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Rendimiento y capacidad antioxidante de extractos de Rosmarinus officinalis, Salvia officinalis y Psidium guajava obtenidos con C[O.sub.2] supercritico.

RESUMEN

Se obtuvieron extractos de hojas y tallos de salvia (Salvia officinalis, Fam. Labiatae) y romero (Rosmarinus officinalis, Faro. Labiatae) y de hojas de guayaba (Psidium guajava Faro. Myrtaceae), empleando C[O.sub.2] en estado supercritico. Se obtuvieron modelos polinomicos para relacionar el rendimiento de extractos con las condiciones de su obtencion. La composicion de la fraccion volatil de los extractos se determino por medio de GC-MS. Se midieron la capacidad antioxidante (ORAC) de los extractos y el grado de proteccion que ofrecen al agregarse a una base cosmetica sometida a oxidacion lipidica por accion de la radiacion UV. El extracto de romero mostro el mayor porcentaje de inhibicion de la oxidacion lipidica (88%), seguido por el de salvia (76%) y el de hojas de guayaba (43%). Los extractos de romero y salvia exhibieron una capacidad antioxidante alta (1,9 [micron]mol Trolox[R]/mg), similar a la del BHT y la vitamina E (2,8 y 3,0 [micron]mol Trolox[R]/mg), mayor que la del extracto de hojas de guayaba (0,7 [micron]mol Trolox[R]/mg).

Palabras clave: Salvia officinalis; Rosmarinus officinalis; Psidium guajava; fluido supercritico; antioxidante; ORAC; peroxidacion lipidica; hexanal.

ABSTRACT

Extracts from stems and leaves of sage (Salvia officinalis, Labiatae Fam.) and rosemary (Rosmarinus officinalis, Labiatae Fam.) and from guava leaves (Psidium guajava, Myrtaceae Fam.), were obtained using supercritical C[O.sub.2]. Polynomic models were formulated to relate yield with extraction conditions. The compositions of the volatile fractions of these extracts were determined using GC-MS. Their antioxidant capacity (ORAC) and the protection resultant from their addition to a cosmetic base subjected to lipid peroxidation as a result of its exposure to UV radiation were also measured. The extract from rosemary imparted the highest lipid peroxidation inhibition (88%), followed by those obtained from sage (76%) and guava leaves (43%). Rosemary and sage extracts exhibited a high antioxidant capacity (1,9 [micro]mol Trolox[R]/mg), similar to those of BHT and vitamin E (2,8 and 3,0 [micro]mol Trolox[R]/mg), respectively, and higher than that of the guava leaves extract (0,7 [micro]mol Trolox[R]/mg).

Key words: Salvia officinalis; Rosmarinus officinalis; Psidium guajava; supercritical; antioxidant; ORAC; lipid peroxidation; hexanal

1. Introduccion

La busqueda de productos de origen natural que permitan sustituir compuestos sinteticos, que actualmente se usan en las industrias alimenticia, de cosmeticos, farmacologica y muchas otras, ha adquirido gran importancia. Esto se debe a los posibles efectos adversos y toxicidad reportada de los compuestos sinteticos. El butilhidroxianisol (BHA) y el butilhidroxitolueno (BHT) se han usado ampliamente como agentes antioxidantes, para conservar productos alimenticios (JECFA, 1996). El BHT ha extendido su uso en productos farmaceuticos, vitaminas liposolubles y cosmeticos, puesto que les aumenta su estabilidad y tiempo de vida util (FDA, 1981). La Agencia Internacional para la Investigacion del Cancer (IARC) evaluo el modo de accion del BHA, y encontro evidencia suficiente de accion carcinogenica de este compuesto en animales (IARC, 1986).

Las plantas romero (Rosmarinus officinalis, Fam. Labiatae), salvia (Salvia officinalis, Faro. Labiatae) y guayaba (Psidium guajava, Fam. Myrtaceae) se presentan como una fuente alternativa de compuestos que pueden ser sucedaneos de los antioxidantes de origen sintetico. El romero y la salvia, poseen metabolitos secundarios con efectos medicinales reportados (Aim et al., 2005). La actividad antioxidante que se les atribuye, se debe principalmente a la presencia de los acidos carnosico y rosmarinico (Ibanez et al., 2003; Bisio et al., 1997). Sin embargo, esta actividad biologica depende tambien de la presencia de compuestos activos, que incluyen terpenoides, flavonoides y acidos fenolicos (Masaki et al., 1995). La guayaba, especie originaria de America tropical, ha sido objeto de varias investigaciones sobre actividad biologica, que han mostrado que tanto la fruta como la hoja son fuentes de flavonoides, polifenoles y otras sustancias bioactivas (Perez et al., 2008). Adicionalmente, en las hojas de guayaba se han encontrado acidos fenolicos tales como

el ferulico, a los cuales se les atribuye su mayor capacidad antioxidante, en comparacion con los compuestos presentes en la fruta (Chen et al., 2007).

Existen diferentes formas de extraer los compuestos bioactivos de las plantas. Para seleccionar alguna tecnica es necesario tener en cuenta que los compuestos pueden degradarse con la temperatura u oxidarse en presencia de oxigeno y luz. La extraccion con fluidos supercriticos es una tecnica importante que aprovecha las caracteristicas de densidad y viscosidad de las sustancias en estados mas alla de su punto critico. El C[O.sub.2] es uno de los solventes mas usados debido a que el extracto resultante se colecta libre de residuos de solvente, no tiene restricciones medioambientales, ni problemas de regulacion en la salud publica (Meireles et al., 2005). El C[O.sub.2] en estado supercritico puede ser utilizado en productos nutraceuticos, funcionales y alimenticios, lo que actualmente es un tema de creciente interes (Sebastian et al., 1998; Martinez, 2008).

El objetivo de este trabajo fue encontrar modelos matematicos para la prediccion del rendimiento de la extraccion de salvia, romero y guayaba (hojas) con C[O.sub.2] en estado supercritico. Para cada uno de los 3 extractos se determinaron la composicion de su fraccion volatil, la actividad antioxidante segun el metodo ORAC, y su comportamiento como inhibidor de la peroxidacion de una base cosmetica.

2. Materiales y metodos

2.1. Extraccion con C[O.sub.2] supercritico

Las hojas y tallos de romero y salvia, con un contenido de humedad entre 20 y 30%, fueron suministradas por la Asociacion Municipal de Usuarios Campesinos el Retiro Veredas Aledanas Sucre Santander (ACRESS) en enero de 2011. La empresa Fharmavicola S.A. proporciono las hojas de guayaba en condiciones de humedad similares. Antes de la extraccion con C[O.sub.2] se realizo un pretratamiento de reduccion de tamano de particula y de secado. La reduccion de tamano se efectuo en un picador/triturador forrajero TRF 300 (Metalurgica TRAPP Ltda. Jaragua do sul, Brasil) acondicionado con un tamiz de 0,8 mm. Posteriormente, el material vegetal picado de cada especie se introdujo por lotes de 0,6 kg en un homo electrico de bandejas (INDUMEGAS, Bucaramanga, Colombia) durante 18 horas, para lograr un contenido de humedad menor de 10%. Todas las extracciones con C[O.sub.2] supercritico se realizaron en un equipo Thar modelo SFE-2000-2-FMC50 (Thar Instruments, Inc, Pittsburg, PA, EE.UU.). Su camara de extraccion tiene un volumen de 1,78 x [10.sup.-3] [m.sup.3]. El extractor esta disenado para condiciones maximas de presion, flujo de C[O.sub.2] y temperatura, de 60 MPa, 12 kg/h y 120[grados]C, respectivamente. El material vegetal se cargo al extractor con una densidad aparente de 370 kg/[m.sup.3], lo que ocupo cerca del 83% de la camara de extraccion. Estos valores son similares a los utilizados por A. Meireles y colaboradores en los estudios cineticos de la extraccion con C[O.sub.2] supercritico de romero (Meireles et al., 2005). La temperatura de extraccion se mantuvo constante en 50[grados]C, teniendo en cuenta los datos de densidad del C[O.sub.2] para presiones que se encuentran por encima de 30 MPa, con un valor maximo de 920 [+ or -] 39 kg/[m.sup.3] a esta temperatura (Shi et al., 2009). Los niveles para la presion se seleccionaron con base en estudios sobre la solubilidad del acido carnosico (compuesto presente en las tres especies) en C[O.sub.2], los cuales indicaron que solo se observa un aumento significativo de esta propiedad cuando se opera a presiones superiores a 30 MPa (Riznar et al., 2008).

2.2. Diseno experimental

La presion (P, 30; 40; 50 MPa), el tiempo de extraccion (t, 0,5; 1,25; 2 h) y el flujo de C[O.sub.2] (F, 1,5; 2,25; 3 kg/h), se variaron sistematicamente segun un diseno experimental central compuesto, para evaluar sus efectos sobre el rendimiento de extraccion de las tres especies vegetales. Los valores entre parentesis corresponden a los niveles bajo (-1), medio (0) y alto (1) tomados por las variables. El diseno incluyo 8 experimentos en puntos factoriales, 6 en puntos axiales y 3 en puntos centrales (Tabla 1). Los tres experimentos del punto central (0,0,0) se utilizaron para evaluar el error experimental.

Los rendimientos de extraccion observados para las 3 especies se muestran en la Tabla 1. Se utilizo una ecuacion polinomica de segundo orden para modelar el rendimiento como una funcion de variables independientes, con base en el analisis de varianza. Se construyeron modelos en los que se conservaron unicamente los coeficientes que presentaran influencia estadisticamente significativa. Los modelos fueron refinados con el metodo de validacion cruzada (dejando fuera un caso a la vez) aplicado a los 17 resultados experimentales.

2.3. Analisis cromatografico: GC-MS y HPLC.

Los extractos se disolvieron en metanol, se les adiciono n-tetradecano como estandar interno y se analizaron en un cromatografo de gases GC Agilent Technologies 6890N Plus (AT, Palo Alto, California, EE.UU.), acoplado a un detector selectivo de masas AT MSD 5973, con un puerto de inyeccion split/splitless (relacion split 1:30) e inyector automatico AT 7863. Se uso una columna capilar de silice fundida, DB-5MS de 60 m x 0,25 mm, D.I., recubierta con una fase estacionaria de 5%-fenil-poli(metilsiloxano) de 0,25 [micron]m de grosor (dl). La temperatura del horno se programo de 45[grados]C (5 min) hasta 150[grados]C (2 min) a 4[grados]C [min.sup.-1,] luego, hasta 250[grados]C (5 min) a 5[grados]C [min.sup.-1] y, finalmente, hasta 275[grados]C a 10[grados]/min, temperatura a la cual permanecio constante durante 15 min.

Para su analisis por cromatografia liquida, los extractos se disolvieron en metanol: acido acetico (0,5%) (1:1). Se utilizo un cromatografo liquido AT 1200 con un detector UV-Vis de arreglo de diodos, DAD G1315B y columna KINETICS 2.6u C18 (100 mm x 4,6 mm). La temperatura de la columna se mantuvo en 35[grados]C y el volumen de muestra inyectada fue de 20 [micron]L. Las fases moviles A y B fueron acido acetico (0.3%) y acetonitrilo, respectivamente. Las condiciones cromatograficas fueron: 0-13 min, 4.5% B; 14-17 min, 15% B; 20-28 min, 22% B, 30-33 min, 100% B; 34-45 min, 4.5% B. Se utilizo un flujo de fase movil de 1,0 mL/min.

2.4. Preparacion de las muestras para la evaluacion de su capacidad antioxidante

Cada uno de los extractos de romero, salvia y hojas de guayaba, se diluyo en metanol, seguido de agitacion mecanica (vortice, 30 s) y por ultrasonidos (30 min) y centrifugacion (3500 rpm, 15 min). Se tomo el liquido sobrenadante y se filtro sobre vidrio poroso (0,22 [micron]m).

2.5. Analisis de la capacidad antirradicalaria

La determinacion de la capacidad antirradicalaria de los extractos se realizo mediante el ensayo ORAC descrito por Ou y colaboradores (On et al. 2001). Este se llevo a cabo en un espectrofotometro Modulus[TM] II, microplate reader, 645 N de Turner Biosystems, (North Mary Avenue, Sunnyvale, CA, EE.UU.) en un rango de longitud de onda de 490-570 nm; las mediciones se realizaron en microplacas de 96 pozos.

2.6. Determinacion de la capacidad antioxidante in-vitro

La microextraccion en fase solida (SPME) con derivacion simultanea sobre la fibra (Stashenko et al., 2000, 2002) se utilizo para medir la inhibicion ejercida por los extractos, sobre la peroxidacion lipidica de una base cosmetica O/W, inducida por radiacion UV-A. Mezclas homogeneas de las sustancias de analisis (0,5% en peso) y la base cosmetica O/W (Laboratorios MyN Bogota, Colombia) fueron expuestas durante 12 h a radiacion ultravioleta, en un fotorreactor, con el fin de inducir la peroxidacion lipidica de la crema cosmetica. El avance de la peroxidacion se superviso a traves de la cuantificacion del hexanal liberado, ya que este es un producto secundario final de la oxidacion de acidos grasos insaturados, principalmente, el acido linoleico.

La fibra (PDMS/DVB) de SPME se saturo previamente por exposicion a la fase vapor de una solucion acuosa de pentafluorofenilhidracina (PFPH); la fibra asi preparada, se expuso al espacio de cabeza de la mezcla (base cosmetica con extracto SFE), para capturar y derivatizar aldehidos resultantes de su peroxidacion, inducida por radiacion UV. Las hidrazonas formadas por la reaccion entre PFPH y los compuestos carbonilicos presentes en la fase vapor (Stashenko et al., 2002), fueron desorbidas termicamente por insercion directa de la fibra en el puerto de inyeccion de un cromatografo de gases HP-5890 Series II acoplado a un detector de captura de electrones (ECD, [sup.63]Ni).

3. Resultados y discusion

3.1. Efecto de los parametros de extraccion.

El analisis de la varianza de las mediciones de los experimentos de extraccion SFE de romero (tallos y hojas), salvia (tallos y hojas) y guayaba (hojas) mostro que en todos los casos, la presion, el flujo de C[O.sub.2] y el tiempo de extraccion, afectaron significativamente el rendimiento de la extraccion. Por medio de la regresion lineal multiple se hallaron los coeficientes de modelos polinomicos de 2[grados] orden para relacionar el rendimiento de extraccion con estas 3 variables. En procesos de validacion cruzada con exclusion de un termino a la vez, se utilizaron el error cuadrado medio de la prediccion del rendimiento y el coeficiente de determinacion ajustado ([R.sup.2.sub.aj]) como criterios de refinamiento de los modelos. La

[FIGURA 1 OMITIR]

Figura 1 presenta los graficos de comparacion de los valores de rendimiento de extraccion (Y), experimental y predicho, para las 3 especies estudiadas, con los modelos refinados (Ecuaciones 1-3).

[Y.sub.Romero] =1,189 + 0,245F + 0,190P + 0.322t + 0,075Ft - 0,146[P.sup.2] + 0,106[t.sup.2] (1)

[Y.sub.Salvia] = 1,538 + 0,225F + 0,218P + 0,421t + 0,168Ft - 0,243[F.sup.2] (2)

[Y.sub.Guayaba] = 0,801 + 0,168F + 0,004P + 0,225t - 0,01Ft - 0,064FP - 0,055[F.sup.2] (3)

Los valores utilizados para las variables F, P y t en estos modelos fueron los resultantes del escalamiento segun los niveles bajo (-1) y alto (1) empleados en los experimentos (Tabla 1). En las etapas de la validacion cruzada (17 experimentos), el error de ajuste del modelo (ecuacion 4) se calculo como la diferencia entre el error experimental total (con base en la varianza de las m replicas [X.sub.i]) y la suma de los errores en la prediccion ([[??].sub.i]) del experimento excluido. En la Tabla 2 aparecen los valores del error cuadrado medio (RMSE), el error de ajuste registrado en la validacion cruzada (ecuacion 4) y el coeficiente de determinacion de los modelos 1-3. El modelo con mejor ajuste fue el obtenido para la prediccion del rendimiento de extraccion de hojas de guayaba.

Error de ajuste =[raiz cuadrada de [sigma]([Y.sub.i] - [[??].sub.i]).sup.2] - (1/m][sigma][([X.sub.i] - [[bar.X].sub.i]).sup.2] * n] (4)

Para los 3 modelos, el rendimiento de extraccion fue directamente proporcional a las 3 variables estudiadas, aunque su crecimiento no fue monotono, debido a la presencia de terminos cuadraticos y de interaccion binaria. Las Figuras 2-4 contienen graficos de contorno para estos 3 modelos, en los que se predicen los valores mas altos de rendimiento de extraccion para condiciones experimentales externas a la region explorada con el diseno central compuesto. Algunas condiciones de presion y flujo correspondientes a las regiones de mayor rendimiento de extraccion predicho no son accesibles experimentalmente (P > 100 MPa, F > 10 kg/h).

Los mayores rendimientos de extraccion experimentales se registraron cuando se utilizaron los niveles altos de F, P y t en la extraccion de romero o salvia. En el caso de la extraccion de hojas de guayaba, este valor se obtuvo con los niveles altos de F y t y el nivel bajo de E Segun la extrapolacion hecha en los graficos de contorno (Figuras 2-4), para obtener los rendimientos optimos, se requeririan tiempos de extraccion 4, 5 y 6 veces mas largos que el nivel superior empleado en los experimentos de extraccion de romero, salvia y guayaba, respectivamente. Esta dependencia del rendimiento de extraccion coincide en general con la encontrada en varios modelos para la extraccion SFE de semillas de cilantro (Magoulas et al., 2000). Con base en estos graficos de contorno, para lograr rendimientos de extraccion altos (> 1%) se puede formular la recomendacion de usar niveles altos de F, P y t en las extracciones de romero y salvia y niveles altos de F y T y un nivel bajo de P, en la extraccion de hojas de guayaba.

[FIGURA 2 OMITIR]

[FIGURA 3 OMITIR]

[FIGURA 4 OMITIR]

3.2 Composicion de los extractos, actividad antioxidante e inhibicion de la lipoxidacion.

Por disolucion o arrastre por el C[O.sub.2] en estado supercritico, sustancias de baia masa molecular (mono- y sesquiterpenos), asi como otros compuestos mas pesados (triterpenos, polifenoles), son retirados del material vegetal y conforman la mezcla llamada extracto SFE. Para determinar su composicion se recurre a la cromatografia de gases (para los componentes volatiles y semivolatiles) y a la cromatografia liquida (para las sustancias con baja presion de vapor, poco volatiles). En este trabajo, se utilizo la microextraccion en fase solida para tomar la muestra de las sustancias volatiles del extracto SFE (fraccion volatil), a analizar por cromatografia de gases. La composicion de la fraccion volatil de los extractos SFE aislada por medio de la microextraccion en fase solida, se describe en las Tablas 3-5, en las que se incluyen los indices de retencion experimental y reportado en la literatura cientifica (Adams, 2004) para cada compuesto. El extracto de romero se caracterizo por contener mayoritariamente alcanfor (13,4 %) y 1,8-cineol (10,1%), lo cual coincide con lo determinado en otras investigaciones (Carvalho et al., 2005). De igual forma, se encuentran presentes ciertos terpenos que han sido identificados en el aceite esencial de romero. Verbenona (5,3 %), [alfa]-pineno (2,5 %), canfeno (2,8 %) y borneol (0,7 %) resultaron ser caracteristicos de la fraccion volatil del extracto; tal como lo describieron Reverchon y colaboradores, quienes reportaron que los compuestos presentes en el extracto SFE, resultan ser los mismos presentes en el aceite esencial, pero con diferentes cantidades relativas (Reverchon et al., 1992).

Existe una amplia variacion en la composicion de los aceites esenciales y extractos de S. officinalis de diferentes origenes. Sin embargo, en la mayoria de los casos se observan 4 compuestos mayoritarios (alcanfor, 1,8-cineol, a- y b-tuyonas), cuyas proporciones relativas dan lugar a 5 tipos de aceite esencial de salvia (Mockute et al., 2003). En esta investigacion tambien se hallaron estos 4 compuestos mayoritarios en la fraccion volatil del extracto SFE de salvia. El diterpeno manool (25%) fue el componente mayoritario de esta fraccion volatil, cuya composicion fue similar a la reportada por Glisik et al. (2010) para extractos de salvia cultivada en Serbia.

En el extracto de hojas de guayaba se encontro mayoritariamente el trans-[beta]-cariofileno (12.8 %), seguido de [alfa]- y [beta]-selinenos (7.0 % y 6.9 %). Hasta la fecha, solamente se encuentran en la literatura cientifica 2 reportes sobre composicion de extractos SFE de hojas de guayaba. En esos casos no se realizo el muestreo de la fase vapor con SPME, sino que se inyecto la solucion de extracto directamente en el cromatografo de gases. Las composiciones reportadas son similares a la encontrada en el presente trabajo, aunque hay varias diferencias cualitativas. En el primer caso, los 2 componentes mas abundantes fueron b- y a-selinenos (21,3 y 19,3%, respectivamente), seguidos del globulol (18,5%) y del b-cariofileno (15%) (Moura et al., 2011). En el segundo caso, los 3 componentes mas abundantes fueron a-selineno (23,7%), b-cariofileno (18,8%) y d-selineno (18,3%) (Sagrero-Nieves et al., 1994). Distinto a lo hallado en el caso del romero, las composiciones reportadas para los aceites esenciales obtenidos de hojas de guayaba difirieron notoriamente de las de los extractos SFE. En el aceite extraido de material vegetal de Nigeria, el limoneno (42,1%) y el b-cariofileno (21,3%) fueron los componentes mas abundantes (Ogunwande et al., 2003). En el aceite de hojas de guayaba recolectadas en la Polinesia Francesa, el componente mayoritario fue el b-cariofileno (18,3%) y los sesquiterpenos oxigenados mas abundantes fueron selin-11-en-4a-ol (6,9%), a-cadinol (3,6%) y (E)-nerolidol (3,2%) (Adam et al., 2011). Para mostrar la amplitud de las diferentes composiciones encontradas alrededor del mundo, se resalta el caso del aceite obtenido de P. guajava cultivada en Brasil, cuyos componentes mayoritarios fueron a-pineno (23,9%), 1,8-cineol (21,4%) y b-bisabolol (9,2%) (da Silva et al., 2003). Mediante cromatografia liquida se detecto la presencia del acido carnosico en todos los extractos de las tres especies vegetales. Este diterpeno fenolico, que es el mas abundante en los extractos de romero (Cavero et al., 2005) y que ha sido relacionado directamente con la actividad antioxidante del romero y de la salvia (Cuvelier et al., 1996; Wellwood, 2004), se encontro en mayor proporcion en el extracto de romero (22,3 mg de acido carnosico/g de extracto); seguido del extracto de salvia (2,8 mg de acido carnosico/g de extracto) y el de hojas de guayaba (1,1 mg de acido carnosico/g de extracto). Tanto en el analisis cromatografico del compuesto patron como en el de los extractos, se observo la presencia de picos diferentes al correspondiente al acido carnosico, lo que permite suponer la posible degradacion del compuesto, a productos como el carnosol (Moura et al., 2005), especialmente, al estar disuelto en metanol (Schwarz et al., 1992).

Se ha establecido que los aldehidos de baja masa molecular son productos finales de la peroxidacion de los lipidos (Halliwell et al., 1993). Su volatilidad facilita el seguimiento de procesos de peroxidacion, por medio del analisis de la fase vapor sobre la muestra, lo cual es aun mas sencillo con el uso de la SPME como tecnica de muestreo. Varios investigadores han desarrollado metodos analiticos para seguir la peroxidacion lipidica con base en la cuantificacion de los aldehidos liberados en el proceso (Frankel et al., 1989; Luo et al., 1995) y en este trabajo se utilizo el muestreo por SPME con derivacion simultanea de los aldehidos (Stashenko et al., 2002). Se evaluo la disminucion del area del hexanal derivado in-situ sobre la fibra, como parametro indicador del erecto protector de la lipoxidacion por parte de los extractos. La Figura 5 muestra el decrecimiento del area del hexanal detectado en la fase vapor sobre la base cosmetica luego de adicionar los extractos de romero, salvia o guayaba, y someterla a condiciones de peroxidacion. En la Tabla 6 se encuentra reportado el correspondiente erecto protector de los extractos y las sustancias antioxidantes de referencia. La proteccion impartida por los extractos vario entre 43 y 88%; los extractos de romero y salvia presentaron el grado de proteccion mas alto, logrando superar el 63% determinado para la vitamina E. Extractos acuosos de las hojas de guayaba han demostrado inhibir la oxidacion del acido linoleico en un 94-96% (Chen et al., 2007); de forma similar, se han reportado niveles de inhibicion de la peroxidacion del 87% para extractos de romero (Gawlik-Dzik et al., 2007), valor muy similar al que se hallo en esta investigacion.

[FIGURA 5 OMITIR]

La actividad antirradicalaria de los extractos de romero y salvia en los que se obtuvo el mayor rendimiento de extraccion, resultaron tener et mismo valor de 1.9 lamol Trolox[R]/mg extracto (Tabla 6), contrario a otros analisis en los cuales la actividad antioxidante del romero fue mas alta que la de salvia (Ivanovic et al., 2009); por otro lado, los valores para los antioxidantes sinteticos BHT y vitamina E, fueron un poco superiores a los valores de los extractos. El ensayo ORAC examina la capacidad de la sustancia bajo ensayo para aniquilar radicales, en medio acuoso. E1 ensayo de determinacion de hexanal se puede implementar tanto en medio acuoso como hidrofobico y evalua la capacidad para inhibir la peroxidacion lipidica con base en sus resultados, sin distinguir el mecanismo. Debido a que el uso buscado para los extractos de romero, salvia y guayaba es el de agentes antioxidantes para productos cosmeticos, este ensayo, por utilizar como sustrato una base cosmetica, se constituye en una prueba de desempeno real de estos extractos en la aplicacion deseada.

El mejor desempeno del extracto de romero en la inhibicion de la peroxidacion, muestra que ademas del acido carnosico, cuyo contenido es 10 veces mayor que el del extracto de salvia, existen otros componentes de caracter hidrofobico que contribuyen a bloquear la peroxidacion mas eficientemente que los que estan presentes en el extracto de salvia.

4. Conclusiones

El rendimiento de la extraccion con C[O.sub.2] supercritico de romero, salvia y hojas de guayaba depende de la presion, el flujo y el tiempo de extraccion. En los 3 casos se requieren flujos de C[O.sub.2] altos (>3 kg [h.sup.-l]) y tiempos de extraccion de varias horas para lograr rendimientos de extraccion altos (< 1%). Mientras que para romero y salvia el incremento de la presion aumento el rendimiento, en el caso de las hojas de guayaba, se obtuvieron mayores rendimientos al reducir la presion.

La fraccion volatil de los extractos de romero, salvia y hojas de guayaba, se caracterizo por compuestos como alcanfor, 1,8-cineol, manool y trans-[beta]-cariofileno, presentes en cantidades relativas menores del 25 %. El extracto de romero mostro los mejores resultados de actividad antioxidante, al inhibir el 88% de la peroxidacion lipidica de los acidos grasos presentes en una base cosmetica analizada; igualmente, este presento el mayor contenido de acido carnosico (22,3 [micron]g de acido carnosico/mg de extracto), lo que explica el alto porcentaje de inhibicion de la peroxidacion lipidica. Los extractos de salvia y hojas de guayaba con un 76 y 43% de inhibicion de la peroxidacion, pueden considerarse tambien como promisorios para reemplazar antioxidantes sinteticos comerciales en productos para el consumo humano.

Agradecimientos

Los autores agradecen la financiacion del proyecto a la Gobernacion de Santander (Convenio Neomundo-UIS 00001 2010), al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural (contrato 2008V3781-3740) y a Colciencias (CENIVAM, contrato RC 245-2011). Asi mismo, agradecen a ACRESS y Fharmavicola por la provision del material vegetal y a Laboratorios MyN Ltda. por el suministro de la base cosmetica.

Recibido: 28 de enero de 2012

Aceptado para publicacion: 5 de septiembre de 2012

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Edwin Alexander Rodriguez, Anderson Julian Arias, Eva Giselle Vasquez, Jairo Rene Martinez, Elena E. Stashenko *

* Centro de Cromatografia y Espectrometria de Masas, CROM-MASS, CIBIMOL, CENIVAM, Universidad Industrial de Santander. Carrera 27, Calle 9, Bucaramanga, Colombia. elena@tucan.uis.edu.co
Tabla 1. Datos experimentales para el rendimiento de
extraccion obtenidos del diseno central compuesto

                                                Rendimiento
Codigo del                               (100 x g extracto/g material
experimento   F, g/min   P,MPa   t, h          vegetal seco)

                                         Romero    Salvia    Guayaba

-1 -1 -1         25       30      0,5     0,497     0,615     0,279
1 -1 -1          50       30      0,5     0,950     1,108     0,792
-1 1 -1          25       50      0,5     0,863     0,964     0,443
1 1 -1           50       50      0,5     1,098     1,228     0,647
-1 -1 1          25       30      2,0     0,847     1,088     0,553
1 -1 1           50       30      2,0     1,545     1,862     1,168
-111             25       50      2,0     1,361     1,415     0,821
111              50       50      2,0     1,924     2,349     1,038
-100             25       40     1,25     0,871     1,264     0,615
0 -10           37,5      30     1,25     0,844     1,368     0,753
00-1            37,5      40      0,5     0,880     0,898     0,462
100              50       40     1,25     1,588     1,448     0,938
010             37,5      50     1,25     1,559     1,870     0,832
001             37,5      40      2,0     1,809     1,917     1,100
000             37,5      40     1,25     1,050     1,616     0,845
000             37,5      40     1,25     1,105     1,553     0,843
000             37,5      40     1,25     1,227     1,543     0,792

Tabla 2. Indicadores de desempeno de los modelos predicti-
vos del rendimiento de la extraccion SFE de romero, salvia
y guayaba.

Material vegetal   Error         Error
sometido a         cuadrado      de ajuste                [R.sup.2.
extraccion SFE     medio, RMSE   del modelo   [R.sup.2]   sub.adj]

Romero             0,0255        0,239        0,88        0,79
Salvia             0,0124        0,172        0,95        0,92
Guayaba            0,0027        0,088        0,96        0,93

Tabla 3. Compuestos presentes en la fraccion volatil del
extracto de romero obtenido mediante extraccion con C[O.sub.2]
supercritico a 50 MPa, 50 gC[O.sub.2]/min y 2 h.

                                          IR (a)            Cantidad
Compuesto                                                   relativa,
                                     Adams                      %
                                     2007    Experimental

[alfa]- Pineno                        932        936           2,5

Canfeno                               946        953           2,8

[alfa]-Felandreno                    1002        1009          0,6

[alfa]- Terpineno                    1014        1020          0,7

p- Cimeno                            1022        1027          0,7

1,8-Cineol                           1026        1036         10,1

Alcanfor                             1141        1156         13,4

Bomeol                               1165        1197          0,7

Verbenona                            1204        1215          5,3

Acetato de bornilo                   1287        1289          0,9

[beta]-Cariofileno                   1417        1432          6,1

[alpha]- Humuleno                    1452        1469          0,9

Oxido de cariofileno                 1582        1598          0,8

MS (b): [M.sup.+]; 342 (100), 271     --         2340          3,8
(50), 260(19), 272(12),
229(11), 217(11)

MS (b): [M.sup.+]; 129 (100),         --         2386          2,2
57(34), 57(34), 112
(29), 55(24), 147 (23),
70(23)

MS (b): [M.sup.+]; 340(100),          --         2419         10,2
325(65), 341(27),
282(20), 326(16),
283(13)

(a)-Indice de retencion.

(b)--Iones principales (m/z) en el espectro de masas (impacto de
electrones, 70 eV), en orden decreciente de sus intensidades (1, %).

Tabla 4. Compuestos presentes en la fraccion volatil del ex-
tracto de salvia obtenido mediante extraccion con [C.sub.2] su-
percritico a 50 MPa, 50 gC[O.sub.2]/min y 2 h.

                                     IR (a)

Compuesto                      Adams,                   Cantidad
                                2007    Experimental   relativa, %

[beta]-Pineno                   974         981            0,7

1,8-Cineol                      1026        1036           5,6

cis-Tuyona                      1111        1101           9,1

traps-Tuyona                    1112        1122           1,3

Alcanfor                        1146        1154           2,9

trans-[beta]-Cariofileno        1417        1432           1,8

[alpha]-Humuleno                1452        1469           4,9

Viridiflorol                    1608        1627           6,1

Epoxido de humuleno II          1608        1627           0,8

Manool                          2056        2077          25,0

MS (b): [M.sup.+];342(100),      --         2340           3,8
271(50), 260(21),
272(13), 229(17),
217(12)

MS (b): [M.sup.+]; 340(100),     --         2419           8,9
325(67), 341(26),
326(20), 282(19),
283(16)

MS (b): [M.sup.+]; 342(100),     --         2470          10,6
374(41), 327(42),
274(25), 286(23),
75(17), 243(13)

(a)--Indice de retencion.

(b)--Iones principales (m/z) en el espectro de masas (impacto de
electrones, 70 eV), en orden decreciente de sus intensidades (1, %).

Tabla 5. Compuestos presentes en la fase vapor del extracto
de hojas de guayaba obtenido mediante extraccion con C[O.sub.2]
supercritico a 50 MPa, 50 gC[O.sub.2]/min y 2 h.

                                        IR (a)            Cantidad
Compuesto                                                 relativa,
                                  Adams,   Experimental       %
                                   2007

Limoneno                           1034        1024          2,1

1,8-Cineol                         1026        1037          0,4

[alfa]-Copaeno                     1374        1385          6,5

[alfa]-Santaleno                   1416        1426          0,3

trans-[beta]-Cariofileno           1417        1433         12,8

trans-[alfa]-Bergamoteno           1432        1439          6,4

Aromadendreno + (Z)-[beta]-        1440        1453          1,0
fameseno

Dauca-5,8-dieno                    1471        1461          0,4

[alfa]-Humuleno                    1452        1469          1,4

9-epi-(E)-Cariofileno              1464        1474          0,7

[alfa]- Muuroleno                  1500        1484          1,0

Valenceno                          1496        1499          1,3

[alfa]-Selineno                    1498        1489          6,9

[beta]-Selineno                    1504        1509          7,0

Amorfeno                           1528        1511          1,0

[gamma]- Cadineno                  1513        1524          0,2

[delta]-Cadineno                   1522        1527          1,2

trans-Calameno                     1521        1532          2,7

trans-1,4-Cadinadieno              1533        1543          1,8

[alfa]-Calacoreno                  1544        1554          0,2

Oxido de cariofileno               1582        1598          1,6

Neointermedeol                     1676        1658          2,1

MS (b): 69(100), 95(65),            --         2439         10,5
55(61), [M.sup.+]; 424(46),
121(45), 107(43),
109(40)

MS (b): [M.sup.+](-); 249(100),     --         2501          3,2
292(100), 91(38),
193(25), 178(24)

MS (b): [M.sup.+](-); 270(100),     --         2506          5,7
292(90), 193(59),
166(57), 249(52), ,
269(42), 193(59)

MS (b): [M.sup.+];412(50),          --         2536         11,5
289(26), 229(52),
147(23), 124(100),
91(18), 55(31)

(a)--Indice de retencion.

(b)--Iones principales (m/z) en el espectro de masas (impacto de
electrones, 70 eV), en orden decreciente de sus intensidades (1, %).

Tabla 6. Efecto protector contra la peroxidacion lipidica y
actividad antirradicalaria observada para BHT, vitamina E y
los extractos de romero, salvia y guayaba.

                          Resultado ORAC
Muestra               [micron]mol Trolox[R]/mg       Grado de
                             extracto             proteccion, %

Extracto de romero       1,9 [+ o -] 0,10       88 [+ o -] 3,5

Extracto de salvia      1,90 [+ o -] 0,03       76 [+ o -] 1,7

Extracto de guayaba     0,70 [+ o -] 0,06      43,0 [+ o -] 0,6

BHT                      2,8 [+ o -] 0,15       93 [+ o -] 2,2

Vitamina E               3,0 [+ o -] 0,26       63 [+ o -] 4,5

(a) Mediciones hechas por duplicado. Promedio
[+ o -] desviacion estandar.
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Title Annotation:BIOQUIMICA
Author:Rodriguez, Edwin Alexander; Arias, Anderson Julian; Vasquez, Eva Giselle; Martinez, Jairo Rene; Stas
Publication:Revista de la Academia Colombiana de Ciencias Exactas, Fisicas y Naturales
Date:Sep 1, 2012
Words:7065
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