Printer Friendly

SINERGISMO IN VITRO DA ASSOCIACAO ENTRE PRALIDOXIMA E SULFONAMIDAS NA REATIVACAO DA ACETILCOLINESTERASE HUMANA RECOMBINANTE INIBIDA POR PARAOXON.

1 Introducao

A pralidoxima e o farmaco indicado no tratamento de intoxicacao por pesticidas e compostos organofosforados com atividade anticolinesterasica, atuando como antidoto para intoxicacao por agentes organofosforados, que se ligam ao sitio esteratico da acetilcolinesterase e que resulta inicialmente em uma inativacao reversivel da enzima (PETRONILHO, 2011).

Contraditoriamente, do ponto de vista do tratamento de intoxicacao em humanos, no entanto, a analise de nove ensaios clinicos randomizados, envolvendo 638 (seiscentos e trinta e oito) pacientes no total, demonstrou que a utilizacao de oximas, em destaque, a pralidoxima, mesmo sob diferentes regimes terapeuticos, nao se mostra mais eficiente em situacoes reais do que o placebo, concomitante a administracao de atropina e suporte ventilatorio durante a internacao (BLAIN, 2011).

A pralidoxima, laboratorialmente, tambem retarda o processo de 'envelhecimento' da acetilcolinesterase fosforilada, que pode se tornar irreversivelmente inibida. O efeito mais importante que se espera deste farmaco e o tratamento da paralisia dos musculos respiratorios. Pelo motivo de a pralidoxima ser menos efetiva no alivio da depressao respiratoria, a atropina e sempre requerida concomitantemente para bloquear o efeito da acetilcolina acumulada na membrana pos-sinaptica. A pralidoxima tem sido relatada como tendo a atividade de aliviar os sinais e sintomas muscarinicos como salivacao e broncoespasmo, mas esta acao e relativamente desimportante pois a atropina e mais adequada para este proposito terapeutico (POHANKA et al., 2009).

Foi relatado na literatura cientifica um derivado de benzenossulfonamida, 4- cloro-N-(4nitrofenil)benzenossulfonamida, que apresentou a efetiva capacidade de reativar a acetilcolinesterase inibida por compostos organofosforados em testes in vitro e in vivo em modelos animais, sendo testado contra o simulador de agente neurotoxico organofosforado diisopropilfluorofosfato. Tal composto foi adotado como modelo para a serie de compostos sintetizados neste presente trabalho (BHATTACHARJEE et al., 2015; ABBASI et al., 2014).

O teste in vitro realizado neste trabalho consiste basicamente em avaliar o sinergismo da associacao entre sulfonamidas e pralidoxima, indiretamente, por meio da verificacao da capacidade da enzima acetilcolinesterase processar o substrato acetiltiocolina, utilizando para este intuito o metodo espectrometrico de Ellman, que quantifica a velocidade de hidrolise do substrato devido a interacao do produto da hidrolise com o reagente acido ditiobisnitrobenzoico, cujo anion pode ser detectado espectrofotometricamente no comprimento de onda maximo (Xmax) de 412 nm (SILVA, 2012; PETRONILHO, 2011; RIBEIRO, 2009).

2 Materiais e Metodos

2.1 Solventes, reagentes e instrumentos

Foi utilizada enzima acetilcolinesterase humana recombinante do fabricante Sigma-Aldrich[R], expressa em celulas HEK 293, com as seguintes especificacoes: 1000 UN/mg (1 UN hidrolisa lprnol de acetilcolina por min). Nao foi utilizada solucao estabilizante de albumina de soro bovina, pois foram preparadas varias aliquotas submetidas a congelamento em freezer - 80[degrees]C, consumidos conforme a necessidade do experimento. Foi utilizado acido ditiobisnitrobenzoico (DTNB), iodeto de acetiltiocolina, iodeto de pralidoxima e paraoxon do fabricante Sigma- Aldrich[R] e foi utilizado o leitor de microplacas por espectroscopia do fabricante Molecular Devices[R], disponivel no laboratorio do Instituto de Biologia do Exercito. Foram utilizados derivados de sulfonamida disponiveis no Laboratorio de Sintese Organica do Instituto Militar de Engenharia na forma de solucao a 100 [micro]M em dimetilsulfoxido: N-(2-clorofenil)benzenossulfonamida, N-(4- fluorofenil)benzenossulfonamida, N(4-fluorofenil)-4-nitrobenzenossulfonamida, 4-cloro-N-(4-fluorofenil)benzenossulfonamida, N-(3- clorofenil)benzenossulfonamida, N-(3-cloro-2-metilfenil)benzenossulfonamida, 4-cloro-N-fenilbenzenossulfonamida, N-(2-clorofenil)-4-metilbenzenossulfonamida, N-(3-clorofenil)-4- metilbenzenossulfonamida, N-(2-hidroxietil)-4-metil-N-fenilbenzenossulfonamida e /N- (4nitrofenil)benzenossulfonamida.

2.2 Inibicao da acetilcolinesterase humana recombinante com paraoxon

Em cada poco de uma microplaca de 96 pocos foram adicionados 20 [micro]L de solucao de AChE (0,5 UN/mL), 5 [micro]L de solucao de DTNB (0,01 M). 100 [micro]L de tampao fosfato 0,1 M pH 7,4, 55 [micro]L de uma solucao de organofosforado, em concentracao variando de 10 [micro]M a 0,1 [micro]M de Paraoxon, sendo por ultimo realizada a adicao de 20 [micro]L de solucao de iodeto de acetiltiocolina 0,005 M.

2.3 Ensaio de atividade in vitro da reativacao da acetilcolinesterase humana recombinante inibida com paraoxon com derivados de sulfonamida em associacao com a pralidoxima por espectroscopia de ultravioleta-visivel

Conforme metodologia utilizada por Petronilho (2011) e Silva (2012), o teste de reativacao da acetilcolinesterase foi realizado atraves da adicao de 20 [micro]L de solucao de AChE (0,5 UN/mL), 5 [micro]L de solucao de DTNB (0,01 M), tampao fosfato 0,1 M pH 7,4 (ate perfazer 200 [micro]L no volume final), 100 [micro]L de solucao de paraoxon (2 [micro]M), e apos 60 min, e feita a adicao de 10 [micro]L da solucao de derivado de benzenossulfonamida a 100 [micro]M e de 10 [micro]L da solucao de pralidoxima a 100[micro]M e por ultimo foi adicionado 20 [micro]L de solucao de iodeto de acetiltiocolina 0,005 M, respectivamente, em cada um dos pocos de uma microplaca de 96 pocos, onde imediatamente apos a adicao do substrato, a microplaca foi levada ao espectrofotometro e a leitura foi iniciada com amostragem a cada 5 min em um tempo total de 15 min), fazendo-se uso do leitor de microplacas por espectroscopia. Foram realizados quatro repeticoes para cada poco (quadruplicata) e baseando-se na velocidade maxima obtida a partir da regressao linear de todos os pontos obtidos pela leitura das quadruplicatas no comprimento de onda disponivel no equipamento utilizado ([lambda] = 406 nm), foi calculado o potencial de interferencia das diversas substancias na atividade da acetilcolinesterase.

3 Resultados

Apos a realizacao do experimento de inibicao da acetilcolinesterase recombinante humana com paraoxon, foi verificada que a solucao de paraoxon a 2 [micro]M era suficiente para atingir inibicao total da atividade da enzima nas condicoes experimentais adotadas neste estudo e que a solucao de pralidoxima a 100 [micro]M era suficiente para reativar a atividade da acetilcolinesterase apos a inibicao. A partir dos resultados da avaliacao in vitro dos derivados de benzenossulfonamida como reativadores da acetilcolinesterase inibida por paraoxon, foi possivel verificar a atividade de moleculas estruturalmente semelhantes a molecula citada por Bhattacharjee et al. (2015). Os resultados se encontram descritos na Tabela 1.

4 Discussao

Todos os derivados de sulfonamida avaliados em associacao com a pralidoxima demonstraram capacidade de reativar a acetilcolinesterase previamente inibida por paraoxon nas doses avaliadas, embora em nivel muito inferior a pralidoxima, em alguns casos, o que permite inferir a necessidade de uma dose em concentracao maior, para atingir efeitos farmacologicos semelhantes.

Os derivados de sulfonamida testados em associacao a pralidoxima tem aumento significativo na taxa de reativacao normal quando apenas pralidoxima e utilizada, com destaque para os compostos N-(2-clorofenil)benzenossulfonamida e N-(4-fluorofenil)benzenossulfonamida, que provocaram um aumento de 27%, 22% e 27% na taxa de reativacao com sulfonamidas a 100 |iM em associacao com a pralidoxima a 100 |iM, respectivamente, conforme ja foi previamente demonstrado na Tabela 1.

5 Conclusao

Considerando a acetilcolinesterase como importante alvo terapeutico em funcao do seu envolvimento na manutencao do funcionamento do sistema nervoso central e periferico, fundamentalmente, nas terminacoes nervosas colinergicas, sugere-se continuar a buscar um mais completo entendimento da acao das sulfonamidas, que apenas recentemente tem recebido atencao no que se refere as suas possibilidades terapeuticas no tratamento de intoxicacao por compostos organofosforados.

E a primeira vez que estes derivados de sulfonamida, com estrutura baseada no recente trabalho de Bhattacharjee et al. (2015) sao testados em associacao com a pralidoxima para verificar seu potencial de sinergismo in vitro como potenciais agentes terapeuticos para o tratamento da intoxicacao por compostos organofosforados.

6 Referencias

ABBASI, M., AHMAD, S., REHMAN, A., RASOOL, S., KHAN, K., ASHRAF, M., NASAR, R. & ISMAIL, T. 2014. Sulfonamide Derivatives Of 2-Amino-1-Phenylethane As Suitable Cholinesterase Inhibitors. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, v.13, 739.

BHATTACHARJEE, AK. et al. 2015. Discovery of non-oxime reactivators using an in silicopharmacophore model of reactivators for DFP-inhibited acetylcholinesterase. European Journal Of Medicinal Chemistry, v. 1, n. 90: 209-220. 2015.

BLAIN, P. G. 2011. Organophosphorus poisoning (acute). BMJ Clinical Evidence, v.1: 2102-2119. 2011.

PETRONILHO, EC. 2011. Sintese e Avaliacao de Hidrazonas Como Inibidoras e Reativadoras da Acetilcolinesterase. 110f. Dissertacao de mestrado (Quimica)--Instituto Militar de Engenharia (IME), Rio de Janeiro, 2011.

POHANKA, M.; JUN, D. & KUCA, K. 2009. In vitro reactivation of trichlorfon- inhibited butyrylcholinesterase using HI-6, obidoxime, pralidoxime and K048. J Enzyme Inhib Med Chem., Hradec Kralove, v. 3: 680-683, jun. 2009.

RIBEIRO, T.S. 2009. Sintese e Avaliacao de Novas Oximas como Antidotos de Intoxicacao por Organofosforados. 108f. Tese de Doutorado (Quimica)--Instituto Militar de Engenharia (IME), Rio de Janeiro, 2009.

SILVA, G. R. 2012. Sintese e avaliacao de novas series de oximas e hidrazonas como potenciais reativadores da enzima acetilcolinesterase inibida por organofosforados neurotoxicos. 217f. Tese de Doutorado (Quimica)--Instituto Militar de Engenharia, Rio de Janeiro, 2012.

Romulo Santiago de Lima GARCIA *

Instituto de Defesa Quimica, Biologica, Radiologica e Nuclear--Secao de Defesa Biologica. Rio de Janeiro, Brasil.

* Autor para correspondencia: romulosantiagodelimagarcia@gmail.com

DOI: http://dx.doi.org/10.18571/acbm.131
Tabela 1: Teste de reativacao da acetilcolinesterase inibida por
paraoxon com os derivados de benzenossulfonamida em associacao com a
pralidoxima.

         MOLECULAS TESTADAS                TAXA DE REATIVACAO COM
                                       SULFONAMIDAS A 100 [micro]M EM
                                       ASSOCIACAO COM A PRALIDOXIMA A
                                                100 [micro]M

BRANCO                                               0%
PARAOXON 2[micro]M                                   0%
PRALIDOXIMA 100 [micro]M                            100%
N-(2-clorofenil)benzenossulfonamida
  [formula not reproducible]                        127%
N-(4-fluorofenil)benzenossulfonamida
  [formula not reproducible]                        122%
N-(4-fluorofenil)-4-
  nitrobenzenossulfonamida
  [formula not reproducible]                         75%
4-cloro-N-(4-
  fluorofenil)benzenossulfonamida
  [formula not reproducible]                        87,5%
N-(3 -clorofenil)benzenossulfonamida
  [formula not reproducible]                       81,25%
N-(3-cloro-2-
  metilfenil)benzenossulfonamida
  [formula not reproducible]                       72,92%
4-cloro-N-
  fenilbenzenossulfonamida
  [formula not reproducible]                       93,75%
N-(2-clorofenil)-4-
  metilbenzenossulfonamida
  [formula not reproducible]                       83,33%
N-(3-clorofenil)-4-
  metilbenzenossulfonamida
  [formula not reproducible]                       93,75%
N-(2-hidroxietil)-4-metil-N-
  fenilbenzenossulfonamida
  [formula not reproducible]                       63,26%
N-(4-nitrofenil)benzenossulfonamida
  [formula not reproducible]                       45,84%
COPYRIGHT 2017 Universidade Federal Fluminense
No portion of this article can be reproduced without the express written permission from the copyright holder.
Copyright 2017 Gale, Cengage Learning. All rights reserved.

Article Details
Printer friendly Cite/link Email Feedback
Author:Garcia, Romulo Santiago de Lima
Publication:Acta Biomedica Brasiliensia
Date:Jul 1, 2017
Words:1613
Previous Article:UTILIZACAO DE METILFENIDATO, LISDEXANFETAMINA E MODAFILINA COMO DROGAS AMPLIADORAS DO CONHECIMENTO: ESTUDO DO PERFIL DE DISPENSACAO EM UMA FARMACIA...
Next Article:TETANO: RELATO DE CASO.
Topics:

Terms of use | Privacy policy | Copyright © 2019 Farlex, Inc. | Feedback | For webmasters