Printer Friendly

Research for lipA and APRX genes in Corynebacterium bovis samples, and its growth under refrigeration/ Pesquisa dos genes lipA e APRX em linhagens de Corynebacterium bovis, e seu crescimento sob refrigeracao/ Presencia de los genes lipA y APRX en muestras de Corynebacterium bovis, y su desarrollo en refrigeracion.

INTRODUCAO

A mastite caracteriza-se como uma reacao inflamatoria da glandula mamaria, responsavel por alteracoes fisicas e quimicas do leite, pelo aumento na concentracao de celulas somaticas, e por alteracoes patologicas na propria glandula mamaria (1). Ha que se considerar ainda os aspectos de saude publica, pois o leite pode ser veiculo de microorganismos potencialmente patogenicos ao homem, seja pelo seu consumo direto "in natura", seja pela ingestao de certos tipos de alimentos produzidos a partir do leite contaminado (2).

Patogenos considerados de menor relevancia, como por exemplo, o Corynebacterium bovis, desempenham um papel pouco conhecido, porem nao menos importante neste processo, conforme demonstraram Yurukov & Todorov (3), que o isolaram em 73% das infeccoes subclinicas estudadas e Counter (4), com 87% de isolamento nos casos clinicos pesquisados.

Alguns autores classificam ainda os micro-organismos do genero Corynebacterium spp. como psicrotroficos, e Dommett (5) cita que os micro-organismos mais isolados apos a pasteurizacao a temperatura de 72[degrees]C ou 80[degrees]C por 15 segundos, sao os corineformes. O mesmo autor cita ainda que quanto maior a temperatura de pasteurizacao, maior a prevalencia deste genero, porem especificamente em relacao ao C. bovis, nao ha informacoes na literatura sobre a sua capacidade de multiplicacao em temperatura de refrigeracao, nem se apresentam genes especificos que codificam proteinas com caracteristicas lipoliticas e proteoliticas.

Victoria et al. (6) isolaram C. bovis em cultura pura em 29,45% das 125 glandulas mamarias estudadas, superando inclusive, o percentual de isolamento dos generos Staphylococcus spp. (18,64%) e de Streptococcus spp. (15,44%), e encontraram ainda alteracoes fisico-quimicas no leite de vacas com mastite por este agente, reforcando sua importancia nas infeccoes intramamarias.

Varios autores citam ainda como micro-organismos termoduricos mais frequentes, os generos Bacillus spp., Pseudomonas spp., Arthrobacter spp., Mycobacterium spp., Streptococcus spp., e Clostridium spp. (7, 5, 8, 9), e que micro-organismos do genero Corynebacterium spp. apresentam alem desta, outra caracteristica importante, que e a capacidade de multiplicacao sob temperatura de refrigeracao, sendo considerados entao como psicrotroficos.

Para Barbano et al. (10), a alta concentracao de bacterias psicrotroficas no leite cru e necessaria para que haja uma quantidade suficiente de proteases e lipases que causem a quebra das proteinas e gorduras apos a pasteurizacao. Por outro lado, Ma et al. (11) e Chen et al. (12) afirmaram que o tempo de prateleira do leite e dos produtos lacteos e comprometido por alteracoes fisico-quimicas e organolepticas produzidas por lipases e proteases termoestaveis produzidas por estes micro-organismos.

As lipases e proteases mesmo em baixas concentracoes sao capazes de degradar gordura e proteina causando respectivamente sabor de ranco e sabor amargo no leite e produtos lacteos estocados sob refrigeracao (13).

Dieckelmann et al. (14) estudando a diversidade de lipases em linhagens de Pseudomonas spp. citaram a presenca do gene lipA em P. fragi, P. fluorescens, P. aeruginosa e Burkholdeira spp. Duong et al. (15) tambem registraram a presenca do gene aprX em microorganismos psicrotroficos, especialmente em P. aeruginosa.

Nao ha na literatura citacoes sobre o papel do C. bovis como micro-organismo psicrotrofico, bem como, se este agente apresenta os genes que codificam as proteinas com a capacidade de degradar lipidios e proteinas. Porem, existe uma possibilidade de que o agente em questao apresente estes genes em seu DNA, uma vez que o seu genoma nao esta completamente sequenciado, segundo levantamentos realizados no Genbank.

Levando-se em consideracao o exposto, propos-se estudar este micro-organismo, objetivando especialmente verificar sua habilidade de crescimento em temperatura de refrigeracao, bem como a presenca ou ausencia dos genes lipA e aprX no seu genoma.

MATERIAL E METODOS

O experimento proposto foi realizado em duas etapas distintas. A primeira consistiu no isolamento das linhagens e na verificacao do crescimento de C. bovis sob temperatura de refrigeracao. Foram colhidas amostras de leite de vacas com mastite subclinica, de propriedades leiteiras do interior do estado de Sao Paulo, ate totalizar 100 linhagens de C. bovis em estado puro. As amostras foram obtidas apos a realizacao do California Mastitis Test (CMT), segundo Schalm e Noorlander (16), para a deteccao das glandulas mamarias com inflamacao. Colheu-se ao redor de 10mL de leite em tubos de ensaio esterilizados, que foram identificados, mantidos em caixas isotermicas contendo gelo reciclavel, e encaminhados ao laboratorio para o processamento.

Semeou-se ao redor de 0,03mL de leite de cada amostra, em placas de Petri contendo agar sangue ovino a 8%, e em placas com agar MacConkey. Em seguida incubou-se em estufa a 37[degrees]C, em condicoes de aerobiose, e a leitura foi realizada com 24, 48, 72 e 96 horas para a observacao do crescimento do agente, ou de outros micro-organismos causadores de mastites. No caso de suspeita de isolamento de Corynebacterium spp procedeu-se o estudo morfologico pela coloracao de Gram e repique do agente em meio de caldo cerebro coracao enriquecido com 1% de Tween 80, com a incubacao dos tubos por 24 a 48 horas para o re-isolamento do agente para sua caracterizacao bioquimica de acordo com Quinn et al. (17), com a realizacao das seguintes provas: verificacao de hemolise, hidrolise da esculina, reducao de nitrato, digestao da caseina, urease, glicose, maltose e sacarose.

Tres amostras foram perdidas durante o processamento, totalizando 97 linhagens estudadas.

Para a verificacao do crescimento de C. bovis sob temperatura de refrigeracao, colonias de cada cepa recem isolada foram ressuspendidas em tubos de ensaio contendo 5mL de meio de caldo cerebro coracao (BHI) e 1% de Tween 80 (18), ate a obtencao da concentracao bacteriana correspondente a escala 1 de McFarland (3 x [10.sup.8] celulas bacterianas por mL).

Como controle negativo, utilizou-se uma solucao pura de BHI com 1% de Tween 80, e como controle positivo, uma suspensao bacteriana de P. aeruginosa ATCC - 10145 tambem na concentracao 1 da escala de McFarland.

Foram preparadas quatro placas de ELISA estereis com noventa e seis pocos, fundo chato e tampa, identificadas como placas 1, 2, 3 e 4 para cada momento (M0 a M9) totalizando 40 placas. As placas de numero 1 continham os controles negativo e positivo, bem como as amostras de 1 a 30, distribuidas da seguinte maneira: os orificios A1, A2 e A3 receberam 100 [micro]L da suspensao do controle positivo; os orificios A4, A5 e A6, 100[micro]L da suspensao do controle negativo, os demais orificios foram preenchidos com 100[micro]L de cada amostra, sempre em triplicata a exemplo dos controles. As placas de numero 2, 3 e 4, receberam as amostras de 31 a 62, 63 a 95 e 96 a 97 respectivamente, distribuidas como descrito acima.

Apos a distribuicao das amostras nas placas procedeu-se a leitura do primeiro conjunto de placas 1, 2, 3 e 4, em espectrofotometro Multiskan EX [1] com filtro de 405nm, correspondendo ao momento zero (M0). Os demais conjuntos de placas correspondentes os momentos M1 a M9 foram incubados em condicoes de aerobiose em temperaturas que variaram entre 0,7 e 4[degrees]C, em refrigerador comum destinado a essa finalidade. A cada 24 horas e durante nove dias consecutivos foram realizadas leituras referentes a cada momento, apos homogeneizacao cuidadosa das placas e remocao das goticulas de agua formadas por condensacao em virtude da diferenca de temperatura entre as placas e o meio ambiente, remocao esta que foi feita com o auxilio de um bico de Bunsen.

A segunda fase do experimento consistiu na verificacao da presenca ou ausencia dos genes lipA e aprX responsaveis pela producao de lipases e proteases bacterianas, respectivamente.

Para cada cepa isolada, bem como para os controles positivos e negativos, foi realizada a extracao de DNA segundo Nunes et al. (19). Transferiu-se 1mL da suspensao bacteriana na concentracao 1 da escala de MacFarland, para microtubos de 1,5mL. Centrifugou-se por quatro minutos a 2500 x g, e o sobrenadante foi desprezado. O precipitado foi lavado tres vezes com 1mL da solucao tampao TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8). A seguir, as celulas bacterianas foram ressuspendidas em 100[micro]L de tampao TE, aquecidas a 100[degrees]C por 10 minutos em termobloco, resfriadas a 4[degrees]C e centrifugadas a 9000 x g por 30 segundos.

Apos o termino da extracao, 60[micro]L de cada amostra foram analisados em espectrofotometro GeneQuant Pro [1] para a quantificacao do DNA extraido. Todas as amostras foram padronizadas para conter entre 85 e 95[micro]g/mL de DNA, incluindo os controles positivos.

O sobrenadante resultante do processo de extracao foi transferido para microtubos e congelado a -20[degrees]C para posterior analise pela reacao em cadeia pela polimerase (PCR).

Como controles positivos para a presenca dos genes lipA e aprX, foram utilizadas, respectivamente, linhagens de C. glutamicum ATCC - 13032, e B. liqueniformis ATCC 14580 obtidas do Catalogo de Culturas Tropical, da Fundacao Andre Tosello.

Para a pesquisa do gene lipA no DNA de C. bovis foram utilizadas as seguintes sequencias de oligonucleotideos: lipA sense 5'-TGTCGCTGAGTCTGTTCGTGAG-3', lipA anti-sense 5' -GATGATGTCACAGCCAGCGTC-3' desenhados a partir do DNA do C. glutamicum com o numero de acesso BX927154 e para a pesquisa do gene aprX, as sequencias: aprX sense 5'-GTGCACGAAGCGCTGACAATC-3' e aprX anti-sense 5' TTGCTCGGTGAAGGAGACGTTG-3', desenhados a partir do DNA do B. liqueniformis com o numero de acesso NC 006322 utilizando os softwares Gene Runner 3.0, AnnHyb 4.920 e MEGA 3.1.

Para a reacao em cadeia pela polimerase para a pesquisa do gene lipA, cada microtubo de reacao de 0,2mL recebeu 5[micro]L de tampao de PCR (50mM KCl, 10mM Tris-HCl), 1,5[micro]L de Mg[Cl.sub.2] (1, 5mM), 8,0[micro]L da solucao de deoxinucleotideos (1,25mM), 1,5U de Taq-polimerase platinum, 10[rho]M de cada iniciador descrito anteriormente, 10[micro]L de amostra e 15,2[micro]L de agua ultra-pura. A seguir os microtubos foram submetidos a denaturacao inicial a 92[degrees]C por 3 minutos, seguido de 30 ciclos de reacao consistindo de denaturacao a 92[degrees]C por 1 minuto, anelamento a 60[degrees]C por 1 minuto e extensao a 72[degrees]C por 1 minuto, sendo a reacao finalizada com extensao a 72[degrees]C por 3 minutos (19).

Para a pesquisa do gene aprX foi utilizado o mesmo protocolo descrito para o gene lipA, porem com a substituicao pelos iniciadores descritos acima.

Para a eletroforese em gel de agarose para identificacao dos produtos amplificados, aliquotas de 10[micro]L das amostras amplificadas foram homogeneizadas com 5[micro]L de solucao de azul de bromofenol e submetidas a eletroforese horizontal em gel de agarose 1, 5% em tampao tris-borato-EDTA 0,5x. A corrida foi realizada a 100 voltz por 90 minutos. Apos a corrida o gel foi corado em solucao de brometo de etideo por uma hora, e a visualizacao das bandas realizada em transluminador ultravioleta, com filtro de 300nm. Os geis foram fotografados utilizando-se sistema fotografico Polaroid.

Para a analise estatistica dos dados referentes a verificacao da temperatura de crescimento do agente, foram utilizados os valores de media para cada amostra analisada. Inicialmente foi realizada uma analise de variancia seguida do teste de comparacoes multiplas de Tukey-kramer, com nivel de significancia ([alpha]) de 0,05.

RESULTADOS E DISCUSSAO

Quanto ao crescimento de C. bovis em temperatura de refrigeracao, a tabela 1 expressa os valores de temperaturas aferidos no interior do refrigerador, no momento de cada leitura.

A figura 1 revela os resultados relativos aos valores de absorbancia podendo-se observar uma tendencia para a concentracao bacteriana nos diferentes momentos analisados. Os resultados mostram que ate o momento 5 (M5), houve uma pequena tendencia de desenvolvimento de C. bovis, porem sem significado estatistico, com P>0,05. Ja a partir do momento M5 ate M8, houve um crescimento estatisticamente significante, com P<0,05. O crescimento pouco significativo das amostras nos primeiros momentos do experimento pode estar relacionado com a adaptacao do agente a temperatura de incubacao utilizada, ou ainda pelo "estresse" promovido as celulas bacterianas devido a alteracao brusca de temperatura a que foram submetidas as linhagens entre os momentos M0 e M1.

[FIGURE 1 OMITTED]

Apos a fase de adaptacao, houve uma multiplicacao significativa do agente o que pode confirmar a hipotese de que o C. bovis se multiplica em temperatura de refrigeracao, e que longos periodos de armazenagem a baixas temperaturas antes de seu processamento na industria, pode favorecer a sua multiplicacao (12).

Entre os momentos M6 e M9 houve uma reducao estatisticamente significante nos valores medios de absorbancia nas amostras. Este fato pode estar relacionado com a ruptura das celulas bacterianas apos intensa multiplicacao dos micro-organismos em que os produtos do metabolismo bacteriano atingiram um nivel de toxicidade capaz de promover a morte destas bacterias, ou ainda com a reducao de volume da solucao final em virtude da evaporacao provocada pela longa fase de incubacao das amostras.

Os dados obtidos no presente experimento sao contrarios aos de Bramley e Mckinnon (20) que afirmaram nao haver evidencias de que o C. bovis seja um micro-organismo psicrotrofico, mas sim que a presenca deste agente esta relacionada a uma contaminacao ambiental inicial muito alta, como aquelas encontradas em sistemas de ordenha com problemas de higiene. Sao contrarios ainda aos de Faria (21) e Santos et al. (22) que nao consideraram sua capacidade de se multiplicar em temperaturas de refrigeracao. Por outro lado Dommett (5) afirmou que os micro-organismos psicrotroficos mais encontrados apos os processos de pasteurizacao, sao os corineformes.

Da mesma forma Thomas (7), Sorhaug e Stepaniak (8), Santana et al. (9) e Chen et al. (12) referiram que micro-organismos do genero Corynebacterium spp se multiplicam sob temperatura de refrigeracao e corroboram com o presente estudo, permitindo-se nestas condicoes, afirmar que C. bovis e um microorganismo psicrotrofico.

Quanto a pesquisa dos genes lipA, os resultados revelaram que C. glutamicum utilizado como controle positivo, apresenta a sequencia alvo pesquisada, com a formacao da banda de 397bp, indicando a presenca do gene lipA em seu genoma o que nao ocorreu com nenhuma das amostras de C. bovis analisadas.

A ausencia de informacoes na literatura sobre pesquisa de genes produtores de lipases e proteases no DNA de C. bovis, nao permite uma discussao mais profunda, porem analisando os resultados obtidos e baseados nas condicoes do presente experimento, pode-se afirmar que o C. bovis nao apresenta o gene lipA. Portanto quando Faria (21) e Santos et al. (22) afirmaram que micro-organismos do genero Corynebacterium spp. produzem lipases e proteases termo-resistentes, provavelmente esta producao se relacione a outros genes nao pesquisados no presente estudo.

Quanto a pesquisa do gene aprX, os resultados confirmaram que B. liqueniformis, utilizado como controle positivo, possui a sequencia alvo pesquisada para o gene aprX, o que nao aconteceu em nenhuma linhagem de C. bovis. Portanto pode-se afirmar que o microorganismo pesquisado, nas condicoes do presente experimento, nao possui o gene aprX. Estes resultados sao contrarios aos encontrados por Faria (21), Duong et al. (23), Liao e McCallus (24) e Santos et al. (22), que afirmaram que micro-organismos psicrotroficos produzem lipases e proteases termo-resistentes, embora nao se possa afirmar que tais micro-organismos nao produzam outras enzimas proteoliticas codificadas por outros genes nao pesquisados no presente estudo.

Assim, pode-se concluir que C. bovis possui a capacidade de se multiplicar sob temperatura de refrigeracao, o que foi verificado no presente estudo, podendo comprometer a qualidade do leite armazenado por longos periodos de tempo. Conclui-se ainda que a nao deteccao dos genes aprX e lipA no DNA do micro-organismo, indica que C. bovis nao produz proteases e lipases codificadas por estes genes, e que a refrigeracao do leite cru nas propriedades leiteiras pode favorecer a multiplicacao de micro-organismos psicrotroficos, como os corineformes, os quais podem promover alteracoes na composicao do leite cru e de seus derivados.

REFERENCIAS

(1.) Domingues PF. Novas tendencias no tratamento da mastite bovina. In: Anais do 2[degrees] Encontro de pesquisadores em mastite bovina do estado de Sao Paulo; 1996, Nova Odessa. Nova Odessa; 1996. p. 33-43.

(2.) Muciollo P. Aspecto da inspecao e fiscalizacao higienico-sanitaria do leite. Rev Inst Laticinios Candido Tostes. 1977; (nov-dec): 15-9.

(3.) Yurukov M, Todorov D. Aetiology of sub clinical mastitis in cows of various breeds in Bulgaria. Vet Med Nauki. 1977; 14: 263-6.

(4.) Counter DE. Outbreak of bovine mastitis associated with Corynebacterium bovis. Vet Rec. 1981; 108: 560-1.

(5.) Dommett TW. Spoilage of aseptically packaged pasteurized liquid dairy products by thermoduric psychrotrophs. Food Aust. 1992; 44(10): 459-61.

(6.) Victoria C, Da Silva AV, Elias AO, Langoni H. Corynebacterium bovis e os padroes de contagem de celulas somaticas no Brasil. Arq Cienc Vet Zool. 2005; 8(2): 161-4.

(7.) Thomas SB. Sources, incidence and significance of psychrotrophic bacteria in milk. Milchwissenschaft. 1966; 27: 270-5.

(8.) Sorhaug T, Stepaniak L. Psychrotrophs and their enzymes in milk and dairy products: quality aspects. Trends Food Sci Technol. 1997; 8: 35-40.

(9.) Santana EHW, Beloti V, Barros MAF. Microrganismos psicrotroficos em leite. Hig Aliment. 2001; 15(88): 27-33.

(10.) Barbano DM, Ma Y, Santos MV. Influence of raw milk quality on fluid milk shelf-life. J Dairy Sci. 2006; 89 suppl: E15-9.

(11.) Ma Y, Ryan C, Barbano DM, Galton DM, Ruddan MA, Boor KJ. Effects of somatic cell count on quality and shelf-life of pasteurized fluid milk. J Dairy Sci. 2000; 88: 264-74.

(12.) Chen L, Daniel RM, Coolbear T. Detection and impact of protease and lipase activities in milk and milk powders. Int Dairy J. 2003; 13: 255-75.

(13.) Collins EB. Heat resistent psychrotropic microorganisms. J Dairy Sci. 1981;64(1):157-60.

(14.) Dieckelmann M, Johnson LA, Beacham IR. The diversity of lipases from psychrotrophic strains of Pseudomonas: a novel lipase from a highly lipolytic strain of Pseudomonas fluorescens. J Appl Microbiol. 1998; 85: 527-36.

(15.) Duong F, Bonnet E, Geli V, Lazdunski A, Murgier M, Filloux A. The aprX protein of Pseudomonas aeruginosa: a new substrate for the Apr type I secretion system. Gene. 2001; 262: 147-53.

(16.) Schalm OW, Noorlander DO. Experiments and observation leading to development of California Mastitis Test. J Am Vet Med Assoc. 1957; 130: 199-204.

(17.) Quinn PJ, Markey BK, Carter ME, Donnelly WJ, Leonard FC. Microbiologia veterinaria e doencas infecciosas. Porto Alegre: Artmed; 2005.

(18.) Watts JL, Lowery DE, Teel JF, Rossbach S. Identification of Corynebacterium bovis and other coryneforms isolated from bovine mammary glands. J Dairy Sci. 2000; 83: 2373-9.

(19.) Nunes ELC, Dos Santos KR, Mondino PJ, Bastos MCF, Giambiagi-Demarval M. Detection of ileS-2 gene enconding mupirocin resistence in methicillin-resistant Staphylococcus aureus by multiplex PCR. Diagn Microbiol Infect Dis. 1999; 34: 77-81.

(20.) Bramley AJ, Mckinnon CH. The microbiology of raw milk. In: Dairy microbiology: the microbiology of milk. 2a ed. London/NewYork: Elsevier Science Ltda; 1990. p. 163-207.

(21.) Faria JAF. Vida de prateleira do leite de consumo. Inf Agropecu. 1986; 12(137): 38-45.

(22.) Santos ES, Carvalho EP, Abreu LR. Psicrotroficos: consequencias de sua presenca em leites e queijos. Bol Soc Bras Cienc Tecnol Aliment. 1999; 33(2): 129-38.

(23.) Duong F, Lazdunski A, Cami B, Murgier M. Sequence of a cluster of genes controlling synthesis and secretion of alkaline protease in Pseudomonas aeruginosa: relationship to other secretory pathways. Gene. 1992; 121: 47-54.

(24.) Liao C, Mccallus DE. Biochemical and genetic characaterization of an extracelular protease from Pseudomonas fluorescens CY091. Appl Environ Microbiol. 1998; 64(3): 914-21.

Recebido em: 16/02/11 Aceito em: 02/05/11

Cassiano Victoria [1]

Rodrigo Costa da Silva [2]

Felipe Gazza Romao [3]

Helio Langoni [4]

[1] Professor Assistente Doutor da Faculdade de Medicina Veterinaria e Zootecnia da UNESP--Campus de Botucatu--SP, do Departamento de Higiene Veterinaria e Saude Publica. email:cassiano@fmvz.unesp.br.

[2] Pos-doutorando da Faculdade de Medicina Veterinaria e Zootecnia--UNESP--Botucatu--SP, do Departamento de Higiene Veterinaria e Saude Publica.

[3] Nucleo de Pesquisa em Mastites--Faculdade de Medicina Veterinaria e Zootecnia--UNESP--Botucatu--SP.

[4] Professor Titular da Faculdade de Medicina Veterinaria e Zootecnia da UNESP--Campus de Botucatu--SP, do Departamento de Higiene Veterinaria e Saude Publica.

[1] Labsystems

[1] Biochrom
Tabela 1. Afericao da temperatura interna do refrigerador
nos momentos M0 a M9 do experimento, para verificacao da
curva de crescimento de C. bovis. Botucatu, SP.

MOMENTOS    TEMPERATURA ([degrees]C)

M0            TEMPERATURA AMBIENTE

M1                2,0[degrees]C
M2                1,8[degrees]C
M3                3,1[degrees]C
M4                0,7[degrees]C
M5                4,0[degrees]C
M6                2,2[degrees]C
M7                2,8[degrees]C
M8                3,2[degrees]C
M9                2,5[degrees]C
COPYRIGHT 2011 Universidade Estadual Paulista. Facultade de Medicina Veterinaria e Zootecnia
No portion of this article can be reproduced without the express written permission from the copyright holder.
Copyright 2011 Gale, Cengage Learning. All rights reserved.

Article Details
Printer friendly Cite/link Email Feedback
Author:Victoria, Cassiano; Costa da Silva, Rodrigo; Romao, Felipe Gazza; Langoni, Helio
Publication:Veterinaria e Zootecnia
Date:Sep 1, 2011
Words:3380
Previous Article:Risk factors to leptospirosis, leishmaniasis, neosporosis and toxoplasmosis in domiciliated and peridomiciliated dogs in botucatu-sp/ Fatores de...
Next Article:Evaluation of biosecurity levels of breeding swine certified operations in the state of sao paulo, brazil/Avaliacao dos niveis de biosseguridade das...
Topics:

Terms of use | Privacy policy | Copyright © 2018 Farlex, Inc. | Feedback | For webmasters