, pero el fenotipo de perdida de funcion es solo una reduccion transiente en el nivel de siRNA en uno de varios virus probados (Xie et al., 2004). Por tanto, es probable que exista una redundancia funcional y que otras proteinas Dicer de A. thaliana esten involucradas en la produccion de siRNA. La funcion de DCL4 no se conoce.

Iniciacion y amplificacion de la senal de silenciamiento

Las ARN polimerasas dependientes de ARN (RdRps, del ingles RNA dependent RNA polymerases) son requeridas para la ruta citoplasmatica de silenciamiento de ARN y de la cromatina en Caenorhabditis elegans, hongos y plantas (Cogoni y Macino, 1999; Dalmay et al., 2000; Mourrain et al., 2000; Smardon et al., 2000; Sijen et al., 2001; Volpe et al., 2002; Xie et al., 2004), pero no, aparentemente, para la misma ruta en insectos o animales. Las RdRp muestran un motivo secuencia comun que esta lejanamente relacionado con el dominio catalitico de las ARN polimerasas ADN dependientes y es por eso probable que ellas sean un grupo antiguo de proteinas (Iyer et al., 2003). A. thaliana, C. elegans y Neurospora crassa tienen pequenas familias genicas de RpRds que, como las proteinas AGO, indican diversificacion funcional de las rutas de silenciamiento. En A. thaliana, las RpRds RDR1 y RDR6 (conocidas como SDE1 y SGS2, respectivamente) son utilizadas en la ruta de silenciamiento citoplasmatica de ARN que silencia transgenes y virus. Sin embargo, parece que esas proteinas tienen especificidad por diferentes ARN virales: mutantes de RDR6 en A. thaliana son hipersusceptibles a Cucumber mosaic virus; mientras que plantas de tabaco con reducidos niveles de RDR1 muestran incrementada susceptibilidad a Tobacco mosaic virus (Mourrain et al., 2000; Dalmay et al., 2001; Xie et al., 2001). Mutantes de RDR2 son defectuosos para la produccion de siRNA endogenos, incluyendo a aquellos que se corresponden con retroelementos. De tal forma, se ha propuesto que la proteina RDR2 podria ser parte de la ruta de silenciamiento de la cromatina (Xie et al., 2004).

En principio, la RpRd podria mediar los mecanismos de silenciamiento de ARN dependiente e independiente del cebador. El proceso independiente del cebador puede ser importante para la produccion de ARNdc a partir del molde de simple cadena, asi el silenciamiento puede ser iniciado con virus que infectan plantas o con ARNs transgenicos. Consecuentemente con este mecanismo independiente del cebador, ensayos in vitro con enzimas de tomate y Neurospora crassa demostraron que la RpRd cataliza la sintesis de ARNdc a partir de un molde de simple cadena (Schiebel et al., 1993; Makeyev y Bamford, 2002). De forma similar, en extractos de germen de trigo, el ARNsc puede ser copiado a ARNdc por una enzima no identificada, presumiblemente una RpRd (Tang et al., 2003). Sin embargo, no esta claro como la RpRd puede diferenciar el ARN transgenico blanco de los ARNs endogenos no silenciados. Quizas el ARN que es objeto del silenciamiento contiene caracteristicas <<aberrantes>> que esten ausentes de los ARNs <<normales>> no silenciados. Tambien se ha propuesto que el reconocimiento de un ARN aberrante podria estar dado por la carencia de caracteristicas que estan presentes en los ARNs normales (caperuza en 5' o cola de poli A en 3') (Baulcombe, 2004). En A. thaliana, la ausencia de la estructura caperuza en 5' proporciona un ARN que probablemente sea degradado por el mecanismo de silenciamiento causado por la RpRd (Baulcombe, 2004).

El segundo mecanismo de RdRp requiere que los siRNAs primarios de un virus, transposon o transgen, sean los cebadores en la sintesis de ARNdc dirigida por RpRd. La proteina RpRd QDE1 de N. crassa incorpora in vitro un ARN antisentido marcado de 20 nucleotidos en la cadena complementaria de ARNsc (Makeyev y Bamford, 2002). Este proceso dependiente del cebador es apoyado por evidencias geneticas indirectas en C. elegans y plantas, en los cuales el iniciador del silenciamiento proviene de parte del gen blanco. En estos sistemas, los siRNAs secundarios que se acumulan en el tejido silenciado son dependientes de proteinas RpRds y son derivados no solo de la region iniciadora sino, ademas, de regiones adyacentes en la secuencia blanco (Sijen et al., 2001; Vaistij et al., 2002). Ademas, los siRNAs en C. elegans corresponden solamente al extremo 5'del ARNsc, como debe esperarse si el siRNA primario antisentido ha sido extendido por la RpRd a su extremo 3'. Sin embargo, en Nicotiana benthamiana los siRNAs son tanto del extremo 5'como del 3' del iniciador sobre el ARNsc, por tanto, no pueden ser producidos por un mecanismo simple de comienzo sobre una unica especie de ARN (Voinnet et al., 1998; Vaistij et al., 2002). La explicacion mas probable es que el blanco del silenciamiento, como muchas partes del genoma de A. thaliana, es transcrito a partir de ambas cadenas (Yamada et al., 2003). Los siRNAs 3' secundarios podrian entonces resultar de la extension de un cebador siRNA sobre un molde ARN antisentido (Baulcombe, 2004).

Como resultado de los mecanismos mediados por la RpRd, una unica especie de ARN aberrante o molecula de siRNA primaria podria generar muchos ARNdc, los cuales podrian entonces silenciar incluso mas moleculas blancas. Este proceso de amplificacion es probablemente esencial en la defensa antiviral porque podria asegurar que la senal de silenciamiento se mantenga al ritmo de la replicacion y acumulacion del ARN viral. De manera similar, en la defensa del genoma, los pasos de amplificacion podrian asegurar que unas pocas moleculas de ARN del transposon activen la ruta del silenciamiento de la cromatina con la fortaleza suficiente para suprimir todas las copias del elemento a ser transpuesto. Ademas, las proteinas RpRd podrian ayudar al mecanismo de silenciamiento de ARN a transposones porque transcriptos con secuencias invertidas repetidas son facilmente amplificados (Martienssen, 2003).

Movilidad de la senal de silenciamiento

Junto con la amplificacion de la RpRd, la movilidad de la senal de silenciamiento es, probablemente, una caracteristica decisiva de un sistema de defensa antiviral. Una senal de silenciamiento movil podria moverse con el virus, o delante de el, para silenciar el ARN viral antes, o al mismo tiempo, con respecto al movimiento del virus dentro de la celula (Voinnet et al., 2000). En efecto, en plantas y C. elegans, los efectos de la senal de silenciamiento se extienden mas alla de aquellas celulas en las cuales la senal es iniciada y puede diseminarse sistemicamente a traves del organismo (Palauqui et al., 1997; Voinnet y Baulcombe, 1997; Timmons y Fire, 1998). Este efecto sistemico tiene especificidad en la secuencia nucleotidica correspondiente al ARNdc iniciador, indicando que la senal es o bien un ARN o tiene un componente de ARN. Se ha encontrado una evidencia en C. elegans que apoya esta idea: la proteina S1D1, la cual es requerida para el ARNi (forma de nombrar el silenciamiento en animales), es un transportador de ARNdc a traves de la membrana (Winston et al., 2002; Feinberg y Hunter, 2003).

Es improbable que el mecanismo de silenciamiento sistemico sea el mismo en plantas que en C. elegans. La senal de silenciamiento en plantas no tiene que cruzar ninguna membrana, porque la mayoria de las celulas en plantas, incluyendo las celulas del floema en el sistema vascular, estan conectadas por los plasmodesmos que son una continuacion del reticulo endoplasmatico (Haywood et al., 2002). Ademas, no se han identificado ninguna de las proteinas del hospedante que deben estar involucradas en el movimiento de esta senal de silenciamiento. Sin embargo, un analisis de la senal sistemica de un transgenico de la proteina verde fluorescente acoplada a un promotor especifico de floema indico que el mecanismo senal en plantas puede ser dividido en senal de corto alcance (hasta 15 celulas) y fases de alcance mayor extendiendose hasta algunos centimetros (Himber et al., 2003).

El movimiento de largo alcance, a diferencia de la senal de corto alcance, no es afectado por mutantes de perdida de funcion de RDR6 y es probable que la senal movil este conformada por siRNAs de 21 nucleotidos (Himber et al., 2003). En el caso de celulas infectadas con un virus se conoce que el siRNA esta presente tanto como ARN libre, como en complejos de bajo peso molecular que bien pueden estar debajo del limite de exclusion normal del plasmodesmo. Lo anterior apoya la idea de que los ARNs pequenos sean la senal movil para la senalizacion a corto alcance (Lakatos et al., 2004).

Una clase de siRNA mayor, 24 nucleotidos posiblemente generados por DCL3, ha sido propuesta como candidata para la senal de largo alcance de entrada al floema, porque las proteinas virales que bloquean el silenciamiento sistemico impiden, ademas, la acumulacion de siARN de 24 nucleotidos (Hamilton et al., 2002). Sin embargo, el silencia-miento sistemico es transmitido de plantas injertadas, en las cuales, tanto los siRNAs de 21 como los de 24 nucleotidos, son suprimidos por el supresor viral del silenciamiento HC-Pro (Mallory et al., 2001). Por lo tanto, es posible que otros ARNs del silenciamiento incluyendo ARNsc largos, ARNdc o siRNA, puedan ser moleculas senal, ya que alguno de ellos puede iniciar el silenciamiento si son introducidos en una celula con un blanco adecuado (Baulcombe, 2004). El limite de exclusion del plasmodesmo puede ser una barrera para el movimiento intercelular de complejos de alto peso molecular que contengan estos ARNs; pero es posible que ARNs libres o ARNs en complejos de bajo peso molecular sean moviles (Haywood et al., 2002). Se conoce que los viroides y el transcripto correspondiente a un ARNm para una proteina endogena son ARNs moviles en el floema de plantas (Ding et al., 1997; Kim et al., 2001).

Se ha propuesto que el movimiento de miRNAs y siRNAs endogenos puede jugar un papel en la regulacion de genes endogenos (Baulcombe, 2004). Por ejemplo, durante el desarrollo de la hoja los miRNAs miR165 y miR166 son reguladores negativos de genes que influyen en la polaridad de la hoja, y su distribucion y posible gradiente de expresion concuerdan con el de una senal movil (Emery et al., 2003; Juarez et al., 2004; Kidner y Martienssen, 2004). La existencia de muchos miRNAs y siRNAs en la savia floematica de la calabaza es una evidencia a favor de que muchos ARNs del silenciamiento endogenos son senales moviles (Yoo et al., 2004), y se ha detectado que una proteina del floema se une especificamente a la forma de simple cadena de estos ARNs.

Proteinas virales supresoras del silenciamiento

El silenciamiento de ARN en plantas previene la acumulacion de virus y, por tanto, estos ultimos han desarrollado varias estrategias para contrarrestar tal mecanismo de defensa. La medida de defensa primaria involucra proteinas supresoras del silenciamiento que son codificadas, tanto por virus con genoma ADN, como ARN (Voinnet et al., 1999). Estas proteinas probablemente evolucionaron independientemente en diferentes grupos de virus, puesto que son estructuralmente diversas y no presentan motivos de secuencia comunes. Un mecanismo secundario para contrarrestar el silenciamiento es ilustrado por la aparente resistencia de los ARN satelites y defectivos interferentes a la degradacion por siRNAs (Szittya et al., 2002; Wang et al., 2004). Parece que estos ARNs tienen estructuras secundarias protectoras, o estan compartimentados de tal forma que se ocultan del mecanismo de silenciamiento de ARN (Baulcombe, 2004).

El mecanismo de accion de dos proteinas virales supresoras del silenciamiento en plantas se conoce de forma exacta: p21 codificado por Beet western yellow virus (BWYV) y p19 codificado por Tomato bushy stunt virus (TBSV) (Dunoyer et al., 2004; Lakatos et al., 2004). En ambos casos, la proteina supresora viral se une y presumiblemente inactiva los siRNAs de tal forma que no puedan hacer diana en el correspondiente ARN viral. Para el caso de p19, la estructura cristalina de alta resolucion de proteinas de dos grupos diferentes de TBSV, combinada con datos moleculares y bioquimicos, indica de forma precisa como el silenciamiento es bloqueado. En forma de homodimero p19 se une a los ARN de pequeno tamano y, consecuentemente, los siRNAs o miRNAs no pueden ser incorporados en un RISC activo (Vargason et al., 2003; Ye et al., 2003; Dunoyer et al., 2004; Lakatos et al., 2004). En plantas de Arabidopsis thaliana que expresan p19, tanto miRNA como su complementario se acumulan; mientras que en las plantas control sin p19, el miRNA complementario es indetectable (Chapman et al., 2004; Dunoyer et al., 2004). Se piensa que el duplex de miRNA (miRNA y su complementario) es normalmente un precursor de corta vida de miRNA-RISC, pero es estabilizado en la presencia de p19 (Schwarz et al., 2003).

Existen otras proteinas virales supresoras del silenciamiento en plantas, pero no esta muy claro cual es el mecanismo de accion de las mismas. Se ha demostrado que la proteina HC-Pro de Tobacco etch virus es un factor contra el silenciamiento que interactua con rgs-CaM, una proteina de tabaco parecida a la calmodulina que, cuando es sobreexpresada en plantas, suprime el silenciamiento (Anandalakshmi et al., 1998, 2000). La proteina 2b de cucumovirus ha sido reconocida como supresora del silenciamiento y se ha sugerido que dicha proteina previene la diseminacion sistemica de la senal de silenciamiento (Brigneti et al., 1998; Guo y Ding, 2002).

Para el caso de p25 de Potato virus X (PVX), se conoce que esta proteina es un supresor del silenciamiento que impide el movimiento de la senal fuera de la primera celula infectada, en la cual la iniciacion del silenciamiento tiene lugar. Ademas, como p25 ha sido capaz de suprimir debilmente el silenciamiento en experimentos de agroinfiltracion, se ha sugerido que la inhabilidad del silenciamiento para diseminarse sistemicamente resulto de la habilidad de p25 para interferir con la produccion de la senal movil, paso que requiere de una ARN polimerasa ARN dependiente (Voinnet et al., 2000). Sin embargo, p25 de PVX es un supresor del silenciamiento relativamente debil comparado con los equivalentes de esta proteina en otros tres potexvirus Narcissus mosaic virus (NMV), Nandina virus X (NaMV) y Viola mosaic virus (VMV), todos los cuales fueron capaces de reactivar la traduccion de un transgen para la proteina verde fluorescente (GFP, del ingles green fuorescent protein) previamente silenciado (Voinnet et al., 1999).

Se ha demostrado que la proteina CP de carmovirus actua contra el silenciamiento (Qu y Morris, 2002). Mediante ensayos de agroinfiltracion se demostro que la supresion del silenciamiento por la CP de Turnip crinkle virus (TCV) previene la acumulacion de niveles de siRNAs detectables en las hojas infiltradas, sugiriendo que la CP de TCV funciona interfiriendo con el procesamiento de ARN de doble cadena (Qu et al., 2003).

Para el caso del begomovirus Tomato yellow leaf curl China virus (TYLCCNV), se ha demostrado que la proteina TrAP media la supresion del silenciamiento genico postranscripcional. Ademas, las mutaciones individuales en los residuos de cisterna 36, 38 y 46 eliminan la funcion supresora de TrAP. Se piensa que los tres residuos de cisterna dentro del posible motivo dedo de zinc son esenciales en TrAP para inducir necrosis y para actuar como supresor del PTGS (Van Wezel et al., 2002): <<Ademas, se ha encontrado que la proteina TrAP de ACMV actua como supresora del mantenimiento del silenciamiento en plantas de Nicotiana benthamiana (Voinnet et al., 1999).

En Citrus tristeza virus (CTV) existen tres proteinas supresoras del silenciamiento: p20, p23 y la CP. Tanto p20 como p23, pero no la CP, suprimen el silenciamiento en experimentos de agroinfiltracion, y fueron capaces de revertir el silenciamiento transgenico. La CP y p20, pero no p23, impiden la senal intracelular del silenciamiento de ARN. Esto sugirio que la supresion del silenciamiento en multiples pasos de la ruta de silenciamiento debe ser esencial para virus con grandes genomas como CTV (Lu et al., 2004).

Recientemente, se ha reportado por primera vez la identificacion de una proteina supresora del silenciamiento (Pns 10) codificada por un virus con genoma ARN de doble cadena, Rice dwarf phytoreovirus (perteneciente a la familia Reoviridae) (Cao et al., 2005). Ademas, la accion supresora de algunas proteinas de virus que infectan plantas ha sido probada en cultivos de celulas animales, y se ha demostrado que p19 de TBSV, la CP de TCV y p15 de Peanut clump virus (PCV), a diferencia de p25 de PVX, ejercen su funcion supresora (Dunoyer et al., 2004; Lakatos et al., 2004).

Ingenieria genetica para inducir silenciamiento

Desde que el fenomeno de silenciamiento genico postranscripcional fue descubierto se ha convertido en la forma mas exitosa de promover resistencia mediante el empleo de la ingenieria genetica (Goldbach et al., 2003).

La introduccion de transgenes o ARNdc en diferentes hospedantes puede activar el silenciamiento postranscripcional de genes homologos y/o transgenicos. Transgenes que inducen silenciamiento genico postranscripcional han sido reportados en plantas, donde es nombrado <<cosupresion>>, y en hongos, donde se conoce como <<quelling>>. La caracteristica comun es que guian a una disminucion especifica de los niveles de ARNm, tanto del gen homologo como del transgen introducido. De hecho, la mayoria de los fenomenos de silenciamiento fueron identificados por la caracteristica perdida de funcion del gen endogeno. En plantas, por ejemplo, la introduccion de un transgen para la chalcona sintasa o para la dihidroflavonol-4-reductasa produce plantas con reducida/carente pigmentacion floral (Chicas y Macino, 2001).

En plantas, se han empleado diferentes constr ucciones geneticas para inducir silenciamiento, tanto de genes propios como foraneos. En Arabidopsis thaliana, se ha probado el efecto del silenciamiento para los genes agamous, clavata3, apetala1 y perianthia, todos involucrados en la floracion. Estos genes se han introducido en la planta mediante la transformacion con Agrobacterium tumefaciens en construcciones con la secuencia del gen a silenciar en el sentido de la transcripcion, en orientacion antisentido, y con el gen en los dos sentidos separados por un segmento de ADN. Para los cuatro genes quedo demostrado que la construccion genetica con el gen en sentidos opuestos separados por un espaciador es la mas eficaz para la induccion de silenciamiento, variando el porcentaje de plantas silenciadas trangenicas, en dependencia del gen en cuestion (Chuang y Meyerowitz, 2000). Mas recientemente, se ha demostrado que el empleo de un intron funcional como espaciador potencia el efecto de esta construccion. Cada una de las cuatro construcciones geneticas capaces de inducir PTGS se han introducido en diferentes plantas de tabaco, A. thaliana, algodon y arroz con el objetivo de comparar su potencial como inductoras del silenciamiento, tanto de genes endogenos como foraneos, por ejemplo, gen viral. En todos los casos, las construcciones que contienen el intron resultaron ser las mas efectivas, logrando el silenciamiento de genes propios e inmunidad, en plantas de tabaco, a PVY. El empleo de un intron como espaciador generalmente proporciona de un 90 a un 100 % de plantas transgenicas independientes silenciadas (Smith et al., 2000; Wesley et al., 2001).

El empleo de una construccion genetica con la presencia de un intron ha demostrado ser efectiva tambien para lograr resistencia, en plantas de tomate, a Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), virus que ocasiona las mayores perdidas economicas en este cultivo a nivel mundial. Para una de las lineas transgenicas, las plantas de tomate mostraron ser inmunes a la infeccion con el virus, con ausencia de sintomas y replicacion viral (Fuentes et al., 2006). De esta forma, el silenciamiento genico postranscripcional, ademas de ser un mecanismo para la regulacion de genes endogenos y de defensa antiviral en plantas, puede ser empleado en la obtencion de plantas resistentes a enfermedades virales.

RECIBIDO: 06/2007

ACEPTADO: 12/2007

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Elvira Fiallo Olive

Facultad de Biologia, Universidad de La Habana. Correo electronico: elvira@censa.edu.cu
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Author:Fiallo Olive, Elvira
Publication:Revista Cubana de Ciencias Biologicas
Date:Aug 1, 2012
Words:6280
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