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Respuesta in vitro de diferentes biotipos y explantos de Passiflora caerulea L.

In vitro response of different biotypes and explants of Passiflora caerulea L.

Introduccion

En Argentina existen alrededor de 19 especies del genero Passiflora (Passifloraceae), siendo Passiflora caerulea ("pasionaria", "flor de la pasion" o "mburucuja") la que ocupa la mayor extension; crece preferentemente en las provincias del noroeste, Mesopotamia, Cordoba y en la ribera del Plata (especialmente en la zona del delta).

Se trata de una enredadera arbustiva, de tallo glabro, provisto de zarcillos que le permiten trepar. La belleza de las flores de P. caerulea le otorga valor ornamental, mientras que sus frutos son apreciados por su importancia alimenticia. La infusion de sus hojas y flores ha sido utilizada tradicionalmente para combatir los estados de ansiedad, tension nerviosa e insomnio. Tambien se reportan otros usos etnomedicinales: diuretico (parte aerea y frutos), espasmolitico (parte aerea), eupeptico (decoccion del fruto), antihelmintico (hoja o raiz), regulador del ciclo menstrual (raiz), anticonceptivo (raiz), antiicterico (frutos u hojas), antiescorbutico (frutos), antiinfeccioso urinario (frutos), antitusivo y antiasmatico (parte aerea) (Alonso, 2004).

Las partes aereas poseen alcaloides como pasiflorina, harmano, harmina, harmalol y harmalina (Mandrile y Bongiorno de Pfirter, 1991), derivados de la [beta]-carbolina, de efecto sedativo, que combaten la tension nerviosa y el insomnio. Tambien contienen flavonoides: crisina, vitexina, orientina, isovitexina, isoorientina, saponarina, siendo el primero el principal responsable del efecto sedativo (Wolfman et al., 1994; Paladini, 1996) y anticonvulsivante (Medina et al., 1990; Dhawan et al., 2004; Pereira et al., 2004).

Otros componentes hallados incluyen: cumarinas de accion antitermica, analgesica, antiinflamatoria y espasmolitica; maltol de accion bradicardizante e hipotermica (Mandrile y Bongiorno de Pfirter, 1991), y cianoglicosidos como ginocardina, volkenina, epitetrafilina B y tetrafilina B (Seigler et al., 1979).

Tanto para el estudio sistematico de las actividades de metabolitos secundarios, como para la obtencion de materia prima para la elaboracion de productos farmaceuticos, es necesaria una fuente continua de material vegetal. La obtencion de plantas medicinales nativas, como P. caerulea, se realiza por recoleccion de plantas silvestres en su habitat natural, esto produce lotes de materia prima muy variable, de mala calidad, y genera problemas en relacion con la conservacion de esta especie por su explotacion indiscriminada. Su cultivo permite una forma mas eficiente de explotacion y puede ofrecer una serie de ventajas como por ejemplo obtener un producto uniforme, de buena calidad y evitar la presion excesiva sobre el recurso natural (Lopez, 1996). En los ultimos anos, las tecnicas de propagacion in vitro se constituyeron en una buena alternativa para incrementar la tasa de proliferacion de plantas con genotipos superiores produciendo compuestos de interes economico. A traves de estas tecnicas biotecnologicas se puede contar con plantas de calidad controlada y alta productividad, originadas a partir de un solo individuo.

Si bien es factible la regeneracion de plantas a traves de tecnicas de cultivo in vitro, el potencial regenerativo depende del genotipo, del explanto empleado y de las condiciones de cultivo (Apezzato Da Gloria et al., 1999; Passos y Bernacci, 2005). Por esto, es necesario conocer las respuestas de diferentes tipos de explantos y el comportamiento de distintos genotipos. El comprender mejor el proceso de regeneracion in vitro permitiria mejorar su eficiencia y aplicar estos conocimientos en planes de mejoramiento de esta especie. El proceso de desdiferenciacion y diferenciacion celular se puede observar a traves de estudios histologicos y, de este modo, determinar las vias de regeneracion.

Se planteo como objetivo evaluar la respuesta in vitro de dos explantos y tres biotipos de P. caerulea, y determinar por medio de estudios histologicos el tipo de estructuras y tejidos a traves de los cuales se produce la regeneracion.

Materiales y metodos

Obtencion de las plantas madre

Se recolectaron frutos maduros de plantas silvestres de P. caerulea en distintas localidades de Argentina: Corral de Bustos (provincia de Cordoba), latitud: 33[grados]17" 0" sur - longitud: 62[grados] 13" 0" oeste; Zavalla (provincia de Santa Fe), latitud: 33[grados] 1" 0" sur - longitud: 60[grados] 53" 0" oeste, y Neuquen (provincia de Neuquen), latitud: 38[grados] 57" 6" sur - longitud: 68[grados] 4" 28" oeste.

Las semillas se extrajeron manualmente y se les retiro el arilo carnoso mediante friccion mecanica utilizando un lienzo de algodon, luego se lavaron con agua corriente y se dejaron secar a la sombra (Severin et al., 2003). Se realizo un corte con bisturi en el extremo chalazal bajo microscopio estereoscopico con aumento de 5X (Severin et al., 2004).

Las semillas se colocaron en cajas de Petri sobre una base de algodon y papel de filtro embebidos en agua destilada. La incubacion se realizo en la oscuridad y a una temperatura de 23 [+ o -] 2[grados] C. Una vez que las raices primarias alcanzaron una longitud aproximada de 1,5 cm se transplantaron las plantas a macetas con tierra y permanecieron en camara de crecimiento. Las plantas madre se mantuvieron a una temperatura de 23 [+ o -] 2[grados]C, con un fotoperiodo de 16 horas y con riego a capacidad de campo, luego de 3 meses, se regaron la semana previa a la obtencion de los explantos con 2 g/[L.sup.-1] de Benomyl, con el proposito de eliminar contaminantes endogenos.

Cultivo in vitro

Obtencion de los explantos

Se extrajeron de la planta madre los primeros 10 segmentos nodales y entrenudos consecutivos, partiendo desde el apice. Los explantos tuvieron una longitud aproximada de 1 cm.

Los explantos se desinfectaron superficialmente a traves de un pasaje por etanol al 96% seguido de una inmersion durante 15 min en una solucion de hipoclorito de sodio (NaClO) al 2% del valor comercial. A continuacion se hicieron 3 lavados con agua destilada esterilizada.

Condiciones de cultivo

Se uso un medio de cultivo compuesto por sales minerales de Murashige y Skoog (1962) (MS) con vitaminas de Gamborg et al. (1976) (B5), se adicionaron 30 g/[L.sup.-1] de sacarosa, 7,5 g/[L.sup.-1] de agar-agar y 1 mg/[L.sup.-1] de benciladenina (BA). El pH se ajusto a 5,8 con hidroxido de sodio (NaOH) y acido clorhidrico (HCl), antes del agregado del agar-agar. El medio de cultivo se coloco en tubos de vidrio con base plana, de 115 mm de alto por 25 mm de diametro, se los tapo con papel aluminio y se llevaron a autoclave durante 20 minutos a 120[grados]C y 1 atmosfera de presion.

De cada uno de los genotipos se sembraron 20 nudos y 30 entrenudos (15 en posicion vertical y 15 horizontal), un explanto por tubo. En la ubicacion de los segmentos nodales de manera vertical se respeto la orientacion de los mismos en la planta.

Se hizo un seguimiento de la respuesta de los explantos durante 35 dias. A los 21 se realizo un repique a igual medio fresco.

Luego de 2 meses de cultivo las plantas regeneradas se repicaron a frascos de mayor tamano (5,5 x 10 cm).

Condiciones de incubacion

El material vegetal se incubo en camara de crecimiento a una temperatura de 23 [+ o -] 2[grados]C, un fotoperiodo de 16 horas y una intensidad luminica de 60 [micro]mol/[m.sup.-2]/[s.sup.-1].

Pasaje a tierra

Las plantas obtenidas se trasplantaron a potes con una mezcla de perlita de lava volcanica y tierra (30/70) y se cubrieron con polietileno transparente. Durante 20 dias se mantuvieron en estas condiciones en la camara de crecimiento.

Histologia

Se tomaron muestras de los entrenudos a los 0, 2, 6 y 9 dias, y de los nudos a los 0, 2, 6, 9, 15 y 20 dias desde la implantacion, y se fijaron en una solucion de formaldehido, alcohol etilico 70%, acido acetico glacial y agua (F.A.A.) en las siguientes proporciones: 30:50:5:15.

Las muestras fueron incluidas en parafina, se cortaron en forma seriada a 18 [micro]m de grosor, se colorearon con Safranina-Fast Green (Strittmatter, 1979) y se realizo el montaje con balsamo de Canada.

Las fotomicrografias fueron tomadas con un microscopio Leitz equipado con una camara fotografica Olympus E-300.

Estadistica

Se realizo un analisis de la varianza a un criterio de clasificacion, y se aplico la transformacion raiz cuadrada del numero de segmentos nodales + 1. Se aplico la prueba de comparacion de medias de Tukey.

Resultados y discusion

Entrenudos

A partir de los 8 dias desde la siembra y en 35 dias de cultivo, los entrenudos de P. caerulea ubicados tanto horizontal como verticalmente en medio de cultivo con 1 mg/[L.sup.-1] de BA, generaron callos como unica respuesta. La formacion de los callos estuvo siempre precedida por un marcado engrosamiento del explanto, ocasionando en algunos casos la ruptura de la epidermis.

Los resultados del presente estudio, como aquellos obtenidos por Biasi et al. (2000) en entrenudos horizontales de P. edulis f. flavicarpa Deg., mostraron que los entrenudos presentaron un marcado engrosamiento seguido por una proliferacion celular en los extremos. Aunque los mismos autores observaron proliferacion de yemas asociadas con la formacion de callos a partir de las 2 semanas de la inoculacion en medio MS con diferentes concentraciones de BA (1 a 4 mg/[L.sup.-1]). Resultados similares obtuvo Moran (1979) utilizando como explantos entrenudos verticales de P. edulis f. flavicarpa y P. mollissima Bailey en medio de Nitsch (1968) con 2 mg/[L.sup.-1] de cinetina.

Segmentos nodales

Asi como existen diferencias en la respuesta al cultivo in vitro entre especies (Dornelas y Vieira, 1994), en este trabajo se encontraron respuestas diversas entre biotipos y explantos de una misma especie de Passiflora. Passos y Bernacci (2005) mencionan que las variaciones de respuesta entre localidades son mas evidentes cuando se realizan experimentos con especies poco domesticadas de pasiflora, en las que la variabilidad genetica existente es muy grande, y las respuestas se acentuan segun el explanto utilizado, las condiciones de incubacion --luz, temperatura y fotoperiodo--, los tipos de frascos de cultivo y los medios del mismo.

Para todos los biotipos la aparicion de los primeros brotes comenzo a los 7 dias posteriores a la siembra, los mismos se formaron a partir de yemas axilares preexistentes en los segmentos nodales. El mismo resultado obtuvieron Faria y Segura (1997a) en explantos apicales de P. edulis f. flavicarpa. Tambien se observo la presencia de callos en el extremo superior de los segmentos nodales.

En la figura 1 se muestra que la regeneracion de brotes a partir de los segmentos nodales fue diferente segun el biotipo.

[FIGURA 1 OMITIR]

El biotipo de Neuquen mostro los mayores porcentajes de segmentos nodales con brotes, llegando al dia 35 con un 94,74%, mientras que los de Corral de Bustos y Zavalla alcanzaron valores de 42,11 y 27,78% respectivamente, las diferencias fueron estadisticamente significativas (figura 1).

Es de destacar que en todos los biotipos la maxima respuesta se obtuvo en los primeros siete dias de cultivo.

A lo largo del ensayo algunas hojas se volvieron cloroticas y se desprendieron de los brotes, esto podria atribuirse a la produccion y acumulacion de etileno en los tubos. Este compuesto gaseoso es producido por la misma planta y es conocido por su rol en los procesos de senescencia. Faria y Segura (1997b) y Passos y Bernacci (2005) manifestaron tambien la presencia de clorosis y caida de hojas en distintas especies de Passiflora.

La aparicion de las raices comenzo a visualizarse a los 28 dias de la siembra a partir de callos generados en la base de los segmentos nodales. La rizogenesis ocurrio en el mismo medio que se empleo para inducir la regeneracion de brotes (1 mg/[L.sup.-1] de BA y sin auxinas), al igual que lo informado por Kantharajah y Dodd (1990), Dornelas y Vieira (1994), Kawata et al. (1995), que no emplearon auxinas para el enraizamiento. Moran (1979) propuso que la concentracion de auxinas en las plantas al momento de comenzar el cultivo seria suficiente para establecer el equilibrio adecuado con las citocininas para producir el enraizamiento. La formacion de raices y la generacion de brotes revelan el potencial morfogenetico de los segmentos nodales. Los estudios realizados por Faria y Segura (1997a) en P. edulis f. flavicarpa, indican que el enraizamiento se indujo utilizando auxinas como el acido indol-acetico (AIA) en el medio de cultivo.

La aclimatacion de las plantas se realizo de manera exitosa obteniendose plantas vigorosas en tierra a los 5 meses desde la siembra in vitro, el 100% de ellas sobrevivieron en estas condiciones. La aclimatacion de las plantas de diferentes especies de Passiflora obtenidas in vitro ha sido descrita por Guzzo et al. (2004), quienes utilizaron sustrato esterilizado en autoclave y la incubacion se realizo durante 3 semanas a una humedad del 100%. En el presente trabajo las plantas de P. caerulea fueron aclimatadas de manera exitosa durante 20 dias, utilizando sustrato no esterilizado y conservandose la humedad ambiente con bolsas de polietileno

Histologia

Caracterizacion de entrenudos

En la figura 2 A y B se observa el corte transversal (figura 2 A) y longitudinal (figura 2 B) de un entrenudo de P. caerulea al dia 0, donde se registran los tejidos constitutivos del explanto tales como epidermis, floema, xilema y parenquima medular.

A los 5 dias se observo en el extremo del entrenudo la proliferacion de callos a partir del tejido epidermico, los callos presentaron celulas con caracteristicas meristematicas y con nucleo central grande, estructuras tipicas de la organogenesis (figura 3 A). Esta estructura callosa continuo creciendo, lo que pudo evidenciarse a los 9 dias (figura 3 B).

Caracterizacion de segmentos nodales

En la figura 4 se observa la seccion longitudinal del segmento nodal de P. caerulea utilizado como explanto (dia 0).

[FIGURA 2 OMITIR]

En la figura 5 se observa, a los 15 dias de cultivo, una yema con sus primordios de hojas y la presencia de celulas en proliferacion con nucleo central. A los 20 dias se observa el crecimiento de la yema (figura 5 B).

En la figura 6 se muestra la formacion de raices en la masa callosa surgida en la base del tallo.

Para el genero Passiflora, la organogenesis in vitro a partir de diferentes tipos de explantos: foliares, cotiledonares, hipocotiledonares, entrenudos y raices, es la via de regeneracion predominante, pudiendo ser directa (Kantharajah y Dodd, 1990; Dornelas y Vieira, 1994; Appezzato-Da-Gloria et al., 1999; Gattuso et al., 2003) o indirecta (Monteiro et al., 2000; Lombardi et al., 2003).

Appezzato-Da-Gloria et al. (2005), trabajando con entrenudos de P. edulis f. flavicarpa, observaron intensa division de celulas de los parenquimas cortical y medular formando callos. A los 7 dias de cultivo, en la periferia de esa region de proliferacion celular notaron la formacion de areas meristematicas que posteriormente originaron primordios foliares. En la base de esos primordios tambien se formaron regiones meristematicas que originaron otras estructuras foliares. En este trabajo, los cortes histologicos mostraron que los entrenudos cultivados en medio de cultivo MS con vitaminas B5 y 1 mg/[L.sup.-1] de BA, formaron unicamente callo en los extremos del explanto, no hubo formacion de otras yemas, probablemente debido al medio de cultivo empleado.

Nakayama (1966), con medio basico de Fox y Miller (1959), y empleando 1 mg/[L.sup.-1] de cinetina, en segmentos de tallo de P. caerulea, obtuvo multiplicacion celular de tejidos indiferenciados y formacion de yemas a partir de los mismos. En el presente estudio se observo la organogenesis directa a partir de yemas axilares preformadas.

[FIGURA 3 OMITIR]

[FIGURA 4 OMITIR]

A los 20 dias de cultivo se observo la diferenciacion de raices, tal como lo informaron Appezzato-Da-Gloria et al. (1999) en P. edulis Sims flavicarpa Deg. utilizando explantos foliares.

[FIGURA 5 OMITIR]

Conclusiones

La mejor respuesta al cultivo in vitro se obtuvo con segmentos nodales de plantas de P. caerulea provenientes de la localidad de Neuquen.

En el medio de cultivo de Murashige y Skoog, con 1 mg/[L.sup.-1] de BA, los segmentos nodales de P. caerulea originan brotes a partir de las yemas axilares preformadas y raices que parten de callos en la base de los mismos. En iguales condiciones, los entrenudos originan callo como unica respuesta.

[FIGURA 6 OMITIR]

Recibido: marzo 16 de 2010 Aprobado: mayo 30 de 2011

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Cecilia Severin, Ingeniera Agronoma. Investigadora, Consejo de Investigaciones de la UNR, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Rosario. cseverin@fcagr.unr.edu.ar

Mirian Bueno, Ingeniera Agronoma. Magister en Manejo y Conservacion de Recursos Naturales, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Rosario.

Franco Santin, Licenciado en Biotecnologia, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Rosario.

Maria Graciela Giubileo, Estadistica Matematica. Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Rosario.
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Title Annotation:ARTICULO DE INVESTIGACION
Author:Severin, Cecilia; Bueno, Mirian; Santin, Franco; Giubileo, Maria Graciela
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Jul 1, 2011
Words:3812
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