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Rescate de embriones para la obtencion de vitroplantas de vid (Vitis vinifera L.).

Embryos rescue for the obtaining of grapevine (Vitis vinifera L.) vitroplants

Introduccion

La vid (Vitis vinifera L.) es originaria de la region de Caspio, en Asia menor desde donde se fue extendiendo hacia el este y el oeste. Se cultiva desde los anos 6.000 a 4.000 A.C., lo que la hace una de las plantas mas antiguamente cultivadas (Enjalbert, 1975). Se ubica dentro de los frutales, como uno de los de mas alta tradicion e historia en el mundo, siendo cultivado entre 50[grados] latitud Norte y 45[grados] latitud Sur. La superficie con vinedos en el mundo representa alrededor de 7.9 millones de hectareas (Almanza, 2011).

El fruto de la vid es utilizado actualmente en postres, jugos, vinos y como uva pasa entre otros; adicionalmente la uva contiene una amplia cantidad de antioxidantes como el resveratrol, el cual ha sido positivamente ligado en el tratamiento de ciertos tipos de cancer, enfermedades del corazon y nerviosas, infecciones virales y Alzheimer (Singh et al., 2011).

En el ano 2009 la produccion mundial de vid fue de 66935199 t cultivadas en 7437141 ha, de las cuales Colombia tenia plantadas 2581 ha (FAO, 2011). El Departamento del Valle del Cauca (1000 msnm) es el mayor productor de uva de mesa; durante el ano 2007 se tenian plantadas 2.045 ha, con producciones de 33.907 t, con rendimientos de 16.58 t/ ha, aportando el 90.63% de la produccion nacional (Agronet, 2011).

En el genero Vitis se reconocen dos tipos de apirenia (variedades sin semilla): una que ocurre por partenocarpia, en la cual el fruto se forma sin polinizacion ni fertilizacion, y otra, mas generalizada, que es producto de la estenospermia, es decir, del aborto de los embriones al inicio del desarrollo del fruto (Kanamadi et al., 1999; Aguero et al., 2000). Estos frutos estenospermocarpicos requieren de una fertilizacion normal, por lo que el polen de estas variedades debe ser viable (Perl et al., 2000).

El metodo clasico de mejoramiento genetico en variedades apirenas ha estado basado en el cruzamiento de un padre apireno con variedades semilladas usadas como madres (Perl et al., 2000). Sin embargo, usando esta estrategia la probabilidad de obtener descendientes apirenos es inferior al 50%. El desarrollo de tecnicas de cultivo de tejidos in vitro ha posibilitado la produccion de un mayor porcentaje de progenies apirenicas cuando ambos progenitores son no semillados. La tecnica consiste en "rescatar" los embriones inmaduros antes de que aborten y cultivarlos en un medio de cultivo bajo condiciones artificiales posibilitandoles su desarrollo normal (Ramming, 1990).

El cultivo in vitro es una tecnica extremadamente util para la rapida introduccion de nuevos clones, propagacion y mantenimiento de plantas libres de virus, para la conservacion de germoplasma y estudios fisiologicos (Perez- Ponce, 1998). En la uva el primer trabajo de cultivo in vitro fue el realizado por Morel en 1948 (Bouquet y Torregrosa, 2003).

Debido a la dificultad que presenta la vid para ser obtenida a partir de semillas, se estudio la tecnica de rescate de embriones de Vitis vinifera L. como metodo alternativo para obtener material sano y en menor tiempo, a partir del cual se obtendran los callos friables para ser utilizados posteriormente (Fase II) en suspensiones celulares que permitan la adquisicion de metabolitos secundarios de interes comercial e industrial.

Materiales y metodos

El trabajo se realizo en el Laboratorio de Biotecnologia Vegetal del Politecnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid, ubicado en el Centro de Laboratorios y Experimentacion (CLE), Sede Bello, Medellin, Colombia, a 1.420 msnm con una temperatura ambiente promedio de 25[grados]C.

Material vegetal

Se utilizaron como explantes semillas inmaduras de frutos de vid (Vitis vinifera L.) de la variedad Red Globe de uso comercial, previamente seleccionados, como material de inicio para la obtencion de plantulas y el rescate de embriones.

Establecimiento in vitro

Desinfeccion

Para la siembra de semilla y el rescate de embriones, las semillas se lavaron con abundante agua y jabon Tego51[R] al 2% para remover los residuos de mucilago (pulpa). Posteriormente, se realizo un raspado suave a las semillas (escarificacion) con el proposito de acelerar el proceso de germinacion. Se llevaron a la camara de flujo laminar para realizar la desinfeccion sumergiendolas en etanol al 70% y luego en hipoclorito de sodio al 2.5% adicionando dos gotas de Tween20[R] en 100 ml de solucion, realizando a continuacion cuatro lavados con agua destilada esteril. Igualmente, se hicieron otros ensayos sumergiendo las semillas en 5 g/l de acido dicloroisocianurico (NaDCC) y 2 g/l de Benomyl[R] con diferentes tiempos de inmersion de la semilla; luego se realizo la siembra en la camara de flujo laminar, colocando cuatro semillas por cada fras co utilizado en todos los experimentos. Para determinar el porcentaje de desinfeccion, se tuvo en cuenta la presencia o no, tanto de hongos como de bacterias en el medio de cultivo, pero sin entrar a su descripcion y detalle taxonomico y morfologico.

En la tabla 1 se describen los diferentes experimentos realizados con sus respectivos tratamientos para el proceso de desinfeccion.

Obtencion de plantulas a partir de semillas

Las semillas se sembraron una vez desinfectadas en el medio MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con sacarosa (30 g/l), Phytagel[R] (2.7 g/l), el antioxidante polivinilpirrolidona (PVP) (200 mg/l), al cual se le adiciono igualmente acido indolacetico (AIA) en concentraciones de 0, 1.0, 1.5 y 2.0 mg/l vs acido giberelico (AG3) en concentraciones de 0, 0.5 y 1.0 mg/l; se hizo otro ensayo con la adicion de AIA en concentraciones de 0, 1.0, 1.5 y 2.0 mg/l vs kinetina (K) en concentraciones de 0, 0.5 y 1.0 mg/l. El pH fue ajustado a 5.6. El medio de cultivo se esterilizo a 121[grados]C por 20 minutos. Se utilizaron 600 semillas debidamente desinfectadas las cuales se sembraron en la camara de flujo laminar y posteriormente se colocaron bajo condiciones de luz blanca proveniente de lamparas fluorescentes de 40 w.

Obtencion de plantulas a partir de rescate de embriones

Se realizo otro experimento en el cual las semillas inmaduras se extrajeron de los frutos de la vid en forma aseptica y se sembraron cuatro semillas por frasco con 20 ml de medio de cultivo MS (1962), suplementado con 20 g/l de sacarosa, 2.7 g/l de Phytagel[R], 100 mg/l de PVP, 0.35 mg/l de AG3 y 1.75 mg/l de AIA de acuerdo a lo descrito por Ponce et al. (2009). Posteriormente, los frascos se colocaron a 25 [+ o -]2[grados]C. Al cabo de un mes, se abrieron las semillas y se extrajeron los embriones utilizando un estereomicroscopio, colocandolos en frascos con 20 ml de medio de cultivo MS 1 y MS 2 como se muestra en la tabla 2. Los frascos con los embriones permanecieron una semana en oscuridad y luego se llevaron a camaras de cultivo a 25[+ or -]2[grados]C con un fotoperiodo de 12 horas con luz blanca proveniente de lamparas fluorescentes de 40w.

Diseno estadistico

Para todos los experimentos realizados se empleo un diseno de clasificacion experimental completamente aleatorizado, efecto fijo de tipo balanceado, con igual numero de replicaciones por tratamiento (10 frascos cada uno con 4 semillas), se trabajo con un nivel de confiabilidad del 95%. En el experimento en el cual se evaluo la accion de los medios de cultivo para el desarrollo del embrion, este se suplemento con la aplicacion de analisis multivariante de la varianza MANOVA, con contraste canonico de tipo ortogonal, determinando por via maxima de verosimilitud la dimensionalidad del contraste. Para todos los experimentos se empleo transformacion de datos, debido a la naturaleza de las variables respuesta, utilizando la familia Box-Cox, obteniendo el lambda por el criterio de la maxima probabilidad. El proceso estadistico se realizo en el paquete estadistico SAS[R] version 9.0.

Resultados y discusion

Desinfeccion

Alvarado et al. (1993) y Alvarado et al. (1998) afirman que en la tecnica del cultivo in vitro, los contaminantes que se encuentran mas comunmente son los hongos filamentosos, las bacterias y las levaduras, los cuales generan perdidas considerables desde el punto de vista investigativo y economico. La contaminacion puede tener dos origenes: a- microorganismos que colonizan la superficie o el interior del explante (endofitos) y b- microorganismos introducidos durante la manipulacion en el laboratorio (Debergh y Zimmerman, 1990).

En este estudio se evaluaron tres formas de desinfeccion de la semilla de uva, utilizando 200 semillas en cada uno de los tratamientos realizados, observando en cada uno de ellos la presencia o ausencia de microorganismos como hongos, bacterias y levaduras principalmente, como indicadores para evaluar el porcentaje de contaminacion, pero sin entrar en un estudio detallado de su morfologia y taxonomia.

Se encontro que al realizar un lavado con 5 g/l de NaDCC por 15 minutos y luego con Benomyl[R] por 15 minutos (experimento 3, tratamiento 3), se obtuvo el menor porcentaje de contaminacion (8%) lo que corresponde a una muy baja presencia de hongos, bacterias y levaduras, comparado con los tratamientos 1, 2, 4 y 5 del mismo experimento, en los cuales se presento el 14, 16, 18 y 20% de contaminacion, respec tivamente, tal y como se observa en la tabla 3. En los experimentos 1 y 2 el porcentaje de contaminacion en todos los tratamientos realizados, fue superior al 70%, por lo que no se hace un analisis muy detallado de ellos. En este estudio se reporta por primera vez, el uso de NaDCC para la desinfeccion de la semilla de la uva, mostrando que para esta especie no es necesaria la utilizacion de hipoclorito de sodio ni etanol al 70%.

De acuerdo con los analisis estadisticos, que se muestran en la tabla 4, se observo que para los experimentos 1 y 2 no se presento diferencia estadistica entre los tratamientos utilizados para la desinfeccion (P>0.05). No asi para el experimento 3, en el cual se presento diferencia altamente significativa entre el tratamiento 3 con respecto a los demas tratamientos de dicho experimento (P< 0.0001) (tabla 3), por lo que se considera que este es el mejor tratamiento de desinfeccion de la semilla de uva.

En este estudio se encontro que la principal fuente de contaminacion fueron bacterias de diferentes tipos; la incidencia de hongos en los diferentes tratamientos fue bastante baja, posiblemente debido a la accion antifungica tanto del Benomyl[R] como del NaDCC.

Al igual que en los estudios realizados por Pasqual y Ferreira (2007), en este trabajo se encontro que el empleo de fungicidas de amplio espectro, mezclado con fungicidas de contacto y bactericidas previo al cultivo in vitro, mostraron resultados positivos para el control de un amplio rango de microorganismos, sin generar efectos fitotoxicos ni dano en el material vegetal.

Efecto del AIA en combinacion con diferentes concentraciones de AG3 y K para la obtencion de plantulas a partir de semillas.

Los experimentos realizados en este estudio para la obtencion de vitroplantas, no permitieron la germinacion de la semilla, lo cual posiblemente se deba a las caracteristicas morfologicas y fisiologicas de la semilla de la uva, y por lo tanto, se deben practicar ensayos de otro tipo a los realizados en este estudio. Luquez y Formento (2002) encontraron que en la semilla de uva el tegumento externo se alarga en la zona de la micropila para formar el pico, con grupos de esclereidas e idioblastos. La capa mas externa papiracea tiene una gruesa cuticula. La capa media es parenquimatosa o colapsada. La capa interna dura presenta esclereidas con pared secundaria lignificada, cada una con un cristal. El tegumento interno tiene su capa mas externa con engrosamientos espiralados y la capa mas interna, rica en taninos y de paredes radiales con engrosamientos irregulares, caracteristicas que posiblemente tengan relacion con la nula germinacion in vitro de la uva a partir de la semilla, lo cual nos llevo a utilizar la tecnica biotecnologica del rescate de embriones.

Sin embargo, proponemos continuar realizando mas estudios sobre la germinacion in vitro a partir de semillas de Vitis vinifera L

Efecto de los medios de cultivo MS 1, MS 2 y dos concentraciones diferentes de sacarosa para la obtencion de plantulas a partir del rescate de embriones

Como se menciono anteriormente, la tecnica del rescate de embriones consiste en "salvar" los embriones inmaduros antes de que aborten y cultivarlos en un medio de cultivo bajo condiciones artificiales que permita su desarrollo normal (Ramming, 1990). El rescate de embriones esta influenciado por varios factores (Ponce et al., 2000; Liu et al., 2003), siendo uno de los mas importantes el genotipo de la variedad usada como madre (Ji et al., 2013) el medio de cultivo y el estado de maduracion de la semilla (Garcia et al., 2000; Notsuka et al., 2001; Valdez, 2005).

Son muy pocos los trabajos realizados con vid (Vitis vinifera L.) en los cuales se haya reportado la obtencion de un alto porcentaje de vitroplantas a partir del rescate de embriones. Ponce et al. (2009), adaptaron para la vid la tecnica del rescate de embriones, permitiendo la obtencion de plantas por cruzamiento directo entre cultivares sin semilla; el porcentaje promedio de plantulas obtenidas es bajo, alrededor del 10%. La presencia de taninos, fenoles u otras sustancias toxicas que pueden acumularse en el medio de cultivo debido a la manipulacion del explante, posiblemente conlleven al aborto in vitro de la semilla, disminuyendo de esta manera el porcentaje de plantulas en el cultivo (Valdez, 2005).

[FIGURA 1 OMITIR]

En este trabajo se evaluo el efecto de los medios de cultivo MS 1, MS 2 y la sacarosa para la obtencion de plantulas a partir de los embriones rescatados. Se observo que en el medio MS 1, se presento el mayor porcentaje de plantulas a los 30 dias de 100 embriones rescatados (40%) y mayor longitud promedio del tallo de las plantulas (4.5 cm), comparado con el medio MS 2, el cual mostro un porcentaje de plantulas obtenidas del 21% y una longitud del tallo de 2.1 cm en el mismo periodo de tiempo (tabla 5, figura 1). Se encontraron diferencias significativas a los 15 y a los 30 dias entre los medios MS 1 y MS 2 para las variables evaluadas (P<0.05).

De acuerdo con el analisis multivariado de la varianza realizado para el experimento, el efecto de los medios de cultivo MS 1, MS 2 y dos concentraciones diferentes de sacarosa para la obtencion de plantulas a partir del rescate de embriones, se pudo detectar al evaluar de manera simultanea el porcentaje de plantulas obtenidas y el promedio de la longitud del tallo a los 15 y 30 dias, diferencias altamente significativas entre los dos medios de cultivo utilizados (P<0.001) tal y como se observa en la tabla 6.

Guinazu et al. (2005) y Bouquet y Torregrosa (2003), mencionan que generalmente en vid se emplea el medio MS, pero frecuentemente con los macronutrientes diluidos a la mitad. Peros et al. (1998) al cultivar in vitro 32 cultivares e hibridos intraespecificos de Vitis vinifera determinaron que una reduccion de los macronutrientes favorecia la formacion de raices mientras que Harris y Stevenson mencionados por el mismo, encontraron que la iniciacion de raices no fue afectada por la concentracion de sales, pero el crecimiento de las mismas fue mayor al reducir el contenido de sales del medio.

Las plantas del medio de cultivo MS 1, se observaron con mejor vigor a nivel del tallo comparadas con las del medio MS 2, notandose asi que el medio MS diluido a la mitad en esas sales (tabla 2), presento mejores resultados, puesto que los requerimientos de minerales no son tan altos, provocando un mayor potencial hidrico que favorece su desarrollo vegetativo (Pedroza y Caballero, 2009). El exito en el desarrollo y crecimiento de los propagulos, tambien se atribuye a que los medios de cultivo (tanto el MS 1 como el MS 2) fueron solidificados con Phytagel[R] y no con agar como suele hacerse en la mayoria de cultivos in vitro; debido posiblemente a que esta sustancia gelificante por su composicion permite mejor crecimiento para el tejido cultivado, tiene una menor cantidad de impurezas, sumado igualmente a que permite ver mas facilmente las plantas y su proceso de crecimiento y la presencia de contaminantes (Pedroza y Caballero, 2009; Kacar et al., 2010).

En este estudio igualmente se observo, que la sacarosa en una concentracion de 20 g/l en el medio MS 1, comparada con 30 g/l del medio MS 2, posiblemente permita la germinacion del embrion, al igual que el alargamiento del tallo y las raices. Borges et al. (2005), senalaron que la mayor efectividad de la sacarosa en la multiplicacion in vitro, puede atribuirse a que causa cambios en las fitohormonas endogenas, lo que conduce a la formacion y el crecimiento de vastagos normales, quizas a traves del ajuste osmotico del citosol de los tejidos o de la disponibilidad de ciertas enzimas asociadas con la utilizacion de la fuente de carbono. En estudios realizados por Minano et al. (2004), se reporta que la produccion de antocianinas aumenta a medida que se incrementa la concentracion de sacarosa, lo cual es de suma importancia para tenerlo en cuenta en estudios futuros para la obtencion de metabolitos secundarios.

Segun Azofeifa (2009), el antioxidante polivinilpirrolidona (PVP) ha sido utilizado en la prevencion del oscurecimiento de tejidos (oxidacion), ya sea aplicado como enjuague al explante o mediante su incorporacion al medio de cultivo. En este estudio se establecio que una cantidad de 100 mg/l de PVP, es suficiente para evitar la presencia de fenoles, taninos y otros componentes endogenos presentes en la semilla de la uva en el medio de cultivo. Este es el primer reporte conocido acerca de la utilizacion de PVP para el control de la oxidacion en semillas de uva, aunque Gupta et al. (1980) mencionan que el PVP se puede disolver en una solucion de sacarosa a una concentracion de 20 g/l, con el proposito de mejorar su accion antioxidante tal y como se observo en este trabajo.

Aunque se observo el crecimiento y la obtencion de plantula a partir del embrion utilizando el medio MS modificado sin reguladores de crecimiento, es posible que estos esten de manera endogena dentro de la uva. Sin embargo, es recomendable continuar los estudios para determinar de manera mas exacta, si estos son requerimientos esenciales para el desarrollo y obtencion de vitroplantas de Vitis vinifera L.

Conclusiones

Se establecio que para la desinfeccion de la semilla de Vitis vinifera L. el mejor tratamiento es lavar la semilla con 5 g/l de NaDCC x 15 min + Benomyl[R] x 15 min y cuatro enjuagues con agua destilada esteril.

La obtencion de plantulas se logro mediante el rescate de embriones, pero no a partir de semillas.

A partir de los embriones rescatados se obtuvo a los 30 dias el 40% de plantulas con una longitud promedio del tallo de 4.5 cm, en el medio MS modificado con sus sales a la mitad de su concentracion.

La sacarosa en concentracion de 20 g/l favorece la germinacion del embrion, la elongacion del tallo y la produccion de raices.

Se observo crecimiento del embrion en el medio MS modificado sin la adicion de reguladores de crecimiento.

La polivinilpirrolidona (PVP) en una concentracion de 100 mg/l, es efectiva para el control de la oxidacion de la semilla de Vitis vinifera L.

Recibido: diciembre 18 de 2012 Aprobado: noviembre 20 de 2013

Agradecimientos

Los autores expresan sus agradecimientos a las directivas de la Facultad de Ciencias Agrarias del Politecnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid, especialmente al programa Tecnica en Biotecnologia Agraria.

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Cesar Augusto Hernandez Rendon, MSc en Biotecnologia, Politecnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid, Carrera 58 No 27B-125, cesaraugu@une.net.co.

Yesica Salazar Marin, Tecnica en Biotecnologia Agraria, Politecnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid, Carrera 58 No 27B- 125, yequisa182@hotmail.com.

Luis Fernando Restrepo Betancur, Especialista en Estadistica y Biomatematicas. Docente Universidad de Antioquia. Carrera 75 No 65- 87, frbstatistical@yahoo.com.es.
Tabla 1. Ensayos realizados para la desinfeccion de la semilla de uva.

No.           No. Tratamientos           Dosis              No.
Experimento                                               Semillas
                                                         utilizadas

Experimento   5 (10 frascos x    Hipoclorito de sodio       200
No 1            tratamiento)      al 2.5 % x 2 min +
                                   Etanol al 70 % x
                                 1 min + Tween20[R] +
                                 2 g/l de Benomyl[R] x
                                    5 min, 10 min,
                                   15 min, 20 min y
                                        25 min

Experimento   5 (10 frascos x      5 g/l de NaDCC x         200
No 2            tratamiento)        5 min, 10 min,
                                    15 min, 20 min
                                       y 25 min

Experimento   5 (10 frascos x      5 g/l de NaDCC x         200
No 3            tratamiento)        5 min, 10 min,
                                    15 min, 20 min,
                                   25 min + 2 g/l de
                                  Benomyl[R] x 5 min,
                                    10 min, 15 min,
                                    20 min y 25min

Tabla 2. Descripcion de los medios de cultivo utilizados para el
desarrollo del embrion.

            Medio MS 1                          Medio MS 2

N[H.sub.4] N[O.sub.3], KN[O.sub.3],          Sales completas
     Ca[Cl.sub.2]. 2[H.sub.2]O,          del medio MS (Murashige
     MgS[O.sub.4]. 7[H.sub.2]O,               y Skoog, 1962)
        [H.sub.3]B[O.sub.3],
      MnS[O.sub.4].[H.sub.2]O,
   Zn[So.sub.4]. 7[H.sub.2O], KI
   a la mitad de su concentracion
K[H.sub.3]P[O.sub.4] a la mitad de    K[H.sub.3]P[O.sub.4] completo
          su concentracion                   a su concentracion
   FeS[O.sub.4] x 7[H.sub.2]O,         FeS[O.sub.4] x7[H.sub.2]O,
      [Na.sub.2]EDTA completos           [Na.sub.2]EDTA completos
         a su concentracion                  a su concentracion
Mioinositol y vitaminas completas        Mioinositol y vitaminas
         a su concentracion                   completas a su
                                               concentracion
Sacarosa 20 g/l                                   30 g/l

                           Phytagel[R] 2.7 g/l
                                 pH 5.6
PVP 100 mg/L                          PVP 200 mg/L

Tabla 3. Resultados de desinfeccion de la semilla con
los tratamientos del experimento 3. Letras distintas
muestran diferencias estadisticas.

Tratamiento No.               No.           No.
                            semillas      semillas         % de
                            evaluadas   contaminadas   contaminacion

No 1. 5 g/L de NaDCC x         40           5.6             14b
5 min + Benomyl[R] x
5 min

No 2. 5 g/L de NaDCC x         40           6.4             16b
10 min + Benomyl[R] x
10 min

No 3. 5 g/L de NaDCC x         40           3.2             8a
15 min + Benomyl[R] x
15 min

No 4. 5 g/L de NaDCC x         40           7.2             18b
20 min + Benomyl[R] x
20 min

No 5. 5 g/L de NaDCC x 25      40            8              20b
min + Benomyl[R] x 25 min

Tabla 4. Analisis de varianza para la variable desinfeccion
en los experimentos 1, 2 y 3.

                  Fuente de    Grados de    Suma de
                  variacion    libertad    cuadrados

Experimento 1    Tratamiento       4          2.6
                    Error         45         109.4
                    Total         49         112.0

Experimento 2    Tratamiento       4          2.6
                    Error         45         109.3
                    Total         49         112.0

Experimento 3    Tratamiento       4         956.7
                    Error         45         179.2
                    Total         49        1135.9

                  Fuente de    Cuadrado       F         P
                  variacion     medio     calculado

Experimento 1    Tratamiento     0.65       0.27       0.89
                    Error        2.43
                    Total

Experimento 2    Tratamiento     0.64       0.26       0.88
                    Error        2.44
                    Total

Experimento 3    Tratamiento    239.1       61.3      0.0001
                    Error        3.9
                    Total

Tabla 5. Porcentaje de plantulas obtenidas y longitud promedio del
tallo a los 15 y 30 dias despues de sembrado el embrion con
diferentes concentraciones de sacarosa. Letras distintas muestran
diferencias estadisticas.

Tratamientos                % de plantulas     Longitud promedio
                               obtenidas        del tallo (cm)

                         15 dias    30 dias   15 dias   30 dias

Medio MS 1 con 20 g/l      24a        40a      1.4a      4.5a
  de sacarosa
Medio MS 2 con 30 g/l      10b        21b      0.8b      2.1b
  de sacarosa

Tabla 6. Analisis multivariado de la varianza para obtencion
de plantula a partir del rescate de embriones con los medios
MS1 y MS 2.

Estadistica                 Valor    Valor P

Wilks' Lambda               0.0046   <0.001

Pillai's Trace              0.9912   <0.001

Hotelling-Lawley Trace      215.62   <0.001

Roy's Greatest Root         215.62   <0.001
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Title Annotation:ARTICULO CORTO
Author:Hernandez Rendon, Cesar Augusto; Salazar Marin, Yesica; Restrepo Betancur, Luis Fernando
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Dec 1, 2013
Words:5316
Previous Article:Comparacion de dos metodos de extraccion de ADN a partir de plantas del genero Solanum, subgenero Leptostemonum.
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