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Respuesta inmunitaria en tuberculosis y el papel de los antigenos de secrecion de Mycobacterium tuberculosis en la proteccion, patologia y diagnostico. Revision.

INTRODUCCION

Durante la ultima decada, en todo el mundo ha aumentado el numero de casos de tuberculosis de una manera preocupante. Estimados de la Organizacion Mundial de la Salud (OMS) refieren que en 2005 hubo 8,8 millones de nuevos casos de TB, de los cuales 7,4 millones en Asia, Africa subsahariana y que la TB causo la muerte de 1,6 millones de personas, entre las cuales 195.000 infectadas por el VIH (1,2). El letal sindrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), el cual es caracteristico por el establecimiento de infecciones oportunistas y por la aparicion de un tipo agresivo de sarcoma de Kaposi fue reportado por primera vez en mayo de 1981 (3). La epidemia de SIDA ha sido responsable de la activacion de TB latente y se ha asociado con emergencia de casos de TB resistente a los farmacos utilizados de rutina. Finalmente, la eficacia tan variable de la vacuna y la ausencia de un metodo diagnostico rapido, sensible y especifico hacen de la enfermedad un reto para los medicos responsables del tratamiento de estos pacientes, por tal razon, es de gran importancia contar con antigenos apropiados para ser usados en pruebas confiables de diagnostico precoz (4). Otro problema emergente es la farmacorresistencia en TB, la cual se define como los casos de TB, generalmente pulmonar, que excretan bacilos resistentes a uno o mas de los medicamentos antituberculosos. Si el paciente no ha recibido tratamiento previo, se le denomina resistencia primaria (5). En los pacientes con historia de tratamiento anterior, de mas de un mes de duracion, la resistencia bacteriana se denomina resistencia adquirida o secundaria. El termino multirresistente (TB-MR) define los pacientes que excretan bacilos resistentes a varios medicamentos, especialmente a los dos de mayor efectividad, como son Rifampicina (R) e Isoniazida (H). La OMS estima que alrededor de 50 millones de personas estan infectados con cepas de M. tuberculosis resistentes a las drogas anti-tuberculosas. Acorde con los datos de los estudios de resistencia a drogas antituberculosas aportados por el Programa Global de la OMS, los paises que no aplican la estrategia de supervision del tratamiento o DOTS (Directly Observed Therapy Short Course) cuyos programas de control son ineficientes en sus acciones presentan las mayores tasas de MDR/TB, representando una amenaza para el control de la TB en sus paises al diseminar cepas de bacilos resistentes, para los cuales resultan ineficaces las drogas existentes en la actualidad para tratar los enfermos en esta situacion. La bacteria multirresistente ha sido detectada en 17 paises del mundo, entre los que estan Argentina, Peru, Ecuador, Chile, Estados Unidos, Reino Unido, Espana, Rusia. El brote comenzo, en una provincia de Sudafrica asociado a pacientes VIH-positivos (5).

El Boletin Epidemiologico de la Organizacion Panamericana de la Salud para 1998, publico un reporte sobre el control de la TB en America, en el cual destaca la importancia del desarrollo y la puesta en practica de la vigilancia de la farmacorresistencia en TB (5). Los resultados de los estudios de resistencia primaria a drogas antituberculosas realizados en los paises de la Region, aunque aun no alarmantes, evidencian sin embargo, algo totalmente comprobado a escala mundial y es que cuando los programas son eficientes en sus acciones de control y aplican la estrategia del tratamiento supervisado o DOTS desde hace cierto numero de anos, las tasas de prevalencia de resistencia a los medicamentos y en especifico la multiresistencia son muy bajas, no constituyendo por lo tanto un problema para el control de la TB en sus respectivos paises, una situacion totalmente distinta se presenta en paises que no aplican la estrategia DOTS, (5). El informe sobre el control de la TB de la Organizacion Mundial de la Salud (WHO) del ano 2007 reporto que el numero de casos de multirresistencia al tratamiento de TB aumento con los casos de pacientes VIH-positivos para el ano 2005 (1). Finalmente la WHO sugiere que solo la prevencion con buenos esquemas iniciales y con supervision estricta del tratamiento, es la mejor manera de evitar el tener que enfrentarse al delicado, dificil y costoso problema de la multirresistencia (1).

Hoy dia, el cultivo especifico para M. tuberculosis permanece como el metodo estandar para el diagnostico de la infeccion, sin embargo se trata de una tecnica dispendiosa y demorada. Asi, las decisiones terapeuticas, siempre urgentes frente a una infeccion que amenaza la vida del paciente, pueden ser inaceptablemente postergadas, mientras se aguarda el reporte de un cultivo. Hasta ahora la unica prueba rapida para detectar la micobacteria es la identificacion directa de bacilos acido-alcohol resistentes, en extendidos de diversas secreciones corporales. Sin embargo, como metodo unico de diagnostico paraclinico, la baciloscopia no posee un perfil satisfactorio de sensibilidad y especificidad, sobre todo en los casos de infecciones no cavitantes.

Las pruebas utilizadas para el diagnostico de TB incluyen ademas de la baciloscopia y el cultivo, la intradermoreaccion a la tuberculina que ha sido utilizada y aceptada por mas de 85 anos. A esta prueba se le cuestiona la pobre especificidad contra M. tuberculosis aunque cada vez mas se realizan estudios con proteinas recombinantes purificadas que ha demostrado mayor especificidad de especie en la prueba de intradermoreaccion (6). Otra posibilidad diagnostica interesante es la deteccion de material genetico de la micobacteria, mediante tecnicas de amplificacion genetica basadas en el uso de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) (6). La utilidad de esta prueba es mayor cuando la baciloscopia es positiva, circunstancia en la cual la especificidad y sensibilidad son superiores a 95%. Sin embargo, cuando la baciloscopia es negativa, la sensibilidad se reduce entre 40% y 70%. Si bien el valor diagnostico de las pruebas geneticas rapidas es indiscutible, su aplicabilidad en la practica clinica diaria depende del valor pronosticador que posean (6).

Entre la pruebas inmunologicas estan el uso de los anticuerpos, para realizar diagnostico de TB a traves de pruebas serologicas. En los ultimos anos, un alto numero de investigadores han orientado sus esfuerzos a disenar nuevas pruebas diagnosticas y a mejorar el rendimiento de los metodos serologicos. Estos metodos de diagnostico de TB se han venido realizando con el fin de lograr un maximo en la sensibilidad y especificidad para la deteccion de pacientes infectados con el bacilo de la TB, tanto en ninos como en adultos (7-9). La principal ventaja de estos es que no se necesita de una prueba clinica proveniente del sitio de la infeccion. Ademas permite obtener resultados en un corto periodo de tiempo, lo cual permite la aplicacion de un tratamiento lo mas pronto posible. Igualmente, este tipo de prueba no requiere que el paciente asista de nuevo a la consulta para chequear la evolucion de la respuesta, como es el caso de la prueba de la tuberculina. La principal desventaja que presentan las pruebas serologicas, es la variabilidad de respuesta de los anticuerpos frente a un antigeno, que puede darse en la poblacion mundial. Nuestro grupo y los grupos de Ginsberg AM, 1998 y Bothamley G, 1995 han reportado la realizacion de combinaciones de tanto isotipos como de antigenos que permiten conseguir aumentar la sensibilidad de los metodos serologicos, los cuales pueden mostrar una sensibilidad suficientemente alta para la deteccion de pacientes con infecciones tuberculosas. (8-10).

Se ha postulado que la forma heterogenea de reconocimiento del antigeno entre diferentes personas mas que el reconocimiento de un antigeno en particular, es la clave de la respuesta humoral en la TB. La sensibilidad de la prueba depende tambien de la fase de la enfermedad y de la presencia de la micobacteria en el esputo ya que los casos cronicos y con cultivo positivo muestran mayor sensibilidad en las pruebas serologicas (11). Se ha reportado la caracterizacion y disponibilidad de varios antigenos especificos de M. tuberculosis en el diagnostico serologico, los cuales detectan por arriba del 85% de los casos de TB positivos por frotis, pero la sensibilidad disminuye en los casos de TB con frotis negativo, ademas de que la mayoria de los antigenos caracterizados tienen sensibilidad y especificidad mas bajas en pacientes coinfectados con HIV (10, 11). El antigeno de 38 kDa ha sido frecuentemente estudiado, este esta utilizado como componente en tres pruebas inmunocromatograficas comercialmente disponibles, cuyas sensibilidades varian del 16% al 80% dependiendo de la poblacion estudiada y del resultado de la baciloscopia (11). Otros antigenos que han sido estudiados en pruebas serologicas son CFP, ESAT, MPT-63 y MPT-64. ESAT y CFP son dos antigenos recombinantes que se han utilizado para medir inmunidad celular y humoral contra el bacilo tuberculoso (12). Muchos de estos antigenos han demostrado buena sensibilidad y especificidad para identificar pacientes con TB pulmonar (12).

La seguridad diagnostica de una prueba depende del antigeno y del isotipo utilizado, asi como de la poblacion estudiada. Se ha reportado una especificidad de 97-99% para medir IgG contra antigenos recombinantes 38 kDa y 16 kDa mientras que para los antigenos nativos disminuye a 81%, lo que puede ser resultado de la reactividad cruzada con antigenos nativos de micobacterias ambientales; igualmente la seguridad diagnostica medida por los valores predictivos positivo y negativo es mayor cuando se utilizan antigenos recombinantes. En lo que respecta a isotipos de inmunoglobulinas la sensibilidad es mayor en las pruebas que se mide IgG y es baja con IgA e IgM (10, 12).

En relacion con el desarrollo de metodos de diagnostico alternativos, nuestro grupo ha realizado estudios recientes de metodos con la utilizacion de la saliva para medir la IgA secretora contra antigenos de M. tuberculosis (13). Tambien hay estudios sobre la deteccion de antigenos secretados en orina en la fase inicial de la enfermedad y que serian buenos candidatos para detectar infeccion activa; todos estos metodos han sido reportados como utiles para evaluar, con la posibilidad de desarrollar metodos de diagnosticos pocos invasivos y rapidos (14).

ETIOPATOGENIA DE LA INFECCION POR M. tuberculosis

La TB causada por M. tuberculosis es considerada como una infeccion bacteriana cronica, caracterizada por la formacion de granulomas en los tejidos comprometidos y relacionada con hipersensibilidad mediada por celulas (15). Aunque los pulmones son los organos afectados por excelencia, se considera que es una entidad sistemica, cuya evolucion natural conduce a un sindrome cronico de deterioro, que en caso de no ser tratada adecuadamente o de abandonar el tratamiento, la patologia es mas severa y puede conllevar a la muerte. M. tuberculosis es un bacilo delgado, acido resistente, de forma ligeramente curvada, con una longitud que oscila entre 1 y 4 micras. Al microscopio, los conglomerados bacilares adquieren una forma caracteristica, descrita como "en cuentas de rosario" y las propiedades estructurales de la pared bacteriana hacen que sea poco vulnerable a la accion de los agentes antimicrobianos de uso corriente y a los mecanismos de defensa naturales del hospedero (15).

La constitucion de la pared celular de M. tuberculosis es una de las mas complejas entre los microorganismos conocidos. Es dos veces mas gruesa y fuerte que la de los germenes Gram negativos y constituye una verdadera coraza lipidica, dificilmente penetrable, que otorga a la micobacteria su tipica resistencia a la accion del alcohol y los acidos (15). Los principales componentes de dicha pared son peptidoglicanos y acidos micolicos, unidos entre si por medio de enlaces covalentes, D-arabino-D-galactan. Ademas, posee un alto contenido de glicolipidos, en particular a-a'-trehalosa dimicolato (TDM) y a-a'-trehalosa monomicolato (TMM). La organizacion de estos componentes acidos en la pared celular bacteriana determina ciertas caracteristicas de permeabilidad limitada, de manera que la mayoria de agentes antimicrobianos son incapaces de atravesar la pared. Por otro lado, esta fuerte coraza, en muchos sentidos es similar a la capsula de las esporas, protege a la micobacteria de las fluctuaciones ambientales y le permite subsistir por tiempo prolongado en los tejidos. La pared es tan importante para la viabilidad de la bacteria, que la isoniacida, uno de los agentes antituberculosos mas efectivos, actua inhibiendo la sintesis de acidos micolicos, evento que conduce a la desintegracion de esta estructura.

M. tuberculosis posee propiedades de adaptacion que permiten diferenciarla de otras bacterias. En primer lugar, se trata de un parasito estricto y por ello, la transmision es directa de persona a persona; por otra parte, puede permanecer en un estado bacteriostatico dentro de las celulas infectadas por largos periodos, ya que no posee toxinas y en tercer lugar, crece en condiciones aerobias, lo que determina que el grado de proliferacion difiera, segun las presiones parciales de oxigeno de los tejidos infectados; la baja tasa de replicacion explica la tendencia a la cronicidad y por ultimo, la micobacteria posee numerosos antigenos capaces de inducir respuestas inmunologicas variables, que contribuyen al dano tisular (15).

SUSCEPTIBILIDAD FRENTE A LA INFECCION POR M. tuberculosis

La respuesta inmunitaria controla, pero no elimina al patogeno. La falta de una respuesta inmunitaria apropiada, da como resultado una TB aguda activa. En la mayoria de los casos de infeccion por M. tuberculosis, el individuo permanece asintomatico y no infeccioso. Esta latencia clinica a menudo se extiende durante toda la vida del individuo. Sin embargo, la reactivacion de la infeccion latente puede ocurrir en respuesta a perturbaciones de la respuesta inmunitaria, produciendo enfermedad activa. La infeccion por VIH, la diabetes mellitus, el tratamiento con corticosteroides, el envejecimiento y el abuso de drogas u alcohol, aumentan el riesgo potencial de reactivacion de enfermedad latente (15).

Los mecanismos por medio de los cuales en algunos individuos se logra una respuesta inmunitaria suficiente para contener la infeccion micobacteriana, mientras que en otros, esta es ineficaz y permite la progresion de la enfermedad hacia TB clinicamente manifiesta, aun no han sido esclarecidos. Los datos de algunos estudios epidemiologicos sugieren la posible existencia de factores geneticos, teniendo en cuenta que la enfermedad afecta con particular intensidad a ciertos grupos familiares y raciales (16).

En animales de experimentacion se han identificado genes especificos que determinan una mayor susceptibilidad a la infeccion; por ejemplo, los ratones con una deficiencia congenita del receptor para interferon gamma (IFN-[gamma]), son muy susceptibles a la infeccion tuberculosa, los animales homocigotos para dicho defecto genetico experimentan una forma mucho mas agresiva de la enfermedad (17). La importancia del IFN-[gamma] tambien ha sido puesta de manifiesto en pacientes con alteraciones geneticas del receptor de IFN-[gamma](IFN-[gamma]R), al mostrar que estas personas tienen una gran susceptibilidad a infecciones diseminadas y que los monocitos y/o macrofagos (MN/ M[FI]) no pueden ser activados adecuadamente (17). La diseminacion es consecuencia de una falla en la formacion de granuloma, debido a que no hay produccion de las citocinas, principalmente Factor de Necrosis Tumoral-alfa (TNF-[gamma]) y quimiocinas involucradas en este proceso. Ademas de las alteraciones geneticas en el IFN-[gamma]R, otros estudios han demostrado que las alteraciones geneticas de la subunidad p40 de IL-12 y de una subunidad de su receptor provocan una deficiente produccion de IFN-[gamma]facilitando las infecciones diseminadas por micobaterias (17). Adicionalmente, la deficiencia de otros genes tal como el Nramp ha sido tambien asociada a la susceptibilidad o resistencia a padecer de TB (18).

PATOGENIA DE LA TUBERCULOSIS

Periodo Primario o Tuberculosis Primaria

La historia natural de la TB es compleja. La infeccion primaria ocurre en personas sin inmunidad especifica, generalmente ninos sanos y adultos jovenes quienes no habian estado anteriormente expuestos a M. tuberculosis. La adolescencia es la edad de mayor riesgo. La enfermedad primaria se desarrolla dentro de los primeros cinco anos de la infeccion inicial, la cual estimula a la inmunidad especifica, demostrada por el surgimiento de una respuesta cutanea positiva al derivado proteico purificado del cultivo de M. tuberculosis o PPD (18).

La habilidad de M. tuberculosis para mantener una infeccion cronica y causar enfermedad en un subgrupo de aquellos sujetos infectados, depende de sus productos (factores de virulencia) que capacitan al microorganismo para entrar y sobrevivir indefinidamente dentro de las celulas fagociticas mononucleares, ademas por subvertir los mecanismos celulares antimicrobianos (15, 16). Esta infeccion primaria puede evolucionar hacia: 1) la cura (hay una cura bacteriologica), 2) la estabilizacion (foco latente), permanece asi durante meses, anos, incluso durante toda la vida del individuo, no hay cura bacteriologica, ya que hay bacilos virulentos enquistados en las lesiones, pero por diversas circunstancias puede ocurrir una reactivacion y evolucionar hacia el periodo secundario o posprimario o 3) la generalizacion precoz inmediata, donde ocurre una diseminacion bacilar por via linfatica o hematica a todo el organismo, produciendo lesiones tuberculosas en diversos organos, siendo la lesion en los organos linfaticos una constante. Puede darse un proceso agudo en aquellos individuos que presenten baja resistencia, hay diseminacion de los bacilos hacia diversos organos dando lugar a lesiones uniformes (con el mismo estado evolutivo) produciendose una TB miliar aguda o lesiones exudativas tipo neumonia o meningitis. Tambien puede evolucionar como un proceso moderado, en individuos donde hay resistencia parcial, la diseminacion linfohematica es de pocos bacilos, dando lesiones polimorficas en diversos organos, tipicas de TB nodular y TB perlada (15, 16).

Periodo Posprimario o Tuberculosis Secundaria

La diseminacion del bacilo ocurre por via canalicular (bronquios y bronquiolos en el pulmon, tumulos renales en el rinon, conductos galactoforos en la glandula mamaria, etc). Las lesiones se asientan en un solo organo (aquel lesionado en el periodo primario), por lo tanto se le denomina TB cronica de organo. Generalmente se observan lesiones caseosas o reblandecidas, con formacion de ulceras o nodulos (15, 16). Esta forma puede estabilizarse, sin compromiso inmediato de la vida del individuo. Pero como consecuencia de la perdida total de la resistencia (inmunosupresion) puede evolucionar hacia una generalizacion aguda tardia, diseminandose el bacilo por via linfohematica, con compromiso de los nodulos regionales. Son caracteristicas la TB miliar tardia y la TB acinosa galopante (15, 16).

RESPUESTA INMUNITARIA FRENTE A LA INFECCION POR M. tuberculosis

La inmunidad innata en tuberculosis

El descubrimiento de familias de proteinas receptores de superficie como son los receptores de reconocimiento de patrones (PRRs), los cuales estan presentes en los linfocitos B, MN/M[FI] y en la celulas dendriticas son afines con las estructuras invariables de patogenos (PAMPs) (19). Los PRRs en estas celulas, desde el punto de vista funcional, pueden ser secretados, endociticos o de senalizacion (receptores toll-like: TLR). El descubrimiento de la familia de proteinas receptores TLR, en la respuesta inmunitaria, ha ofrecido nueva luz sobre el vinculo entre inmunidad innata e inmunidad adaptativa. Hay evidencia que sugiere que, los TLR juegan un papel importante en la activacion de las celulas inmunes por los patogenos, incluyendo M. tuberculosis. Se ha reportado que la induccion de IL-12 y la actividad promotora in vitro de la sintetasa del oxido nitrico (NO[S.sub.2]) por la lipoproteina micobacteriana 19 kDa es dependiente del TLR2 humano. Se ha reportado que M. tuberculosis puede actuar via TLR2 y TLR4 humanos, a traves de un enlace especifico (19). Estudios recientes demostraron que tanto M. tuberculosis como antigenos propios de la micobacteria tales como lipoarbinomanan y la lipoproteina de 19 kDa inducen la expresion y secrecion de ciertos peptidos antimicrobianos a traves de TLR's en celulas epiteliales de pulmon, los cuales son capaces de eliminar a la micobacteria. Sin embargo, se observo que cepas avirulentas no inducen la expresion de estos peptidos antimicrobianos. Es posible que la presencia de estos peptidos antimicrobianos este ligada a factores de resistencia natural y pueda variar entre individuos debido a polimorfismos geneticos (20). Tambien ha sido reportado que el antigeno 38 kDa a traves de TLR2 y TLR4, induce las vias de activacion de ERK1/2 y p38 MAPK, las cuales juegan un papel esencial en la expresion de (21). Estos receptores que se expresan sobre las celulas dendriticas tanto de ratones como de humanos interactuan con M. tuberculosis y generalmente se asocian con la molecula CD14 para producir senales intracelulares que conducen a la activacion de la inmunidad innata a traves de la secrecion de citocinas y quimiocinas muy importantes, tanto en la inflamacion, como en la regulacion de la respuesta inmunitaria adaptativa (20).

[ILUSTRACION OMITIR]

M. tuberculosis persiste en los macrofagos dentro de un granuloma en los huespedes infectados. El granuloma esta constituido de macrofagos y celulas gigantes, celulas T, celulas B y fibroblastos. En las infecciones latentes, se desconoce el estado de actividad de la bacteria dentro del granuloma o tuberculo (3, 6). La diseminacion es consecuencia de una falla en la formacion de granuloma, debido a que no hay produccion de las citocinas (principalmente TNF-[alfa]) y quimiocinas involucradas en este proceso. En este caso, el IFN-[gamma] exogeno no tiene la capacidad de activar a los MN/M[FI] que son el habitat preferido de la micobacteria, y como consecuencia pasan a ser celulas permisivas dentro de las cuales se multiplica la micobacteria (15, 17). El microorganismo puede estar en un estado inactivo sin replicarse, replicandose activamente pero limitado por la respuesta inmunitaria, o metabolicamente alterado con ciclos replicativos infrecuentes o limitados. La alteracion de la respuesta inmunitaria puede resultar en la reactivacion y replicacion del bacilo, con necrosis y dano al tejido pulmonar. La respuesta inmunitaria es capaz de prevenir la enfermedad activa en la mayoria de las personas, pero no elimina la infeccion. El microorganismo ha desarrollado mecanismos para evadir la respuesta inmunologica mediada por celulas. A pesar de que se ha pensado que el primer evento en el alveolo es la fagocitosis de M. tuberculosis por los MA, tambien se ha sugerido que inicialmente la micobacteria esta en contacto e infecta a las celulas epiteliales alveolares, como una alternativa para evadir las agresiones del medio y escapar de los MA. En el macrofago, la funcion fagolisosomal en la infeccion por M. tuberculosis se encuentran algo afectada. Dentro del lisosoma existen enzimas hidroliticas potentes capaces de degradar todo un rango de macromoleculas, incluyendo microbios. Estas enzimas actuan optimamente en un pH acido (4,5-5,0; mantenido por la bomba de protones dependiente de ATP, las H+-ATPasas vacuolares), a condicion de encontrarse dentro de un medio intralisosomal (22). Por su capacidad de producir cantidades significativas de amoniaco, el bacilo tuberculoso puede evadir el ambiente toxico dentro de la vacuola lisosomal, inhibiendo el fagolisosoma y disminuyendo la potencia de las enzimas intralisosomales a traves de la alcalinizacion del medio. Dos enzimas que pertenecen al metabolismo del amoniaco, la ureasa micobacteriana y la glutamino-sintetasa, han sido asociadas a la interrupcion de la fusion fagolisosomal y a la sobrevida micobacteriana (22). Otro mecanismo mediante el cual las micobacterias patogenas son capaces de inhibir la fusion de los fagosomas y lisosomas esta asociado a la liberacion bacteriana de derivados sulfatados a partir de una glicoproteina de su pared (trehalosa 2-sulfato), que detiene la maduracion del lisosoma en el estadio de endosoma temprano. Tambien la retencion de la proteina de cubierta que contiene aspartato y triptofano (TACO) en el fagosoma previene la fusion con los lisosomas maduros (23).

Estudios realizados en sangre periferica y linfocitos bronquio alveolares (LBA) de pacientes con TB han demostrado que la infeccion por M. tuberculosis induce una disminucion de la poblacion de linfocitos T V[gamma]9+/V[delta][2.sup.+] en pacientes con TB, en comparacion con sujetos sanos y pacientes con enfermedades granulomatosas como la sarcoidosis (24), esto como consecuencia de la apoptosis inducida por la via de Fas/Fas ligando de los linfocitos TV[gamma][9.sup.+]/V[[delta][2.sup.+] reactivos a antigenos de M. tuberculosis (24). Este mecanismo de apoptosis de los linfocitos T [gamma] [delta]ha sido explotado por M. tuberculosis como un mecanismo de evasion de la respuesta inmunitaria (25).

La elevada produccion de oxido nitrico (NO) por los macrofagos activados es un mecanismo antimicrobiano potente. Estos fagocitos, bajo la activacion por agentes apropiados tales como el IFN-[gamma] y TNF-[gamma], generan NO e intermediarios reactivos de nitrogeno (RNI-relacionados) via NO[S.sub.2] usando L-arginina como sustrato. La actividad de estos oxidos de nitrogeno toxicos en la defensa del huesped ha sido bien documentada, tanto in vitro como in vivo, particularmente en el sistema murido (26). En el raton, los RNI juegan un papel protector en la infeccion tuberculosa aguda y cronica persistente. Se ha detectado inmunohistoquimicamente un elevado nivel de expresion de NO[S.sub.2] en macrofagos obtenidos por lavado pulmonar alveolar de individuos con TB pulmonar activa. Ademas, se ha observado que el nivel de NO exhalado aumenta en los pacientes con TB (26).

El papel del oxigeno toxico (ROI) en el control de la infeccion micobacteriana permanece en controversia ya que no se ha confirmado su habilidad para matar a M. tuberculosis. Ademas, las micobacterias son capaces de evadir su efecto toxico de diferentes maneras. Por ejemplo los componentes micobacterianos lipoarabinomanan (LAM) y el fenolicoglicolipido-I (PGL-I) son potentes destructores de los radicales de oxigeno (20). Asimismo, los sulfatidos micobacterianos interfieren con el mecanismo antimicrobiano dependiente de radicales de oxigeno del macrofago (25, 26).

La inmunidad adaptativa en tuberculosis

La respuesta a la infeccion por micobacterias es el ejemplo clasico de una respuesta inmunitaria mediada por celulas a un parasito intracelular facultativo. La respuesta celular en la TB es generada cuando los linfocitos T [CD4.sup.+] ([alfa][beta]TCR) reconocen antigenos de M. tuberculosis presentados por los M[FI] en el contexto de moleculas MHC II. Estos antigenos provienen del fagosoma, el cual constituye el habitat preferido de la micobacteria al mismo tiempo que tienen facil acceso a la via de las moleculas MHC II, de manera que pueden ser acoplados y presentados a los linfocitos T [CD4.sup.+] (15, 17). Como resultado de esto, los linfocitos T[CD4.sup.+] son activados y empiezan a producir IFN-[gamma], una citocina de gran importancia por su capacidad de incrementar la funcion microbicida de los M[FI]. Por otra parte, otra citocina, la IL-1 producida por M[FI], promueve la produccion de IL-2 y la expresion del receptor para IL-2 (IL-2R) con la subsecuente expansion clonal de los linfocitos T [CD4.sup.+], asi como tambien la IL-12 producida por M[FI] (15, 17).

En humanos, algunas evidencias experimentales sugieren que los linfocitos [CD4.sup.+] pueden tener ademas una funcion citolitica, particularmente en la respuesta inmunitaria en el pulmon (15, 17). Ademas de los linfocitos [CD4.sup.+] y las celulas NK, otra fuente importante de IFN-[gamma]la constituye los linfocitos T CD8+ ([gamma][beta]TCR), los cuales reconocen antigenos micobacterianos en el contexto de moleculas MHC I o CD1 de las celulas dendriticas, y ademas, tienen funciones citotoxicas sobre las celulas infectadas a traves de un mecanismo dependiente de granulos. Lo cual implica el reconocimiento por las celulas [CD8.sup.+] de los antigenos presentados por las APC en el contexto de moleculas MHC I o CD1 conllevando esto a la activacion del linfocito, la produccion de IFN-[gamma], la sintesis y produccion de granulos que son secretados al espacio intercelular y que, posteriormente, entran a la celula infectada para ejercer su accion citolitica (15, 17).

Las moleculas CD1 son moleculas presentadoras de antigenos no polimorficas; el Grupo I de moleculas CD1 incluyen CD1a, b y c, mientras el Grupo II incluye CD1d. Las moleculas CD1 tienen similitud estructural con las moleculas MHC clase I, con un puente no covalente de [beta]2-microglobulina en ambas moleculas. Sin embargo, el puente de CD1 es mucho mas profundo y mucho mas hidrofobico que las moleculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad clase I y II (MHC-I y MHC-II). Los CD1 presentan lipidos y glicolipidos a las celulas T. Las celulas T CD1-restringidas son a menudo CD4-8- o [CD8.sup.+], pero un estudio reciente indico que CD1 podria tambien presentar antigeno a las celulas T [CD4.sup.+] (27). Este estudio ofrecio la primera evidencia de una respuesta de memoria de las celulas T a un antigeno CD1-restringido en sujetos PPD+ expuestos a M. tuberculosis (28). Las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) de estos sujetos proliferaron a un glicolipido isoprenoide, en contraste a las PBMC de sujetos PPD- y esta proliferacion fue inhibida por anticuerpos anti-CD1c (27). Las funciones efectoras de celulas [CD8.sup.+] CD1-restringidas incluyeron la produccion de IFN-[gamma]y actividad citotoxica, pero el objetivo de estas celulas in vivo pudiera no ser los M[FI]. Los datos in vitro indican que las celulas dendriticas pueden ser infectadas con M. tuberculosis y quiza las celulas CD1-restringidas sirvan para monitorear este reservorio de infeccion (28).

En la inmunidad contra las micobacterias estan implicados diferentes grupos de celulas T, incluyendo las celulas T [CD4.sup.+] alfa/beta ([alfa]/beta]), las celulas T [CD8.sup.+] alfa/beta ([alfa]/beta]) y las celulas T gamma/delta ([gamma]/[delta]) (16, 19, 28). Datos recientes muestran una fuerte correlacion entre la produccion de interferon gamma (IFN-[gamma]) en las celulas T [gamma]/[delta]y la manifestacion de TB pulmonar primaria, lo cual es consistente con la hipotesis de que estas celulas tienen un efecto inmune protector en la infeccion (29). Las celulas T [CD8.sup.+], han mostrado ser protectoras en contra de M. tuberculosis en el raton. Los datos obtenidos por experimentacion sugieren que el modo primario de accion de estas celulas es la secrecion de citocinas, mas que una actividad litica directa de las celulas [CD8.sup.+] (29, 30).

CITOCINAS EN TUBERCULOSIS

El control inmunologico de la infeccion por M. tuberculosis esta basado en una respuesta Th1. La produccion de IL-12 es inducida (despues de la fagocitosis de M. tuberculosis), por los M[FI] y celulas dendriticas, las cuales inducen el desarrollo de una respuesta [T.sub.H]1 con produccion de IFN-[gamma] (17,31). La importancia de IL-12, en el control de la infeccion por M. tuberculosis se puede observar en el raton deficiente del gen-IL-12p40. Cuando estos ratones se infectan, muestran una carga bacteriana importante y una disminucion del tiempo de sobrevida en relacion con los ratones del grupo control. Esto probablemente se debe a, una reduccion sustancial en la produccion de IFN-[gamma]. Los humanos con mutaciones en los genes IL-12p40 o en el receptor de IL-12 presentan una disminucion en la produccion de IFN-[gamma] a partir de celulas T y son mas susceptibles a la diseminacion de BCG y a las infecciones por M. avium (31). Existe evidencia de que la vacuna DNA-IL-12 podria reducir sustancialmente el numero de bacterias en el raton con una infeccion tuberculosa cronica, sugiriendo que la induccion de esta citocina pudiera ser un factor importante en el diseno de una vacuna antituberculosa (32).

El IFN-[gamma] es clave en el control de la infeccion por M. tuberculosis. Esta citocina es producida por las celulas [CD4.sup.+] y [CD8.sup.+] durante la infeccion tuberculosa y por las celulas citocidas naturales (NK). Recientemente, se ha reportado la produccion de IFN-[gamma] dependiente de IL-12 en los M[FI] alveolares infectados con micobacterias. El raton deficiente en IFN-[gamma](knock-out, GKO) es mas susceptible a M. tuberculosis virulentos (33). Estudios in vitro con celulas mononucleares de pacientes con infecciones micobacterianas causadas por BCG, M. avium, M. abscessus y otras micobacterias atipicas han demostrado la existencia de alteraciones geneticas que incluyen mutaciones puntuales, deleciones y sustituciones en los genes que codifican las subunidades del IFN-[gamma]R (IFN-[gamma] R1 y R2), generando proteinas no funcionales que impiden la activacion de los MN/M[FI], lo cual determina la susceptibilidad a infecciones diseminadas causadas por patogenos intracelulares (34). La diseminacion es consecuencia de una falla en la formacion de granuloma, debido a que no hay produccion de las citocinas (principalmente del TNF-[alfa]) y quimiocinas involucradas en este proceso. En este caso, el IFN-[gamma] exogeno no tiene la capacidad de activar a los MN/M[FI](34, 35). El efecto de la falta IFN[gamma] es el crecimiento sin control del bacilo en los organos del raton GKO, y aunque se forman granulomas, estos se vuelven rapidamente necroticos. En estos ratones la activacion de los M[FI] es defectuosa y la expresion de NO[S.sub.2] es baja, factores que posiblemente contribuyan en gran medida a la susceptibilidad (35). En tuberculosis, la IL-12 tambien ha sido detectada en granulomas (36).

M. tuberculosis, es un potente inductor de IL-12 y debido a que la produccion de IFN-[gamma] es dependiente de IL-12, la respuesta de IFN- [gamma] es detectada siempre en huespedes infectados (37). Aunque la produccion de IFN-[gamma], por si sola es insuficiente para el control de la infeccion por M. tuberculosis, se requiere de esta citocina para tener una respuesta protectora a este patogeno. El IFN- [gamma] es producido tanto por sujetos PPD positivos sanos como por enfermos. Si bien, la produccion de IFN-[gamma] puede variar mucho entre sujetos y algunos estudios sugieren que los niveles de IFN-[gamma] estan disminuidos en pacientes con TB activa (37), la medicion unicamente de esta citocina puede no ser un correlato confiable de respuesta inmunitaria protectora. De hecho, un estudio reciente mostro que M. tuberculosis puede impedir a los M[delta] responder adecuadamente al IFN-[gamma]. Esta capacidad de M. tuberculosis para limitar la activacion de los M[delta] por el IFN-[gamma] sugiere que la cantidad de IFN-[gamma] producida por las celulas T, no es tan predictiva del resultado como lo es la habilidad de las celulas para responder a esta citocina (35, 37).

La presencia de respuesta Th2 y de IL-4 en TB esta sujeta a controversia. Sin embargo, la deteccion de IL-4 es variable y aunque algunos reportes indican que existen varias respuestas Th2 en la enfermedad tuberculosa (38), esto no ha sido fehacientemente demostrado.

Se ha reportado que aunque exista una respuesta inmunitaria Th1 deprimida, no existe incremento en una respuesta Th2 de las PBMC en pacientes tuberculosos. La elevada expresion de IFN-[gamma] se detecta en granulomas dentro de nodulos linfaticos de pacientes con linfadenitis tuberculosa, pero solo se ha detectado una pequena cantidad de IL-4 mRNA (35). Estos resultados y otros indican que al parecer en humanos no existe una respuesta Th2 asociada a la TB. En el raton BALB/c, mas susceptible que el raton C57BL/6 a M. tuberculosis, no se produce una respuesta Th2 consistente, aun cuando su resistencia pueda estar aumentada por IL-12 exogena. No se ha observado tampoco un cambio a una respuesta Th2 en los ratones GKO o IL-12p40-deficientes infectados con M. tuberculosis. Estos datos sugieren que la ausencia de una respuesta Th1 a M. tuberculosis no necesariamente promueve una respuesta Th2, y que es la deficiencia de IFN-[gamma] la que evita el control de la infeccion y no la presencia de IL-4 u otras citocinas Th2 (35). En un estudio de expresion de genes de citocinas en los granulomas de pacientes con TB avanzada mediante hibridizacion in situ, IL-4 fue detectada en 3/5 partes de los pacientes, pero nunca en ausencia de expresion de IFN-[gamma] (35). Los granulomas examinados en este estudio corresponden a pacientes con enfermedad tuberculosa avanzada y representan esencialmente un fracaso del sistema inmunologico para contener la infeccion. La presencia o ausencia de IL-4 no se correlaciona con un resultado de mejoria clinica o en diferencias en las etapas del granuloma o en su patologia (35, 36).

El TNF-[alfa] se requiere para generar la respuesta granulomatosa y para una inmunidad mediada por celulas efectiva. Sin embargo, en grandes cantidades, puede producir fiebre, perdida de peso, debilidad muscular y necrosis en los pulmones (39). En modelos animales, la ausencia de TNF-[gamma] impide cualquier control del crecimiento de M. tuberculosis. La eliminacion intracelular de M. tuberculosis esta mediada por la produccion de NO inducida por el TNF-[gamma], sin esta induccion M. tuberculosis crece sin control. Sin embargo el exceso del TNF-[gamma] puede ser, como ya se menciono, en extremo danino. Si en el modelo experimental, el animal recibe una dosis grande de este factor, el animal muere. El analisis histopatologico muestra inflamacion pulmonar tan grave que, aun cuando las micobacterias hayan sido eliminadas, el dano al huesped debido a inflamacion no regulada ocasiona la muerte (40).

En contraste con el TNF-[alfa], la Interleuquina 10 (IL-10) es generalmente considerada una citocina antiinflamatoria, la cual es producida por M[FI] y celulas T durante la infeccion por M. tuberculosis. Posee propiedades desactivantes de M[FI], incluyendo la alteracion de la produccion de IL-12, la cual a su vez disminuye la produccion de IFN-[gamma] por las celulas T (15). El efecto regulatorio de las citocinas IL10, Factor de Crecimiento de Celulas T (TGF-[beta]), IFN-[gamma] y TNF-[alfa] sobre la IL-12 fue estudiado en monocitos humanos infectados in vitro con M. tuberculosis H37Ra. Los resultados mostraron que el pretratamiento de los monocitos con IFN-[gamma] induce un incremento en la produccion del IL-12, siendo mas marcado el efecto sobre la subunidad p40, mientras que el pretratamiento con la IL-10 causa reduccion en los niveles de la IL-12, confirmando de esta manera el efecto antagonico de esta citocina sobre la produccion de IL-12 (41).

Los M[FI] de pacientes tuberculosos son supresores de la proliferacion de las celulas T in vitro, y la inhibicion de IL-10 revierte parcialmente esta supresion (42). La IL-10 inhibe directamente las respuestas de los linfocitos T [CD4.sup.+], asi como tambien la presentacion de antigenos por las celulas presentadoras infectadas con micobacterias. Estudios recientes sugieren que IL-10 puede actuar en contra de las propiedades de activacion del macrofago por parte del IFN-[gamma], sin embargo experimentos realizados en ratones con deficiencia de IL-10 demuestran que la susceptibilidad a la infeccion aguda por M. tuberculosis es igual tanto en el raton control como en el del grupo experimental. El papel de la IL-10 en la respuesta inmunitaria protectora esta en espera de experimentacion posterior (42).

La Interleuquina 6 (IL-6), tiene multiples papeles en la respuesta inmunitaria, incluyendo inflamacion, hematopoyesis y diferenciacion de las celulas T. Se ha reportado un papel potencial de la IL-6 en la supresion de la respuesta de las celulas T frente a micobacterias (43). Se ha reportado que los M[FI] infectados con BCG, son incapaces de estimular las respuestas de celulas T a un antigeno no relacionado, efecto que puede ser revertido parcialmente por la neutralizacion de la IL-6 (43).

En otro modelo experimental, despues de infectar con dosis bajas a traves de la via respiratoria, se observo un aumento temprano en la carga de bacilos a nivel pulmonar, asi como la disminucion de la produccion de IFN-[gamma] en los ratones deficientes de IL-6, lo cual sugiere que esta es importante en la respuesta innata inicial al patogeno (44). Una vez que la inmunidad adquirida se desarrollo, los ratones IL-6-deficientes controlaron y sobrevivieron a la infeccion. El raton IL-6-deficiente sucumbe a la infeccion con una dosis alta de bacilos de M. tuberculosis. En este caso, se considera que la respuesta innata defectuosa podria haber sido rebasada por el gran numero de bacterias introducidas en los pulmones (44).

Se ha implicado al TGF-[beta], citocina antiinflamatoria en la supresion de las celulas T en pacientes con TB (45). La TGF-[beta] esta presente en las lesiones granulomatosas de estos pacientes y es producida por monocitos humanos despues de la estimulacion con M. tuberculosis o lipoarabinomanan. Se ha reportado que ademas de inhibir la respuesta de celulas T a M. tuberculosis tambien participa en la desactivacion del M[FI] al inhibir la produccion de NO[S.sub.2] inducida por IFN-[gamma] (46). La regulacion de esta citocina es muy compleja y ocurre a varios niveles. No se ha probado directamente el papel de la TGF-[beta] in vivo en la proteccion o patologia en la TB (45).

M. tuberculosis es un fuerte inductor de quimiocinas (47). Hasta ahora la mayoria de los estudios se han enfocado a la produccion de quimiocinas una vez que el M[FI] ha sido infectado por la micobacteria. M. tuberculosis induce expresion de quimiocinas inclusive dos horas despues de la infeccion con M. tuberculosis (48) los M[FI] humanos infectados normalmente producen CCL2, CCL3, CCL4 y CCL5 (MCP1, MIP1[alfa], MIP1[beta] y RANTES) en respuesta a cepas virulentas de M. tuberculosis (48). Mientras que tejido linfatico y monocitos CD14+ aislado de pacientes tuberculosos expresan mas CCL2. Los M[FI] alveolares cuando son infectados aumentan significativamente la expresion de CCL3, CCL2 y CCL5 inclusive mas que monocitos de sangre periferica (48). Esto sugiere que las quimiocina que se unen a CCR1, CCR2 y CCR5 juegan un papel importante en la infeccion temprana de M. tuberculosis, sin embargo el papel real de estas quimiocinas en la inmunopatogenia de la TB necesita ser estudiado.

Los M[phi] no son los unicos productores de quimiocinas durante la infeccion por M. tuberculosis, las celulas epiteliales juegan un papel importante ya que son capaces de producir CXCL8 (IL-8) y CCL2 no asi CCL3, CCL4, o CCL5. La produccion de citocinas tanto en M[FI] como en celulas epiteliales se ve incrementada en la presencia de IFN-[gamma], y disminuida a niveles cercanos a cero con la presencia de IL-4 (48).

ANTIGENOS DE Mycobacterium tuberculosis

Las proteinas del M. tuberculosis son las que le confieren la propiedad antigenica; ciento cincuenta de sus 1000 proteinas han sido caracterizadas (49). Las mas predominantes han sido aisladas, caracterizadas y copiadas por sintesis quimica o sus genes han sido insertados en huespedes como Escherichia coli, para la reproduccion en gran escala de proteinas recombinantes (50). Para su estudio se han agrupado en cuatro grupos de acuerdo a su funcion, secuencia y caracteristicas fisico quimicas:

El primer grupo formado por proteinas de choque termico (hsp, del ingles heat shock protein), son polipeptidos esencialmente citoplasmaticos, que incrementan su sintesis frente a estimulos estresantes como los cambios de temperatura, el incremento de dano oxidativo y la disminucion de nutrientes; esta respuesta probablemente protege a la micobacteria durante situaciones adversas, manteniendo la conformacion funcional de proteinas esenciales y asistiendo en la reduccion de proteinas desnaturalizadas (Tabla I). Se agrupan en familias dependiendo del peso molecular: hsp65 kDa o GroEL, hsp 10 kDa o GroES, hsp 70 kDa o DnaK, hsp 90 kDa, hsp 16 kDa entre otras (51). Estas proteinas estan presentes tanto en celulas procarioticas como eucarioticas; se conoce que estan altamente conservadas dentro y a traves de las especies, lo que ha llevado a plantear la hipotesis de la respuesta de celulas T a determinantes compartidos de las hsp propias, donde las del M. tuberculosis tienen un papel importante en el desarrollo de las enfermedades autoinmunes (51).

El segundo grupo son las lipoproteinas, incluye a las de 19 kDa, 26 kDa, 27 kDa y 38 kDa, fundamentalmente constitutivas de la pared celular pero pueden ser encontradas en el citoplasma, las de 19 y 38 kDa son las mas importantes. Se considera que estas lipoproteinas estan involucradas en la induccion de respuestas humoral y celular, en especial de la respuesta de las celulas T de memoria in vitro, y tienen un papel funcional en el transporte de nutrientes a traves de la pared celular (Tabla I) (52).

Un tercer grupo son las proteinas secretorias, estan constituidas principalmente por proteinas de 15, 18, 23, 26, 27, 30, 31, 31.5 y 41 kDa, algunas de estas forman el complejo 85 que es uno de los mayores constituyente del sobrenadante de los cultivos del M. tuberculosis. El ultimo grupo esta constituido por las enzimas, la L-alanina deshidrogenasa de 40 kDa y la superoxidodismutasa de 23 kDa, que estan involucradas en los mecanismos de defensa del bacilo dentro de los M[FI] (Tabla I) (53, 54).

Se esta tratando de definir que antigeno o epitopo estimula las diferentes respuestas de las celulas T; la gran mayoria de los antigenos micobacterianos son timodependientes, ya que necesitan de la participacion de los linfocitos T cooperadores para generar suficientes respuestas humorales (18, 51). M. tuberculosis presenta 30 diferentes sustancias antigenicas que son capaces de despertar reacciones de hipersensibilidad con destruccion celular (55).

ANTIGENOS DE SECRECION DE Mycobacterium tuberculosis

38 kDa

El antigeno 38 kDa es probablemente el antigeno estudiado de manera mas exhaustiva. La codificacion del antigeno a partir del ADN es conocida (Tabla II). Este contiene epitopes de una lipoproteina secretada que son especificos del complejo M. tuberculosis. El antigeno 38 kDa antes conocido como antigeno 78, antigeno 5, antigeno proteico "pab" o LPAM, es una proteina de 38,000 daltones, que se ha identificado como una de las de mas alta especificidad para la deteccion de la enfermedad. Es el mayor constituyente del liquido de cultivo de M. tuberculosis. Varios metodos serologicos que usan este antigeno han demostrado buena sensibilidad y especificidad para el diagnostico de la enfermedad (12, 56).

Entre las especies de micobacterias, este antigeno se encuentra solo presente en Mycobacterium bovis y M. tuberculosis, su concentracion en este ultimo es 10 veces superior. La secuencia de aminoacidos de la proteina 38 kDa posee un 30% de homologia con una proteina (PhoS) relacionada con la fijacion y el transporte de fosforo en Escherichia coli, la cual se incrementa durante la disminucion de fosfato en el citoplasma (Tabla II).

El antigeno 38 kDa de la micobacteria posee diferentes epitopes localizados en la porcion central de la molecula y en el carboxilo terminal, los cuales son capaces de inducir la proliferacion de clones de celulas T especificos para M. tuberculosis, aunque algunos pueden tener reactividad cruzada. Una respuesta humoral excesiva al 38 kDa parece tener significado patogenico (55). En un estudio llevado a cabo en el Instituto de Tecnologia Microbiana de la India con ratones de 3 diferentes haplotipos (H-2d, H-2k y H-2b), los cuales fueron sensibilizados de manera subcutanea con la cepa H37Ra o 38 kDa de M. tuberculosis y cuyos linfocitos fueron colocados in vitro con el antigeno 38 kDa, se encontro que en ambos casos se indujo un patron dominante de las citocinas tipo Th1 (IL-2 e IFN-[gamma]), ademas de que se observo la produccion preferencial del anticuerpo especifico de 38 kDa tipo IgG2a (57). Fue interesante observar que en los ratones C3H/HeJ, que expresan los alelos de resistencia a BCG, mostraron una alta proliferacion asi como un patron de citocinas asociadas a resistencia en comparacion con los ratones BALB/c y a C57BL/6, que llevan los alelos de susceptibilidad de BCG. Estos resultados sugieren no solamente las respuestas de memoria durante la induccion, sino tambien una respuesta inmunitaria predominantemente de tipo Th1 (57).

Los anticuerpos dirigidos contra la proteina 38 kDa se presentan en un alto porcentaje de pacientes con TB con una alta especificidad para la enfermedad activa. La mayoria de pacientes produce anticuerpos contra la proteina 38 kDa, mientras que en los controles sanos no se encuentra estos resultados (57). Recientemente se demostro que la vacuna DNA de 38 kDa esta induciendo una inmunidad protectora en ratones vacunados que se exponen a bacilos tuberculosos virulentos, lo que resulta en una disminucion de la carga bacteriana (54). Los anticuerpos se unen solo al antigeno hallado en M. tuberculosis y en BCG de M. bovis, no produce una reaccion visible con otros sueros, por lo que el antigeno de 38 kDa parece ser serologicamente especifico. Finalmente, la importancia del antigeno 38 kDa en la TB ha sido demostrado por muchos investigadores. Se han disenado diversas pruebas para la deteccion de estos antigenos en los sueros de los pacientes con TB mediante el metodo de ELISA directo o sandwich ELISA usando FF11 (anti-38 kDa m-Ab) para la deteccion del 38 kDa. Esta prueba ha encontrado tener una especificidad de 84-88% con valores predictivos positivos de 80-84% que, aunque no es ideal, es absolutamente provechoso para desarrollar alguna nueva prueba de diagnostico especifica. Esta prueba con ELISA tiene la ventaja de que los antigenos pueden ser detectados en los inicios de la infeccion y se ha demostrado que puede ser utilizada para supervisar la terapia eficaz detectando la declinacion en el antigeno 38 kDa en pacientes previamente positivos. Sin embargo, se requiere de mejores estudios que puedan discriminar entre los casos confirmados de TB activa y latente.

16 kDa

El antigeno 16 kDa (alpha-crystallin) es una proteina de superficie, el mas potente inmunogeno, una herramienta de gran valor en el estudio del Mycobacterium, puesto que es altamente especifico. La localizacion celular es desconocida, aunque se considera que esta en la parte externa de la pared celular; en otras palabras, esta proteina esta probablemente asociada con la membrana de manera periferica (57).

La alfa-crystallin (acr) 16 kDa, proteina homologa de M. tuberculosis es principalmente producida por los cultivos de estas bacterias en la fase estacionaria in vitro, es imperceptible el incremento logaritmico cada vez mayor de este antigeno. Utilizando cultivos de estos bacilos que crecen en concentraciones de oxigeno definidas, se demostro la fuerte induccion de la transcripcion de alfa-crystallin 16 kDa en condiciones medianamente hipoxicas. La induccion de la expresion de acr tambien fue demostrada durante el curso de la infeccion in vitro de M[FI]. El gen que codifica la acr fue intercambiado por una porcion de un alelo de una cepa H37Rv de M. tuberculosis que presentaba resistencia a la higromicina. Ademas de su papel propuesto en el mantenimiento de la viabilidad a largo plazo durante las infecciones latentes, asintomaticas, estos resultados certifican el papel de la proteina acr en la replicacion durante la infeccion inicial por M. tuberculosis. Cuando hay infeccion por M. tuberculosis, la respuesta al NO produce el incremento en la sintesis del homologo de la alfa cristalino sHsp 16, que es una proteina mayor de M. tuberculosis producida por la exposicion a intermediarios de nitrogeno reactivos (Tabla I) (58, 59). El antigeno 16 kDa es inmunodominante con valor serodiagnostico, se eleva en casos de enfermedad activa o cuando se ha desarrollado una recaida o el bacilo se ha vuelto resistente a los farmacos, disminuye en caso de que exista una respuesta adecuada al tratamiento. Los anticuerpos contra 16 kDa podrian elevarse en respuesta a la infeccion aun sin que la TB sea clinicamente aparente, por lo que se considera como un marcador temprano de enfermedad, ademas de que puede utilizarse tambien en el diagnostico de TB en ninos (60).

19 kDa

La infeccion de M[FI] con M. tuberculosis o exposicion de los mismos a la lipoproteina 19 kDa por mas de 16 horas, inhibe la expresion del Complejo Mayor de Histocompatibilidad clase II (MHC-II) inducida por el IFN-[gamma], a traves de un mecanismo que involucra a los receptores TLRs (Tabla I) (61). La senalizacion de TLRs en forma prolongada por M. tuberculosis y la lipoproteina (LP) 19 kDa, inhibe ciertas respuestas del macrofago al IFN-[gamma], particularmente aquellas relacionados a la expresion de MHC-II y la presentacion de antigenos. Esta inhibicion posiblemente promueve la evasion del M. tuberculosis a la respuesta inmunitaria mediada por las celulas T, lo que implica la persistencia de la infeccion en la enfermedad (Tabla I) (61).

M. tuberculosis y la LP19 kDa tienen la capacidad para inhibir las actividades de procesamiento antigenico y la expresion del MHC-II en el M[FI], solo con la condicion de que estas sean estimuladas por IFN-[gamma], porque si el proceso es estimulado por la IL-4, el mecanismo de inhibicion no se lleva a cabo, lo que sugiere que la inhibicion se realiza a nivel de genes cuya expresion esta regulada por el IFN-[gamma] (61). La inhibicion de la activacion de los M[FI], provocada por el M. tuberculosis y su lipoproteina 19 kDa se demostro cuando se tomo dos grupos de macrofagos provenientes de muridos, los cuales se infectaron con el bacilo de Koch e incubaron con la lipoproteina 19 kDa respectivamente, transcurridas 24 horas anadieron a las dos preparaciones IFN-[gamma]. A traves de microradiografia estudiaron la relacion entre la activacion de los TLRs por los antigenos (M. tuberculosis y lipoproteina) y la ausencia de expresion de moleculas codificadas por genes estimulados por el IFN-[gamma] sobre la superficie del M[phi]. Se obtuvo como resultado una inhibicion del 42 y 36% de los 347 genes inducidos por el IFN-[gamma], segun fueran tratados con M. tuberculosis o LP 19 kDa, respectivamente (61). Estos y otros genes distintos a los estimulados por el IFN-[gamma] tambien fueron estudiados, a traves de tecnicas como PCR y citometria de flujo, confirmando los resultados obtenidos por los estudios de microradiografia, es decir solo es inhibida la expresion de algunos de los genes regulados por el IFN-[gamma]. Debido a estas evidencias se puede decir que M. tuberculosis por si mismo o a traves de la LP 19 kDa inhibe la induccion de genes involucrados en el procesamiento y presentacion de antigenos, expresion de MHC-II y activacion de linfocitos T, a traves de una hiperestimulacion de TLRs, lo cual provee a la bacteria de una mayor capacidad evasiva y de invasion (61).

La LP 19 kDa de M. tuberculosis tambien promueve la activacion de los neutrofilos; a traves de cambios fenotipicos caracteristicos en estas celulas que inducen el proceso, como lo son la disminucion en la expresion de la L-selectina (CD62 ligando) y el aumento en la expresion de CR1(CD35) y CD11/CD18 (CR3 y Mac-1 respectivamente) (Tabla I) (62). Ademas, la exposicion de los neutrofilos a esta lipoproteina incrementa la explosion oxidativa en respuesta al peptido quimiotactico secretado por bacterias N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), asi como la oxidacion de la dihidrodamina 123. A diferencia de los LPS, la LP19 kDa de M. tuberculosis no requiere de la presencia de factores sericos para activar los neutrofilos, lo cual sugiere que existen dos receptores sobre la superficie de la membrana de esta celula o dos tipos de senales heterogeneas que promueven la activacion de los neutrofilos en forma disimil en presencia de LPS y la LP 19 kDa de M. tuberculosis (62).

CPF-10

El antigeno 10 kDa pertenece a la familia de las chaperoninas GroES. La codificacion para el antigeno a partir del ADN es conocida (Tabla II). Estas proteinas citoplasmicas se requieren para el plegamiento correcto y montaje subsecuente de algunas proteinas bacterianas dentro de la celula. Son inducidas por estres y actuan estabilizando o protegiendo de una posible desestabilizacion cuando se encuentra en condiciones de calor (choque termico). El tipo I de estas chaperoninas se encuentra en eubacterias, mitocondrias y cloroplastos, en donde se requiere generalmente la accion concertada de la chaperonina 60 (Cpn60, GroEL) y la chaperonina 10 (Cpn10, GroES) (63, 65). En presencia de Mg-ATP, Cpn10 se enlaza a Cpn60 y suprimen la actividad de esta bomba ATPasa. El genoma de M. tuberculosis contiene dos proteinas homologas Cpn60 y Cpn10, que probablemente actuan de la misma manera. Sin embargo, en este caso el ensamblamiento de los complejos de proteinas heptamericas Cpn10 y su enlace a otros sustratos de Cpn10 parece ser posible aun en ausencia de Cpn60 (63-65).

Cpn10 (10 kDa) es una molecula integrada por 14 subunidades, que le dan la apariciencia de un cubo de paredes solidas e interior vacio. La forma tetradecamerica de Cpn10 podria tener un papel in vivo en el plegamiento de los dominios estructurales de la proteina y en el transporte de esta. Consiste en dos copias de un heptamero en forma de cupula. La molecula completa contiene solo un sitio de union para el calcio en cada heptamero. Cada uno de los dos heptameros tiene una cavidad interna hidrofilica. Durante la infeccion por M. tuberculosis, Cpn10 se comporta como un anfitrion, siendo secretado en el espacio extracelular donde contribuye a la patologia de la enfermedad. La chaperonina de 10 kDa de M. tuberculosis presenta una gran capacidad de inducir respuestas inmunitarias mediadas por celulas T y en la modificacion de la actividad formadora de hueso, inhibe el crecimiento de osteoblastos y recluta osteoclastos, dando por resultado la reabsorcion de las vertebras en el caso de tuberculosis espinal. Esto libera nutrientes y macrofagos que pueden servir como nuevas celulas hospedadoras para la bacteria (66).

Se ha demostrado que el antigeno CPF-10 del M. tuberculosis puede unirse a la superficie de los macrofagos y estimular la secrecion de citocinas proinflamatorias como el TNF-[alfa]. El antigeno a diferencia de otros secretados por el M. tuberculosis tiende a establecer sinergia con el IFN-[gamma], provocando la produccion de agentes microbicidas por parte del fagocito mononuclear, como lo es el NO (Tabla I) (66). Sin embargo si el individuo ha sido expuesto con anterioridad al antigeno, este va a reducir la cantidad de NO producida por los macrofagos aunque exista una gran cantidad de IFN-[gamma] en el medio celular, pero seguira induciendo la produccion de citocinas proinflamatorias como el TNF-[alfa] e interleuquinas de tipo Th2 como IL-10 (66).

ESAT-6

El antigeno ESAT-6 (early secretory antigenic target-6) es encontrado especificamente como proteina secretada en los cultivos de M. tuberculosis. Esta se encuentra ausente dentro de la BCG proveniente de M. bovis y en las demas micobacterias ambientales. La secuenciacion para el antigeno a partir del ADN es conocida (Tabla II). ESAT-6 estimula las celulas T de pacientes con TB activa, al inducir un aumento en la produccion de IFN-[gamma] (Tabla I), (67). Esta proteina y la de 16 kDa estan entre las varias moleculas producidas por las bacterias en condiciones relativas de hipoxia y dentro de los granulomas artificiales y animales, condiciones sospechadas para ser analogo a los presentes dentro de granulomas humanos, pero no durante el crecimiento logaritmico de la fase (67).

Datos de investigaciones recientes indican que el antigeno de secrecion de M. tuberculosis ESAT-6 actua en la respuesta inmunitaria frente a la TB. Este puede promover el desarrollo de inmunidad protectora frente al bacilo de Koch mediante la activacion de los macrofagos, celulas dendriticas y mastocitos, provocando la liberacion de mediadores proinflamatorios, TNF-[alfa] e histamina por parte de estas celulas (67). Ademas puede inducir el proceso de maduracion de las celulas dendriticas, a traves de la secrecion de IFN-[gamma], las cuales posteriormente seran las encargadas de presentar los antigenos de la bacteria a los linfocitos T, promoviendo una respuesta inmunitaria de tipo celular (Tabla I). La modulacion de estos procesos y la inmunodominancia de esta proteina dentro de los antigenos derivados de M. tuberculosis son los posibles responsables de la proteccion obtenida al vacunar a un individuo con estas sustancias (68). Sin embargo aunque esta proteina le brinda una inmunidad protectora al individuo infectado, posiblemente tambien participe en los metodos de evasion de la respuesta inmunitaria usados por el bacilo para subsistir en el organismo y en la generacion de las complicaciones inusuales que se presentan de forma individual (66, 67). Entre los mecanismos de evasion modulados por esta proteina se encuentran, la regulacion negativa ejercida sobre la produccion de NO en los macrofagos y la disminucion de la expresion de factores coestimuladores como B7.1 en las celulas presentadoras de antigeno (Tabla I), (67). Aunque este antigeno puede contribuir con la supervivencia de la bacteria dentro de las celulas del huesped susceptible, asi como en las reacciones diagnosticas de hipersensibilidad de tipo retarda do (Tipo IV), se debe hacer un mayor enfasis en su estudio porque puede servir en el futuro como opciones terapeuticas distintas a las empleadas en la actualidad. (68). En animales de experimentacion infectados con M. tuberculosis, tratado y reinfectado, se observo que al momento de la reinfeccion los animales desarrollaron una fuerte respuesta de celulas T al ESAT-6, haciendo asi a esta proteina relevante como fuente de inmunidad protectora (69).

30/32 kDa

Son un conjunto de tres enzimas, transferasas de acido micolico expresadas y secretadas por el M. tuberculosis, poseen un peso molecular entre 30 y 32 kDa. Estas enzimas tambien se conocen en conjunto como el complejo antigenico 85 de M. tuberculosis (70). Esta conformado por las siguientes proteinas: Ag85A, Ag85B y Ag85C o 32A kDa; 30 kDa y 32B-kDa, respectivamente. La secuencia de la codificacion para el antigeno a partir del ADN es conocida (Tabla II). Las tres proteinas son ampliamente secretadas, sin embargo al cuantificar las secreciones de M. tuberculosis, el Ag85B es la proteina que se encuentra en mayor concentracion en el filtrado y el Ag85A es el segundo en abundancia (70). Las tres enzimas se expresan en gran cantidad en macrofagos infectados con M. tuberculosis, su expresion dentro de los fagosomas y sobre la pared celular de la bacteria permite el mantenimiento de la integridad de la misma y el crecimiento de la bacteria, despues de ser ingeridas por los macrofagos por activacion del proceso de fagocitosis. Algunas investigaciones sugieren que sin la presencia de este complejo antigenico la bacteria no seria capaz de sobrevivir y reproducirse dentro del fagosoma (70).

Las proteinas del complejo 30/32 kDa son uno de los principales candidatos para el desarrollo de nuevas vacunas contra la TB. Los modelos experimentales se han desarrollado en cobayos con el Ag85B purificado, despues de varias pruebas se ha detectado actividad inmunitaria protectora contra la forma pulmonar del M. tuberculosis (71). Cuando se une un extracto de la proteina 30 kDa y los componentes de la BCG se obtiene una respuesta inmunitaria mas adecuada que la vacuna BCG comunmente usada, la cual no induce proteccion contra la TB pulmonar (Tabla I), (70). Este complejo antigenico ayuda a mantener la alta hidrofobicidad e integridad de la pared celular de M. tuberculosis, es decir, actua sobre una de las estructuras que se encarga de la supervivencia de la bacteria en el organismo del huesped. Este proceso es mediado a traves de la transferencia de acidos micolicos (sustancias hidrofobicas) hacia la pared celular para que interaccionen con las moleculas de arabinogalactan presente en ella, y la sintesis de factor cordonal (tetrhalosa dimicolato) (70). Las dos vias activadas por el complejo 85 son de gran importancia, la primera porque es la encargada de brindarle alta hidrofobicidad a la pared celular de M. tuberculosis y la otra porque genera una de las moleculas que permite que la pared se conserve integra a pesar de las agresiones del medio. Ademas los productos finales de ambas vias son los encargados de dotar de alta selectividad a la pared de la bacteria, permitiendo solo la difusion de solutos pequenos, que normalmente sirven para cubrir los requerimientos metabolicos de la bacteria (70).

Es importante destacar que ademas de realizar estas funciones a nivel de pared celular, el complejo antigenico es el responsable de la alta afinidad de la bacteria por la fibronectina y la pared celular de la celula eucariota, debido a que los antigenos que lo conforman tambien son proteinas ligadoras de fibronectina, lo cual permite en el caso de las infecciones respiratorias, la invasion del parenquima pulmonar por parte de macrofagos que causaran un colapso a nivel pulmonar junto a las otras sustancias que traspasan la barrera hematorespiratoria (71).

40 kDa

El antigeno 40 kDa de M. tuberculosis, es el primer antigeno reportado de la bacteria que se encuentra relacionado con el proceso patologico, y no se encuentra en la BCG. Funciona como una deshidrogenasa de L-alanina, lo que le confiere la caracteristica de ser uno de los pocos antigenos que posee actividad enzimatica. Las caracteristicas anteriormente citadas hacen de este antigeno, una de las opciones mas atractivas para disenar nuevas estrategias diagnosticas y terapeuticas (Tabla I), (72). A traves del estudio de extractos purificados de proteina, se han descrito las propiedades bioquimicas de la proteina (72).

Debido a procesos de desaminacion oxidativa es, como la proteina contribuye con el M. tuberculosis en la evasion de la respuesta inmunitaria del huesped, ya que el producto de esta reaccion, el amoniaco, el cual aumenta el pH a nivel del fagolisosoma, impide la accion de las enzimas lisosomales que son las encargadas de mediar la destruccion celular, asi el M. tuberculosis puede escapar de uno de los mecanismos usados por el sistema inmunologico para protegerse (72).

27 kDa

El antigeno 27 kDa ha sido clasificado como un buen candidato para la proteccion de las respuestas inmunitarias contra patogenos intracelulares. Hovav y colaboradores en el 2003 estudiaron en ratones de BALB/c la inmunogenecidad y la proteccion ofrecida por la lipoproteina recombinante de M. tuberculosis 27 kDa y la vacuna correspondiente de DNA (73). La secuencia de codificacion para este antigeno a partir del ADN es conocida (Tabla II). La inmunizacion con el antigeno 27 kDa resulto con altos titulos de inmunoglobulina G1 (IgG1) e IgG2a con un perfil tipico Th1 y una respuesta de hipersensibilidad retrasada fuerte (Tabla I). Una alta proliferacion fue observada en esplenocitos, y la produccion de cantidades significativas de NO, aumenta la secrecion del IFN-[gamma], pero la secrecion de interleuquina 10 no fue medida. De acuerdo con estos investigadores, el antigeno 27 kDa induce una respuesta inmunitaria de tipo Th1 protectora. Asombrosamente, en los ratones vacunados con 27 kDa, obtenido de M. tuberculosis H37Rv o de infusiones de BCG, se obtuvo un aumento significativo en los numeros de unidades formadoras de colonia (CFU) en el bazo comparado esto con los grupos de control. Ademas, la proteccion proporcionada por BCG u otros antigenos micobacterianos fueron suprimidos una vez que el antigeno 27 kDa fue agregado a las preparaciones de vacunas. Este estudio indica que el antigeno 27 kDa tiene un efecto nocivo en la proteccion producida por este tipo de vacunas (73).

ANTIGENOS DE Mycobacterium tuberculosis Y EL DIAGNOSTICO DE TUBERCULOSIS EXTRAPULMONAR

La TB pleural representa aproximadamente el 5 por ciento de todas las enfermedades asociadas a infeccion por M. tuberculosis (74). Constituye la primera causa de derrame pleural en areas con elevada prevalencia de TB (75). Existen dificultades diagnosticas en TB pleural, tanto desde el punto de vista clinico y paraclinicas. El cultivo de liquido, considerado como el estandar de oro, solo es positivo en el 40 por ciento de los liquidos, mientras que el cultivo de la biopsia puede serlo en los dos tercios (76). Aunque la combinacion de la biopsia pleural mas el cultivo para micobacterias resulta con una sensibilidad del 95 por ciento, esto representa un diagnostico invasivo, que requiere de tiempo para obtener los resultados del cultivo (minimo dos a tres semanas, llegando hasta ocho) y con elevado costo-beneficio (77). El retraso en el diagnostico trae como consecuencia la perdida del seguimiento del paciente. Por tanto, metodos especiales como la determinacion de adenosina desaminasa (ADA), lisozima, reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), inmunoensayos y citocinas en el liquido han sido usados para incrementar estos parametros, sin embargo, estos aun no son de empleo rutinario.

El topico relacionado a la respuesta inmunitaria celular o humoral frente a antigenos a nivel sistemico o local, que pudiera ser utilizada como elemento diagnostico, se remonta a hace mas de dos decadas, cuando ya se demostraba la menor reactividad a nivel sistemico contra antigenos crudos como el PPD, frente a las celulas T del derrame, atribuido a la presencia de celulas supresoras (78, 79).

Los resultados en suero no resultaban prometedores, ya que la sensibilidad contra antigenos de alto peso molecular no alcanzaba ni el 15% en pacientes con derrame pleural tuberculoso (80), por lo que se buscaron identificar antigenos peptidicos de menos tamano (81, 82). La infeccion por VIH no parecia modificar la sensibilidad de estos metodos multiantigenicos, en la deteccion de pacientes con TB pleural, ya que esta enfermedad comenzo a tomar relevancia en los fenomenos de reactivacion tuberculosa (82).

Los anticuerpos contra antigenos tuberculosos han sido encontrados elevados en pacientes con TB pleural; sin embargo no han demostrado su utilidad debido a falsos positivos con otras entidades (83, 84). Variaciones en respuestas a anticuerpos especificos contra antigenos de micobacterias en diferentes poblaciones humanas puede estar relacionado a la presencia de distintos antigenos de histocompatibilidad como HLA-DR (del ingles human leukocyte antigens relacionado con DR). Pruebas designadas a detectar respuestas a un antigeno particular pueden mostrar variabilidad geografica importante y una sensibilidad limitada, por lo cual se han creado pruebas multi-antigenicas para resolver estos problemas (84).

El uso de multiples antigenos incrementa la sensibilidad con respecto al uso de una solo banda como la respuesta contra el antigeno 38 kDa; sin embargo esto es aun controversial. Esto tambien varia segun el isotipo. Un diagnostico definitivo de TB pulmonar debe establecerse solamente en pacientes que muestran inmunoglobulina G (IgG) positivo mas IgA o IgM, dando una eficacia diagnostica de 90 por ciento (85). Esto puede aplicarse de forma similar con la determinacion de IgM en el liquido pleural contra el antigeno A60, independientemente de si la poblacion se encuentra vacunada con BCG, un agente comun que altera la interpretacion de las pruebas serologicas diagnosticas (86). De forma similar, se han encontrado titulos detectables de anticuerpos anti 38 kDa y 16 kDa, del isotipo IgG, tanto en liquido cefalorraquideo asi como liquido pericardico. Estas determinaciones fallan a nivel pleural, pero podrian utilizarse en conjunto con otros metodos (87).

En general, las pruebas serologicas tienen un alto valor predictivo negativo, lo que los hace potencialmente utiles como pruebas para descartar TB activa. La prueba de ELISA puede usarse como una prueba de soporte en el diagnostico de laboratorio de TB extrapulmonar activa en adultos, sin discriminar la zona afectada. Sin embargo, niveles sericos de IgG contra el 38 kDa puede ser util en el diagnostico de TB con un alto valor predictivo positivo (88, 89), asi como una prueba de ELISA para detectar antigenos circulantes para PPD negativa no excluye TB pero un resultado positivo es indicativo de enfermedad. Ademas, se han intentado el desarrollo de ensayos en saliva.

Se ha demostrado la presencia de celulas T secretoras de IFN-[gamma] especificas para el antigeno ESAT-6 en liquidos pleurales de pacientes con TB, en una concentracion mucho mas elevada que en sangre periferica, estando ausentes en derrames de otras etiologias (90). Esta produccion logra discriminar frente a pacientes con lepra, produciendo una reaccion cruzada con vacunacion BCG incluso menor que el propio PPD (90).

Se ha llegado a la caracterizacion de antigenos recombinantes como el MPT-64 y el MT-10.3, en cuyo caso la reactividad de IgA en el derrame pleural muestra una sensibilidad similar a los estudios anatomopatologicos, considerados en muchos casos como uno de los estandares junto con el cultivo (91).

La importancia de encontrar evidencia en cuanto a la inmunogenicidad de los antigenos de M. tuberculosis, radica no solo en el diagnostico, sino que podria trasladarse a la capacidad de crear vacunas que produzcan proteccion a nivel de lugares extrapulmonares frecuentes, como lo es el espacio pleural (92). Al igual que en otras ubicaciones, falta camino por recorrer, y se perfilan siempre como elementos accesorios al diagnostico, colaborando al aumentar la probabilidad diagnostica en un paciente o descartarla en grupos poblacionales, dependiendo del caso (92).

UTILIDAD DE LOS ANTIGENOS SECRETADOS DE M. tuberculosis EN EL DIAGNOSTICO DE LA INFECCION EN SUS DIVERSAS ETAPAS DE EVOLUCION

La identificacion de estos individuos con infeccion latente es crucial para el control de la transmision de la enfermedad y la eliminacion de la TB; esto ha impulsado la investigacion en agentes determinantes para el diagnostico temprano de la infeccion cuya importancia epidemiologica es incalculable (1, 2).

La invencion en los campos de inmunologia, microbiologia y medicina se relaciona con los metodos para la deteccion temprana y rapida de la enfermedad por micobacterias en los seres humanos basados en la presencia de anticuerpos "tempranos" contra los antigenos micobacterianos que no han sido previamente reconocidos para este proposito. Analisis de tales anticuerpos en preparaciones purificadas de micobacterias que contienen tales antigenos tempranos permite el diagnostico de TB (8, 10).

Las pruebas basadas en PPD no poseen siempre la capacidad para distinguir entre la infeccion por M. tuberculosis, la vacunacion de BCG con Mycobacterium bovis, o la exposicion a micobacterias saprofitas ambientales. Pinxteren y colaboradores en el 2000 estudiaron el potencial de diagnostico de dos antigenos especificos de M. tuberculosis (ESAT-6 y CPF-10) en animales de experimentacion asi como durante la infeccion natural en seres humanos y ganados (65). Ambos antigenos se identificaban frecuentemente in vivo e in vitro basandose en la induccion de respuestas de tipo hipersensibilidad retardada y la capacidad de estimular la produccion por parte de los linfocitos de IFN-[gamma]. Con esta combinacion de ESAT-6 y de CPF10 encontraron una alta sensibilidad y especificidad en funcion del diagnostico. En seres humanos, la combinacion tenia una alta sensibilidad (73%) y una especificidad mas elevada (93%) que PPD (7%) (93).

El antigeno PPD, el cual es una mezcla mal definida de antigenos micobacterianos que contiene proteinas secretadas y somaticas, ha sido utilizado para el diagnostico de TB y en estudios epidemiologicos durante muchos anos, utilizandose como reactivo in vivo de la prueba cutanea en seres humanos y ganado. Se han investigado otras alternativas para este tipo de pruebas cutaneas, en 1990 fue desarrollada una prueba de diagnostico in vitro para la infeccion por M. bo vis en ganado, basado en la deteccion del IFN-[gamma] liberado en los cultivos de sangre entera incubados in vitro con PPD (94). En 1994, esta prueba fue adaptada para el diagnostico de la infeccion por M. tuberculosis y M. avium en seres humanos, usando otra vez el PPD-tipo antigenos (94). PPD contiene muchos antigenos micobacterianos, algunos de los cuales se comportan como patogenos de micobacterias que pertenecen al complejo M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, y M. africanum), las micobacterias no tuberculosas ambientales, y el sustrato de la vacuna M. bovis bacille Calmette-Guerin (BCG). Aunque la sensibilidad a PPD es una importante ayuda en el diagnostico de TB y puede dar una indicacion de exposiciones anteriores a micobacterias, a menudo es imposible que este sea capaz de distinguir entre la vacunacion y la exposicion de BCG o infeccion por micobacterias no tuberculosas ambientales o por M. tuberculosis. Ha sido evidente que es necesario superar las limitaciones que trae consigo el uso de PPD para conseguir un reactivo nuevo para el diagnostico, con alta especificidad para M. tuberculosis y M. bovis (94).

Las pruebas de serologia no han demostrado suficientemente utilidad en le diagnostico de la infeccion en sus diversas etapas, sin embargo, se han investigado extensivamente, lo cual ha permitido una mejor comprension de la respuesta humoral en TB y la identificacion de nuevas proteinas especificas de M. tuberculosis. La respuesta inmunitaria heterogenea observada, junto con la ausencia de reactividad a un solo antigeno o a un grupo especifico de antigenos, sugiere la existencia de variaciones entre individuos, asi como influencia de la etapa de la enfermedad (95). La mezcla de antigenos mejoraria la prueba de funcionamiento permitiendo el reconocimiento simultaneo de los diversos epitopes exhibidos en cada uno de las proteinas empleadas (95). El perfil del anticuerpo y su reactividad se ha estudiado exhaustivamente usando diversas preparaciones del antigeno (95).

Segun estudios hechos por Beck y colaboradores en 2005, se demostro que incluso antes de la iniciacion del tratamiento, el 57% de los pacientes presento anticuerpos contra la 6 kDa, y despues de dos meses de la terapia el 73% de los pacientes produjeron anticuerpos especificos contra 16 kDa y fracciones de 38 kDa. Despues de este aumento inicial, seguia habiendo los niveles del anticuerpo constante hasta el final de la terapia (96). Datos similares fueron obtenidos en estudios realizados identificando la respuesta especifica al antigeno 38-kDa. No fue observado ningun cambio en el perfil de la reactividad que permitiria determinar la evolucion del tratamiento (96). Por otro lado, la proteina 26 kDa antes y despues del tratamiento era reconocida en el 98% de los pacientes estudiados, el 40% de los contactos y el 33% de los pacientes con otras enfermedades del pulmon tambien reaccionaban con estos antigenos (96).

La respuesta al 16 kDa, o al antigeno 6 kDa era mas alta en pacientes (50,9% y 57%, respectivamente) que en los contactos (16% para ambos antigenos) o sanos (6,6% y 3%, respectivamente). La presencia de estos anticuerpos en pacientes con TB se han asociado a un pronostico mas favorable o con TB espontaneamente curada, puesto que son estos anticuerpos los primeros en desaparecer despues de 2 anos del tratamiento (97). Se ha reportado un aumento en los anticuerpos de anti-14 kDa y anti-16 kDa para individuos sanos despues de la exposicion ocupacional, y para los contactos directos de pacientes con TBC. Asi, la presencia de estos anticuerpos en contactos puede sugerir la infeccion por M. tuberculosis, que no es clinica ni evidente (98).

A pesar de que la secuencia de codificacion para el antigeno ESAT-6 es conocida (Tabla II), poco se sabe sobre la respuesta de anticuerpo contra este antigeno. El antigeno posee varios epitopes especificos reconocidos por las celulas T que inducen una respuesta celular y conducen al aumento de IFN-[gamma] en pacientes con infeccion subclinica o con TB activa, pero no en individuos sanos no expuestos. Esta respuesta transmitida por celulas tambien ha estado asociada al riesgo creciente de la enfermedad (99). Un estudio reciente demostro que la respuesta humoral a ESAT-6 se puede asociar con TB inactiva pero no con la TB activa (100).

Un estudio reciente que evaluo la respuesta humoral a los antigenos recombinantes de M. tuberculosis, 38 kDa, 14 kDa y ESAT-6, demostro la asociacion de los ultimos dos antigenos con riesgo en los factores desencadenantes de la enfermedad activa, lo cual sugiere la posibilidad de identificar el subconjunto de personas con infeccion de TB latente, es decir, que puede estar en alto riesgo para desarrollar enfermedad activa (100). Estos datos proporcionan evidencia importante aunque ellos no pueden ser considerados definitivos, en vista de que el reconocimiento heterogeneo de los antigenos por los anticuerpos del suero en TB puede ser el resultado de factores multiples, entre los cuales esta el uso de la vacunacion con BCG (101).

CONCLUSIONES

Los hallazgos reportados en relacion a la utilidad de los diversos antigenos de M. tuberculosis, sugieren que los antigenos ESAT-6, CPF-10, 27 kDa y 38 kDa estan relacionados con la estimulacion de la secrecion de citocinas tipo Th1 (IFN-[gamma] y TNF- [alfa]) y la produccion de oxido nitrico, todos estos de gran importancia para generar la respuesta granulomatosa y una inmunidad mediada por celulas efectiva contra la infeccion por M. tuberculosis. Los antigenos ESAT-6, CPF-10, 40 kDa y MPT-64 podrian ser usados para crear metodos diagnosticos mas sensibles y especificos, y antigenos como MPT-64, Ag85 y 27 kDa deben ser mejor estudiados para ser utilizados como medios profilacticos contra la TB pulmonar.

Recibido: 26-06-2007. Aceptado: 17-01-2008.

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Autor de correspondencia: Zaida Araujo. Laboratorio de Inmunologia de Enfermedades Infecciosas, Instituto de Biomedicina, Apartado 4043. Caracas 1010A, Venezuela. Telef: 58-212-860-4636/0414-248-0215, Fax: 58-212-861-1258. Correo elecetronico: zaraujogarcia@yahoo.com

Zaida Araujo (1), Mariana Acosta (2), Hemir Escobar (2), Ricardo Banos (2), Carlos Fernandez de Larrea3 y Bruno Rivas-Santiago4.

[1] Laboratorio de Inmunologia de Enfermedades Infecciosas, Instituto de Biomedicina,

[2] Escuela de Medicina "JoseMaria Vargas", [3] Hospital Vargas de Caracas, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela y 4Unidad de Investigacion Medica de Zacatecas, Instituto Mexicano del Seguro Social, Zacatecas, Mexico.
TABLA I
ACCIONES MODULADAS POR LOS ANTIGENOS DE Mycobacterium tuberculosis

Antigenos                             Accion

CPF-10                  Aumenta la secrecion de interferon gamma
ESAT-6
27-kDa

65-kDa                  Incrementan su sintesis ante estimulos
CPF-10                  estresantes, la disminucion de nutrientes y el
70-kDa                  incremento de temperatura
90-kDa

38-kDa                  Induce una respuesta humoral
27-kDa
19-kDa

38-kDa                  Induce respuesta TH1
27-kDa

27-kDa
Complejo 30/32-kDa      Son utilizados en inmunizacion
MPT-64

27-kDa                  Aumenta la produccion de oxido nitrico
16-kDa
CPF-10

40-kDa                  Inhibe a las enzimas lisosomales
16-kDa                  Elimina celulas T CD8+
19-kDa                  Inhibe la expresion del MHC clase II
19-kDa                  Inhibe la presentacion antigenica
19-kDa                  Activa los neutrofilos

CPF-10                  Aumenta la secrecion de factor de necrosis
                        tumoral
ESAT-6
CPF-10                  Aumenta la secrecion de IL-10

ESAT-6                  Diagnostico
CPF-10
40-kDa
MPT-64

ESAT-6                  Inhibe la produccion de oxido nitrico
CPF-10 (en recidivas)
ESAT-6                  Disminucion de la expresion de cofactores
                        en CPA.
Complejo 30/32-kDa      Mantiene la hidrofobicidad e integridad de
                        la pared celular
Complejo 30/32-kDa      Permite la union de la bacteria a la
                        fibronectina

Tabla II
CODIFICACION DE ALGUNOS ANTIGENOS SECRETADOS POR Mycobacterium
tuberculosis

Antigeno                   DNA codificante

CPF-10     VAKVNIKPLE      DKILVQANEA             ETTTASGLVI
           PDTAKEKPQE      GTVVAVGPGR             WDEDGEKRIP
           LDVAEGDTVI      YSKYGGTEIK             YNGEEYLILS
           ARDVLAVVSK
ESAT-6     P1              MTEQQWNFAGIEAAAS
           P4              AAASAIQGNVTSIHSL
           P6              NVTSIHSLLDEGKQSL
           P8              LDEGKQSLTKLAAAWG
           P20             STEGNVTGMFA

38 kDa     38G             DQVHFQPLPPAVVKLSDALI
           38K             DAATAQTLQAFLHWAITDGN

Ag85A      MQLVDRVRGA      VTGMSRRLVV             GAVGAALVSG
           VEYLQVPSPS      MGRDIKVQFQ             SGGANSPALY
           FEWYDQSGLS      VVMPVGGQSS             FYSDWYQPAC
           WLQANRHVKP      TGSAVVGLSM             AASSALTLAI
           AMGPTLIGLA      MGDAGGYKAS             DMWGPKEDPA
           WVYCGNGKPS      DLGGNNLPAK             FLEGFVRTSN
           DSGTHSWEYW      GAQLNAMKPD             LQRALGATPN

Ag85B      MTDVSRKIRA      WGRRLMIGTA             AAVVLPGLVG
           LQVPSPSMGR      DIKVQFQSGG             NNSPAVYLLD
           YYQSGLSIVM      PVGGQSSFYS             DWYSPACGKA
           ANRAVKPTGS      AAIGLSMAGS             SAMILAAYHP
           PSLIGLAMGD      AGGYKAADMW             GPSSDPAWER
           CGNGTPNELG      GANIPAEFLE             NFVRSSNLKF
           THSWEYWGAQ      LNAMKGDLQS             SLGAG

Ag85C      MTFFEQVRRL      RSAATTLPRR             LAIAAMGAVL
           GLPVEYLQVP      SASMGRDIKV             QFQGGGPHAV
           AFEEYYQSGL      SVIMPVGGQS             SFYTDWYQPS
           AWLQANKGVS      PTGNAAVGLS             MSGGSALILA
           EGWWPTLIGL      AMNDSGGYNA             NSMWGPSSDP
           IWVYCGNGTP      SDLGGDNIPA             KFLEGLTLRT
           PPNGTHSWPY      WNEQLVAMKA             DIQHVLNGAT

27-kDa     APYENLMVPS      PSMGRDIPVA             FLAGGPHAVY
           NTLAGKGIS       VVAPAGGAYS             MYTNWEQDGS
           AAQGGYGAMA      AAFHPDRFG              FAGSMSGFLY

Antigeno         DNA codificante

CPF-10

ESAT-6

38 kDa

Ag85A      LVGAVGGTAT     AGAFSRPGLP
           LLDGLRAQDD     FSGWDINTPA
           GKAGCQTYKW     ETFLTSELPG
           YHPQQFVYAG     AMSGLLDPSQ
           WQRNDPLLNV     GKLIANNTRV
           IKFQDAYNAG     GGHNGVFDFP
           TGPAPQGA

Ag85B      LAGGAATAGA     FSRPGLPVEY
           GLRAQDDYNG     WDINTPAFEW
           GCQTYKWETF     LTSELPQWLS
           QQFIYAGSLS     LLDPSQGMG
           NDPTQQIPKL     VANNTRLWVY
           QDAYNAAGGH     NAVFNFPPNG

Ag85C      VYGLVGTFGG     PATAGAFSRP
           YLLDGLRAQD     DYNGWDINTP
           QSNGQNYTYK     WETFLTREMP
           AYYPQQFPYA     ASLSGFLNPS
           AWKRNDPMVQ     IPRLVANNTR
           NQTFRDTYAA     DGGRNGVFNF
           PPAAPAAPAA

27-kDa     LLDAFNAGPD     VSNWVTAGNA
           KQWDTFLSAE     LPDWLAANRG
           PSNTTTNGAI A   AGMQQFGGV
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Author:Araujo, Zaida; Acosta, Mariana; Escobar, Hemir; Banos, Ricardo; Fernandez de Larrea, Carlos; Rivas-S
Publication:Investigacion Clinica
Date:Sep 1, 2008
Words:17819
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