Printer Friendly

Relevancia de la apoptosis en la reproduccion femenina.

Relevance of apoptosis in the female reproductive system.

INTRODUCCION

La apoptosis, o muerte celular programada, es un proceso geneticamente controlado mediante el cual las celulas inducen su propia muerte. Este evento puede ser desencadenado tanto por estimulos extrinsecos como intrinsecos, es propio de los organismos multicelulares desde los parasitos hasta los seres humanos, y conduce a la eliminacion de celulas que se producen en exceso, que se han desarrollado en forma impropia o que acarrean algun dano genetico (1). De ahi que se considere a la muerte celular programada como un proceso fisiologico que contribuye a la construccion y al mantenimiento de los tejidos.

A lo largo de la vida de un organismo, la apoptosis participa desde el desarrollo hasta la senescencia. El delicado equilibrio entre proliferacion celular y apoptosis asegura un correcto control sobre la homeostasis de los tejidos. Sin embargo una falla en ese balance dada tanto por niveles de apoptosis aumentados como disminuidos puede disparar procesos patologicos tales como el cancer, sida o autoinmunidad (2).

En los ultimos anos, el proceso de apoptosis ha suscitado el interes de numerosos de investigadores y ha sido objeto de diversas investigaciones que se han visto reflejadas en un aumento exponencial del numero de publicaciones cientificas (3).

El sistema reproductor femenino representa un excelente modelo para el estudio de la remodelacion constante de los tejidos. Mensualmente y en forma ciclica, el ovario, el endometrio y la glandula mamaria atraviesan ciclos de proliferacion celular y apoptosis respondiendo a los cambios en la secrecion hormonal. Estos ciclos de crecimiento y muerte juegan un papel importante no solo en la fisiologia normal de los tejidos, si no tambien en la prevencion de la transformacion neoplasica e inicio del cancer.

En esta actualizacion se resumen los aspectos mas relevantes de las implicaciones de la apoptosis en la fisiopatologia del aparato reproductor femenino y en el desarrollo del embrion en sus primeras etapas.

APOPTOSIS: ASPECTOS MORFOLOGICOS, BIOQUIMICOS Y MOLECULARES

A la hora de deshacerse de celulas potencialmente riesgosas o simplemente que estan en exceso, los organismos multicelulares ponen en marcha la maquinaria de apoptosis. Esta consiste en un proceso activo y geneticamente controlado que culmina con la destruccion de la celula.

La apoptosis es un proceso altamente complejo que involucra una secuencia de senalizacion intracelular a traves de diversas proteinas y factores reguladores, algunos inhibidores y otros inductores de la muerte. En esta revision, se resumen los aspectos mas relevantes de este proceso, limitandose a nombrar solo las vias de regulacion mas destacadas con el consiguiente riesgo de simplificar lo complejo.

La ejecucion del programa de muerte se caracteriza por una secuencia de cambios morfologicos y bioquimicos, que incluye entre otros la contraccion celular, la translocacion de la fosfatidilserina a la cara externa de la membrana celular, la condensacion de la cromatina, la fragmentacion nuclear y la formacion de vesiculas rodeadas de membrana con organelas intactas, llamadas cuerpos apoptoticos (4).

Es importante destacar que, a diferencia de la necrosis, la membrana de las celulas apoptoticas permanece intacta hasta las ultimas etapas, sin liberar el contenido citoplasmatico y por consiguiente, sin generar inflamacion local (Tabla I).

Estos cambios se producen como consecuencia de la activacion de dos grandes y complejas vias de senalizacion intracelular: la via extrinseca, mediada por receptores de muerte y la via intrinseca o mitocondrial. Ambas convergen en unas proteinas efectoras caracteristicas llamadas caspasas y culminan en la destruccion programada de la celula (5). Luego, las celulas apoptoticas son rapidamente eliminadas por el sistema inmune sin mediar procesos inflamatorios.

Las caspasas forman una familia de proteasas homologas entre si y altamente conservadas en la evolucion. Son cisteina proteasas especificas de acido aspartico. Las caspasas se expresan como proenzimas sin actividad biologica y tienen que activarse para poder ejercer su accion. Estas procaspasas poseen la habilidad de autoactivarse o de ser activadas por otras caspasas como parte de una cascada de amplificacion. Participan tanto de la iniciacion como de la ejecucion del proceso de apoptosis. En las etapas finales de la apoptosis, la ruptura controlada del ADN es llevada a cabo por endonucleasas que se activan por via de las caspasas (6).

La via extrinseca o via de receptores involucra a la familia de receptores y ligandos del factor de necrosis tumoral (TNF) entre los cuales se encuentra Fas o CD95, que es el receptor de muerte mas estudiado y relevante. La union de Fas con su ligando FasL (o CD95L) es requerida para la transduccion de la senal apoptotica. Luego de este evento, una serie de proteinas intracelulares se asocia con el Fas activado para formar el complejo de senalizacion inductor de muerte (death-inducing signalling complex, DISC).

Primero, la molecula adaptadora FADD (Fas-associated death domain) se une a traves de su dominio de muerte al Fas y luego, este complejo recluta a la procaspasa-8. Esta union da lug ar a la proteolisis de la procaspasa-8 que es activada y liberada del DISC al citoplasma. La caspasa-8 activa inicia la denominada cascada de caspasas, al procesar a la procaspasa-3, lo que resulta en su activacion y otorga la senal a endonucleasas para la ejecucion de la muerte celular (7) (Fig. 1).

Por otro lado, la via intrinseca de senalizacion intracelular disparada por eventos tales como dano al ADN por toxicos o por radiacion, es tambien denominada via mitocondrial. La mitocondria es fundamental en el proceso de apoptosis ya que una gran variedad de eventos clave estan focalizados en esta organela. La mayoria de los mecanismos apoptoticos que tiene lugar en la mitocondria esta regulada por el equilibrio entre los miembros de la familia Bcl-2. Esta familia de proteinas y el citocromo-c son los componentes mas importantes involucrados en la via mitocondrial.

La familia de Bcl-2 consta de 19 miembros, algunos de los cuales poseen actividad anti-apoptotica como el Bcl-2 y Bcl-XL y otros tienen actividad pro-apoptotica, como el Bax, el Bcl-xL y el Bcl-xS. La activacion de proteinas pro-apoptoticas produce un poro en la membrana externa de las mitocondrias que permite la liberacion de numerosas proteinas del espacio intermembranal; entre ellas, el citocromo-c (8, 9).

En caso de concretarse la salida del citocromo-c, este se asocia con la molecula adaptadora Apaf-1 y con la procaspasa-9 para formar el apoptosoma. El apoptosoma hidroliza la procaspasa-3 que se convierte en caspasa-3 activa y se encarga de desencadenar las ultimas fases de la apoptosis (8, 9) (Fig. 1).

[FIGURA 1 OMITIR]

Asimismo, la via de los receptores de muerte y la via mitocondrial pueden converger en la activacion de la caspasa-3. El solapamiento y la integracion de las dos vias se dan a nivel de Bid, que es un miembro proapoptotico de la familia de Bcl-2. La caspasa-8 media la hidrolisis de Bid lo cual resulta en su translocacion a la mitocondria donde promueve la liberacion del citocromo-c, la formacion del apoptosoma y la activacion de la caspasa-3 (5, 10). De esta manera, dependiendo el estimulo y del tipo celular, la activacion de la apoptosis se puede producir ya sea por medio de la via intrinseca, por medio de la via extrinseca o a traves de ambos caminos moleculares (Fig. 1).

IMPORTANCIA DE LA APOPTOSIS DURANTE EL DESARROLLO EMBRIONARIO

La primera evidencia de una base genetica de la apoptosis se debio a estudios en el nematodo Caenorhabditis elegans (C. elegans). Durante la ontogenia de este gusano hermafrodita, 131 de las 1090 celulas somaticas mueren por apoptosis, dejando un adulto de 959 celulas. Un estudio genetico en mutantes defectuosos de muerte celular identifico genes especificos para la regulacion, ejecucion y resolucion de la apoptosis. Esta maquinaria basica de muerte celular esta altamente conservada a traves de la evolucion. Se han hallado proteinas homolog as a las de C. elegans en Drosophila y en mamiferos (11).

Si bien, el C. elegans es un excelente modelo y abrio caminos para muchos descubrimientos en el campo de la apoptosis, estudiar la muerte celular programada durante el desarrollo embrionario en organismos mas evolucionados, es experimentalmente complejo. A pesar de que se sabe que la apoptosis es un evento fundamental en las etapas tempranas del desarrollo de diversos organismos multicelulares, la complejidad de su estudio en un modelo experimental adecuado, lleva muchas veces a subestimar sus niveles.

Sin embargo, se puede suponer la importancia que posee este fenomeno dado que la inhibicion del proceso de apoptosis altera el desarrollo de tal forma, que en muchos casos, el animal no es viable.

Durante el desarrollo embrionario la apoptosis esta implicada en distintos procesos relacionados con la escultura de las estructuras. El ejemplo mas claro en vertebrados superiores es la eliminacion de las membranas interdigitales para la formacion de los dedos. Otro proceso de formacion de estructuras en que esta involucrada la apoptosis es en el vaciado de cuerpos solidos para crear una luz. Por ejemplo, en el embrion de raton, la formacion de la cavidad preamniotica es inducida por la muerte de celulas ectodermales de su interior (12).

Asimismo, durante el desarrollo, se relaciona el proceso de apoptosis con la eliminacion de estructuras innecesarias en algun estadio de la evolucion o para algun sexo en particular. En el desarrollo del sistema reproductor de los mamiferos, la apoptosis es responsable de la eliminacion de los ductos de Muller que forman el utero y los oviductos en machos de mamiferos y de los ductos de Wolff en hembras (13). Otro ejemplo clasico de induccion de apoptosis durante el desarrollo es la perdida de la cola durante la metamorfosis de los renacuajos en respuesta al incremento de una hormona tiroidea (12).

El control de las celulas defectuosas es tambien fundamental. Durante las etapas de desarrollo temprano, se eliminan por apoptosis celulas anormales, con localizacion erronea, no funcionales o potencialmente peligrosas.

IMPORTANCIA DE LA APOPTOSIS DURANTE EL DESARROLLO FOLICULAR

En los seres humanos, la reserva folicular se establece durante la vida fetal y luego el numero de foliculos va disminuyendo gradualmente (14). La apoptosis juega un papel fundamental en el desarrollo y en la funcionalidad del ovario.

Durante la etapa fetal temprana se forman en el ovario aproximadamente 7 x 106 ovocitos. Este numero se reduce drasticamente antes del nacimiento por la muerte por apoptosis despues de las 20 semanas de gestacion. Por lo menos dos tercios de los ovocitos de la reserva mueren por apoptosis en la etapa prenatal. Al nacer, solo quedan en el ovario de uno a dos millones de ovocitos, y durante la pubertad solo se dispone para la ovulacion de 300.000 de los siete millones de ovocitos originales y de estos, solo ovularan de 400 a 500. Por lo tanto a lo largo de la vida reproductiva femenina, entre los periodos de pubertad y menopausia, unos 250.000 foliculos estaran destinados a morir. Luego de la ovulacion, el foliculo dominante formara el cuerpo luteo, y la apoptosis tambien es responsable de su regresion o luteolisis (13, 15) (Fig. 2).

El desarrollo folicular es un proceso dinamico que prosigue desde la menarquia hasta la menopausia. Tiene como finalidad permitir el reclutamiento mensual de una cohorte de foliculos y, por ultimo, la seleccion de un solo foliculo maduro dominante capaz de ovular.

Durante la etapa folicular primordial, poco despues del reclutamiento inicial, la FSH controla la diferenciacion y el crecimiento de los foliculos. Durante la seleccion de foliculos para su reclutamiento, la FSH permite que algunos foliculos antrales escapen a su destino de muerte por apoptosis. Luego, el foliculo dominante comienza a segregar elevados niveles de estrogenos e inhibina que reducen la liberacion de FSH. Esta accion resulta en una seleccion negativa de los foliculos remanentes en la cohorte, lo que permite que estos terminen eliminandose por apoptosis. Asimismo, la produccion de determinados factores de crecimiento permite la seleccion positiva del foliculo dominante y su ovulacion (16, 17).

[FIGURA 2 OMITIR]

Con el fenomeno de luteolisis o regresion del cuerpo luteo se cierra el ciclo menstrual femenino. La luteolisis es un proceso funcional y morfologico que se inicia cuando decaen los niveles de progesterona. El cuerpo luteo involuciona en el ovario y en este proceso se han hallado distintas moleculas involucradas en la apoptosis: TNF, Fas/FasL y caspasa-3. Asimismo se ha asociado a la luteolisis con alteraciones en la expresion de la relacion Bcl-2/Bax, lo que confirma un papel fundamental de la apoptosis en este proceso (17, 18).

En sintesis, la apoptosis esta involucrada tanto en la muerte folicular durante el proceso de reclutamiento del foliculo dominante, como en la luteolisis. La comprension de la importancia de la apoptosis en la fisiopatologia ovarica podria resultar beneficiosa en el control de ciertas enfermedades. La induccion de apoptosis podria ayudar a controlar el proceso de malignidad de los tumores de ovario. Asimismo se estan desarrollando potenciales estrategias terapeuticas para combatir las fallas ovaricas prematuras con el consiguiente beneficio sobre la capacidad reproductiva de la pareja (15, 19).

CONTRIBUCION DE LA APOPTOSIS AL DESARROLLO DE LA GLANDULA MAMARIA

La mayor parte del desarrollo de la glandula mamaria ocurre en la etapa post-natal. En condiciones normales la mama no se desarrolla hasta la pubertad, cuando recibe el estimulo de las hormonas sexuales femeninas. Durante la pubertad, la apoptosis contribuye a la formacion del espacio luminal de los ductos terminales (20, 21).

Asimismo durante cada ciclo menstrual, la glandula mamaria adulta esta expuesta a fluctuaciones hormonales periodicas. El epitelio glandular mamario responde a estos cambios atravesando por etapas de proliferacion, diferenciacion y muerte celular por apoptosis. Durante la fase folicular tardia las celulas de la glandula mamaria responden a los elevados niveles de estrogeno proliferando activamente y diferenciandose limitadamente (22). En ausencia de embarazo, finalizando el ciclo menstrual, una alta proporcion de esas celulas epiteliales sufre apoptosis, asegurando de esta manera la homeostasis del tejido (20, 23).

Se ha identificado la expresion maxima de Bcl-2 en la glandula mamaria durante la fase folicular y de Bax, durante la fase lutea, lo que sugiere que la via intrinseca esta implicada en la regulacion de este proceso (24). Por otro lado, se ha observado que en la formacion del lumen de los ductos terminales estan implicadas las vias extrinseca e intrinseca de senalizacion intracelular asi como la autofagia (25).

Durante el embarazo, el aumento en los niveles de estrogeno y progesterona estimula el desarrollo glandular. Las mamas tienden a hacerse esfericas debido al aumento del tejido adiposo. En este periodo las mamas se vuelven turgentes y aumentan de tamano.

La lactancia tiende a mantener los cambios ocurridos durante el embarazo. Durante estas etapas se produce una proliferacion y diferenciacion masiva de las celulas epiteliales de la glandula mamaria. Sin embargo, esa capacidad de crecimiento natural sin una correcta programacion del sistema de diferenciacion y muerte, podria llevar a la aparicion del cancer. Esta posibilidad es evitada por el cese de la lactancia, iniciandose un proceso de regresion del epitelio secretor denominado involucion.

La involucion mamaria puede subdividirse en dos etapas: una primera fase caracterizada por apoptosis masiva de las celulas epiteliales secretorias; y una segunda, caracterizada por una remodelacion estructural de la mama (20, 23). A su vez, se ha sugerido que la primera etapa de la involucion puede subdividirse en dos estadios, un estadio de iniciacion, en el cual la apoptosis se desencadena por los receptores de muerte y otro estadio tardio, que estaria regulado por la via intrinseca de apoptosis (23).

Los receptores de muerte y sus ligandos estan involucrados en la involucion mamaria. El FasL se expresa en la glandula mamaria durante la prenez y la lactancia pero no lo hace en la mama de ratones virgenes. Por el contrario, su receptor Fas se expresa en la glandula mamaria de ratones virgenes pero se halla ausente durante la lactancia (26).

Dado que la interaccion entre Fas y su ligando es necesaria para la activacion de caspasas y el inicio de la apoptosis, la desconexion temporal de la expresion de estas proteinas durante la lactancia, la prenez y en la mama de ratones virgenes sugiere que el proceso de apoptosis en esas etapas esta inactivo.

Sin embargo, a partir del primer dia de la involucion, Fas y FasL coinciden y su expresion aumenta marcadamente, por lo que se estaria estimulando a la via extrinseca e induciendo a la apoptosis durante esta etapa. No obstante, se sabe que esta via no seria la unica implicada en la muerte celular durante la involucion mamaria ya que su ausencia solo retrasa el proceso de involucion pero no lo suprime (26).

Distintos estudios han demostrado que las caspasas iniciadoras y efectoras estan involucradas en la involucion mamaria post-lactancia (27). Se ha observado tambien que tanto el Bax como el Bak y el Bcl-xS todas proteinas pro-apoptoticas, estan implicadas en la regulacion de la apoptosis de esta etapa (28).

De todo lo expuesto se puede deducir que tanto la via extrinseca como la intrinseca estan involucradas en la muerte por apoptosis que ocurre durante la involucion mamaria. Se han identificado distintos estimulos que disparan este proceso, sugiriendo que la regulacion de la apoptosis durante la involucion es multifactorial e implica la yuxtaposicion de varias vias de senalizacion. La inhibicion de una de estas vias, no aborta por completo el proceso pues la importancia del retorno de la mama al estadio pre-prenez es primordial, por lo cual la involucion esta asegurada por la redundancia de distintos mecanismos de regulacion (20).

APOPTOSIS EN EL ENDOMETRIO EUTOPICO Y EN LA ENDOMETRIOSIS

El tejido endometrial sufre cambios morfologicos dinamicos a lo largo del ciclo menstrual. Regularmente durante la fase folicular, las celulas endometriales proliferan en forma activa y durante la fase secretoria, este crecimiento disminuye (29). De este modo, para asegurar el mantenimiento homeostatico del tejido, deben existir mecanismos inhibitorios que contrarrestan la proliferacion celular endometrial.

Se sabe que la apoptosis juega un papel importante en los cambios ciclicos que ocurren a lo largo del ciclo menstrual. Durante la menstruacion, el endometrio uterino se descama y se produce una degeneracion del tejido que involucra tanto procesos de necrosis como de apoptosis (30). Sin embargo, a pesar de los avances de la investigacion basica en los ultimos anos, aun no se termina de dilucidar la manera precisa por la cual los mecanismos de apoptosis, arresto del ciclo celular y proliferacion celular se combinan e interaccionan en el endometrio humano.

Las celulas endometriales bajo condiciones apropiadas, sufren apoptosis. En 1976, Hopwood y col. (31) realizaron el primer estudio de apoptosis en el endometrio humano e identificaron cambios en la apoptosis de las celulas glandulares epiteliales a lo largo del ciclo menstrual. Mas tarde, distintos autores describieron que la apoptosis del epitelio glandular endometrial varia a lo largo del ciclo reproductivo: aumenta durante la fase secretoria y alcanza un pico en la menstruacion (30, 32, 33).

Se han estudiado tambien los cambios ciclicos de la expresion de la proteina reguladora de apoptosis Bcl-2. Se ha sugerido que la expresion de Bcl-2 en el endometrio humano estaria regulada in-vivo por la circulacion de las hormonas esteroideas ovaricas (33, 34).

Se determino que la inmunoreactividad de las proteinas Bcl-2 y Bax es predominante en las celulas del epitelio glandular del endometrio y se confirmo que durante la fase proliferativa prevalece la proteina Bcl-2, mientras que la expresion de la proteina Bax se incrementa significativamente en la fase secretoria cuando prevalece la apoptosis (33).

De estos hallazgos se deduce la importancia de los oncogenes Bcl-2 y Bax en la regulacion del crecimiento endometrial, aunque tambien se ha hallado involucrada la via extrinseca en la regulacion de la apoptosis que ocurre durante el ciclo menstrual (35, 36). En particular se ha hallado expresion aumentada de FasL y aumento de la actividad de las caspasas 3, 8 y 9 durante la fase secretoria y menstrual (37, 38).

Asi como la apoptosis esta involucrada en los cambios en el tejido endometrial que ocurren a nivel fisiologico, se ha asociado a la muerte celular programada con procesos patologicos, especialmente en aquellos caracterizados por el incremento en el crecimiento celular como es el caso de la endometriosis.

La endometriosis se define como la presencia de focos de tejido endometrial funcionante fuera de la cavidad uterina. Es la enfermedad ginecologica mas frecuente, afecta aproximadamente entre a un 3 y un 10% de las mujeres en edad reproductiva (39). Por otro lado, 20 a 50% de las pacientes que se someten a laparoscopias por dolor pelvico, presentan esta patologia (40). Su origen es aun hoy discutido, sin embargo, la teoria mas aceptada es la propuesta por Sampson que postula que se origina por migracion de celulas del endometrio eutopico a la cavidad peritoneal a traves de la menstruacion retrograda (41). Por otro lado, se ha propuesto que la alteracion inmunologica e inflamatoria del ambiente peritoneal tambien contribuye al establecimiento de la endometriosis (42).

Actualmente se conoce que el tejido endometrial eutopico de las pacientes con endometriosis posee diferencias significativas con respecto al tejido uterino de las mujeres sin la enfermedad. Estas desigualdades observadas por diversos investigadores, otorgan sustento al concepto de que el endometrio eutopico de las pacientes con endometriosis es inherentemente anomalo y juega un papel importante en la etiopatogenia de la enfermedad (43).

La proliferacion celular y la muerte por apoptosis, son dos de las vias biologicas mas importantes que normalmente regulan el crecimiento y la homeostasis tisular. En trabajos previos se ha observado una inhibicion significativa de la apoptosis y un incremento de la proliferacion celular del endometrio eutopico de las pacientes con endometriosis (44). Los bajos niveles de apoptosis observados por Meresman y col. (44) tanto en celulas epiteliales como en estromales han sido reportados tambien por Dmowski y col. (45) en el tejido endometrial completo, quienes propusieron que la supervivencia de las celulas endometriales en un sitio ectopico dependeria en parte, de la capacidad inherente de las celulas para morir o no por apoptosis.

Como ya se dijo, la muerte celular programada es controlada por la expresion de un numero de genes regulatorios que incluyen, entre otros, al Bcl-2, que promueve la supervivencia celular bloqueando la apoptosis, y al Bax que antagoniza la actividad del Bcl-2. En estudios previos se ha observado que la capacidad de supervivencia aumentada que poseen las celulas endometriales de las pacientes con endometriosis, estaria regulada por el aumento de la proteina Bcl-2 y la disminucion de Fas y FasL, lo que estaria sugiriendo un papel protagonico de estas moleculas en la regulacion de la apoptosis endometrial (44, 46).

Asimismo en endometriosis, el fluido peritoneal posee una proporcion significativamente mayor de macrofagos peritoneales que expresan Bcl-2 que el grupo control; mientras que en las mujeres sin endometriosis, el numero de macrofagos peritoneales que expresan Bax esta significativamente aumentado (47). Todas estas evidencias sugieren una predisposicion de las celulas endometriales a ser resistentes a la apoptosis y a continuar sobreviviendo, lo que tendria importantes consecuencias en la proliferacion del tejido endometrial ectopico.

La medicacion utilizada para tratar la endometriosis incluye, entre otros protocolos, el uso de anticonceptivos orales o agonistas de GnRH, basandose en la sensibilidad del tejido endometriosico a responder a hormonas ovaricas.

En estudios previos, se ha observado que los anticonceptivos orales combinados (AOC) modulan el crecimiento endometrial en las pacientes con endometriosis a traves de la induccion de la muerte celular programada y de la inhibicion de la proliferacion celular, dos de los factores que tendrian implicancias en el crecimiento y en la recurrencia de la enfermedad (46).

Asimismo, recientemente se ha evaluado la expresion de Fas y de FasL por inmunohistoquimica utilizando anticuerpos especificos en la fraccion epitelial y en la fraccion estromal del tejido endometrial de las pacientes tratadas con AOC y se ha realizado la cuantificacion de la inmunomarcacion por el metodo de Hscore (48).

Los resultados indican que el endometrio de las pacientes con endometriosis presenta una inhibicion de la expresion de Fas comparado con el control. Los valores hallados en la fraccion epitelial fueron de 254 [+ o -] 22 en los controles y 153 [+ o -] 13 en endometriosis (unidades de Hscore) (p<0,05) mientras que en la fraccion estromal los resultados fueron de 231 [+ o -] 18 y 150 [+ o -] 10 en el endometrio eutopico de controles y de pacientes con endometriosis respectivamente (p<0,05).

Esta inhibicion observada en la expresion de Fas se relaciona con los bajos niveles de apoptosis previamente demostrados en las pacientes con endometriosis (46). Luego de la administracion de AOC, ademas de la clara atrofia endometrial que se hallo por el analisis histologico se observo un aumento de la expresion de Fas: 298 [+ o -] 34 vs. 153 [+ o -] 13 en celulas epiteliales y 323 [+ o -] 7 vs. 150 [+ o -] 10 en celulas estromales (p<0,001 vs. endometriosis antes del tratamiento con AOC) (Fig. 3A).

Este patron de expresion de Fas fue comparable al observado en los controles (p>0.05, no significativo), lo que indicaba que el incremento de la apoptosis observado luego de la administracion de AOC era probablemente regulado por esta proteina. Asimismo se ha evaluado la expresion de FasL en esas mismas pacientes y hemos observado una disminucion en la fraccion epitelial del tejido endometrial de las mujeres con endometriosis comparado a los valores de las muestras controles: 265 [+ o -] 22 vs. 166 [+ o -] 22 respectivamente (p<0,05). Las celulas estromales presentaron un patron similar de expresion de FasL: 244 [+ o -] 14 (controles) y 161 [+ o -] 12 (endometriosis) (p<0,05).

[FIGURA 3 OMITIR]

Luego de la administracion de los AOC a pacientes con endometriosis se observo un marcado incremento de la expresion de FasL que se correspondia con el aumento de apoptosis observado previamente (46): 315 [+ o -] 34 en celulas epiteliales y 333 [+ o -] 48 en celulas estromales (p<0,01 vs. Endometriosis antes del tratamiento con AOC). En este caso tambien los niveles de expresion de FasL mostraron similitud con el control (P>0,05, no significativo), lo que indicaria que este ligando tambien participaria en el aumento de apoptosis inducido por el tratamiento con AOC (Fig. 3B).

El papel de los estrogenos en la estimulacion de la proliferacion celular endometrial tanto in-vivo (49) como in-vitro (50) ha sido muy estudiado. Sin embargo, el mecanismo molecular por el cual los esteroides sexuales regulan el crecimiento endometrial, aun no esta definido.

Un trabajo realizado por Rider y col. (51) ha propuesto que los estrogenos serian esenciales para la sintesis del receptor de progesterona y de factores de crecimiento necesarios para el progreso de la fase G0 a la fase G1 del ciclo celular. Asimismo, la administracion de progestagenos ha demostrado estar involucrada en la inhibicion de la proliferacion endometrial (52) y se ha sugerido tambien una posible implicancia de estos compuestos sobre la induccion de la apoptosis (53).

Por otro lado, los agonistas y mas recientemente los antagonistas de GnRH se emplean en el tratamiento de la endometriosis, sobre la base de una dependencia hormonal de los implantes ectopicos. El endometrio humano posee receptores de GnRH tanto en la fraccion estromal como en la epitelial que se expresan durante todo el ciclo menstrual (54). Los agonistas de GnRH, por un mecanismo de desensibilizacion hipofisaria, reducen en forma reversible la produccion de gonadotrofinas y como consecuencia se suprimen los esteroides ovaricos circulantes.

Los estudios del impacto del tratamiento con agonistas de GnRH sobre las lesiones endometriosicas, demostraron que los tamanos de las lesiones se reducen de forma significativa, independientemente de la gravedad de las mismas y en una proporcion muy semejante sobre cada una de ellas (55, 56). Adicionalmente, se sabe que los agonistas de GnRH inducen la muerte celular por apoptosis en otros sistemas como en foliculo ovarico, cuerpo luteo, celulas de granulosa en cultivo (57) y en celulas provenientes de miomas uterinos (58).

Estudios previos realizados en un modelo experimental de endometriosis in-vitro han demostrado que tanto los agonistas como los antagonistas de GnRH modulan el crecimiento de las celulas endometriales provenientes de las pacientes con endometriosis a traves de la induccion de la muerte celular programada mediada por las vias extrinseca e intrinseca, y a traves de la inhibicion de la proliferacion celular, dos de los factores que tendrian implicaciones en el desarrollo y en la recurrencia de la enfermedad (59, 60).

Por otro lado, es sabido que la terapeutica que se propone actualmente a las pacientes con endometriosis no es del todo efectiva pues la infertilidad asociada a la patologia no siempre es revertida y ademas, son habituales los casos de recidivas luego de la medicacion supresora o de la terapia quirurgica (61). Dada esta situacion, la busqueda de nuevas estrategias terapeuticas mas eficientes, y que acarreen menos efectos colaterales, es constante.

Entre las nuevas opciones para tratar la endometriosis, ultimamente se ha propuesto a los inhibidores de aromatasa, a los inhibidores de la enzima ciclo-oxigenasa-2 (COX-2) y a los compuestos anti-angiogenicos. Antecedentes previos han demostrado la eficacia de estas nuevas alternativas terapeuticas tanto in-vivo como in-vitro (62, 63).

Los inhibidores de aromatasa anastrazole y letrozole son utilizados con exito en la terapeutica del cancer de mama (64). Ademas del efecto supresor de la sintesis de estrogenos, se conocen efectos inductores de la apoptosis y anti-proliferativos directos de estos compuestos sobre algunos tipos celulares (65). En un estudio reciente hemos observado que tanto anastrozole como letrozole disminuyen la proliferacion celular e incrementan la apoptosis en las celulas epiteliales endometriales de pacientes con endometriosis (66).

Los anti-inflamatorios no esteroideos (AINEs) como la aspirina o el ibuprofeno nhiben la actividad de COX. El celecoxib pertenece a una nueva generacion de AINEs que inhiben selectivamente COX-2 sin inhibir COX-1. Este compuesto esta siendo ultimamente evaluado por sus efectos inhibitorios de la progresion tumoral. Especificamente, han sido descriptos efectos anti-angiogenicos, anti-proliferativos y pro-apoptoticos tanto in-vitro, in-vivo, como en ensayos clinicos actualmente en curso (67-69). Mas aun, en estudios recientes se ha demostrado que el celecoxib inhibe el crecimiento tumoral induciendo la apoptosis de manera independiente de su capacidad para bloquear la COX-2 (68, 70). Se ha propuesto ademas que celecoxib actuaria en forma sinergica con inhibidores de aromatasa en el tratamiento del cancer de mama, efecto que tambien se esta evaluando a traves de un estudio clinico actualmente en curso (64).

Estudios recientes sugieren que celecoxib favoreceria la regresion de la lesion endometriosica, inhibiendo la proliferacion celular, induciendo la apoptosis y disminu yendo la angiogenesis y avalan a esta droga para continuar siendo evaluada como alternativa terapeutica para la endometriosis (63, 71).

En sintesis, la muerte celular programada es un evento sumamente complejo y finamente regulado que esta involucrado tanto en la fisiologia como en la patologia del sistema reproductor femenino. El hecho de que los tejidos reproductivos atraviesen por etapas ciclicas de crecimiento y muerte destaca la importancia del control de dicha proliferacion celular para evitar un escape de los parametros de normalidad. Este delicado balance entre la apoptosis y la proliferacion celular es fundamental porque permite que los tejidos puedan responder en forma controlada a los cambios hormonales que acontecen en la vida reproductiva de las mujeres.

Por otro lado, se han detectado defectos en los niveles de apoptosis en ciertas patologias de tejidos reproductivos como en la endometriosis o en algunos tumores, donde la investigacion basica esta aportando nuevos fundamentos para utilizarlos en la busqueda de alternativas terapeuticas mas eficientes. En este sentido se han desarrollado medicamentos inductores de la apoptosis que fueron probados con exito tanto en modelos experimentales como en estudios clinicos (72). Siendo asi, se abre una nueva esperanza en la terapeutica empleada en el manejo de los tumores y de la endometriosis que se basan en el conocimiento del desequilibrio entre los mecanismos de apoptosis y de proliferacion celular.

Recibido:26-11-2010. Aceptado:14-04-2011

REFERENCIAS

(1.) Van Cruchten S, Van Den BW. Morphological and biochemical aspects of apoptosis, oncosis and necrosis. Anat Histol Embryol 2002; 31:214-223.

(2.) Assuncao GC, Linden R. Programmed cell deaths. Apoptosis and alternative death-styles. Eur J Biochem 2004; 271:1638-1650.

(3.) Lawen A. Apoptosis-an introduction. Bio essays 2003; 25:888-896.

(4.) Allen RT, Hunter WJ, III, Agrawal DK. Morphological and biochemical characterization and analysis of apoptosis. J Pharmacol Toxicol Methods 1997; 37:215-228.

(5.) Barnhart BC, Alappat EC, Peter ME. The CD95 type I/type II model. Semin Immunol 2003; 15:185-193.

(6.) Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J 1997; 326 (Pt 1):1-16.

(7.) Peter ME, Krammer PH. The CD95 (APO-1/Fas) DISC and beyond. Cell Death Differ 2003; 10:26-35.

(8.) Youle RJ, Strasser A. The BCL-2 protein family: opposing activities that mediate cell death. Nat Rev Mol Cell Biol 2008; 9:47-59.

(9.) Burlacu A. Regulation of apoptosis by Bcl-2 family proteins. J Cell Mol Med 2003; 7:249-257.

(10.) Gross A, McDonnell JM, Korsmeyer SJ. BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis. Genes Dev 1999; 13: 1899-1911.

(11.) Steller H. Mechanisms and genes of cellular suicide. Science 1995; 267:1445-1449.

(12.) Abud HE. Shaping developing tissues by apoptosis. Cell Death Differ 2004; 11:797-799.

(13.) Capel B. The battle of the sexes. Mech Dev 2000; 92:89-103.

(14.) Kaipia A, Hsueh AJ. Regulation of ovarian follicle atresia. Annu Rev Physiol 1997; 59: 349-363.

(15.) Hussein MR. Apoptosis in the ovary: molecular mechanisms. Hum Reprod Update 2005; 11:162-177.

(16.) McGee EA, Hsueh AJ. Initial and cyclic recruitment of ovarian follicles. Endocr Rev 2000; 21:200-214.

(17.) Markstrom E, Svensson EC, Shao R, Svanberg B, Billig H. Survival factors regulating ovarian apoptosis--dependence on follicle differentiation. Reproduction 2002; 123:23-30.

(18.) Sugino N, Suzuki T, Kashida S, Karube A, Takiguchi S, Kato H. Expression of Bcl-2 and Bax in the human corpus luteum during the menstrual cycle and in early pregnancy: regulation by human chorionic gonadotropin. J Clin Endocrinol Metab 2000; 85:4379-4386.

(19.) Krysko DV, Diez-Fraile A, Criel G, Svistunov AA, Vandenabeele P, D'Herde K. Life and death of female gametes during oogenesis and folliculogenesis. Apoptosis 2008; 13:1065-1087.

(20.) Green KA, Streuli CH. Apoptosis regulation in the mammary gland. Cell Mol Life Sci 2004; 61:1867-1883.

(21.) Humphreys RC, Krajewska M, Krnacik S, Jaeger R, Weiher H, Krajewski S, Reed JC, Rosen JM. Apoptosis in the terminal endbud of the murine mammary gland: a mechanism of ductal morphogenesis. Development 1996; 122:4013-4022.

(22.) Andres AC, Strange R. Apoptosis in the estrous and menstrual cycles. J Mammary Gland Biol Neoplasia 1999; 4:221-228.

(23.) Jager R. Targeting the death machinery in mammary epithelial cells: Implications for breast cancer from transgenic and tissue culture experiments. Crit Rev Oncol Hematol 2007; 63:231-240.

(24.) Feuerhake F, Sigg W, Hofter EA, Unterberger P, Welsch U. Cell proliferation, apoptosis, and expression of Bcl-2 and Bax in non-lactating human breast epithelium in relation to the menstrual cycle and reproductive history. Breast Cancer Res Treat 2003; 77:37-48.

(25.) Mills KR, Reginato M, Debnath J, Queenan B, Brugge JS. Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) is required for induction of autophagy during lumen formation in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A 2004; 101:3438-3443.

(26.) Mor G, Straszewski S, Kamsteeg M. Role of the Fas/Fas ligand system in female reproductive organs: survival and apoptosis. Biochem Pharmacol 2002; 64:1305-1315.

(27.) Marti A, Graber H, Lazar H, Ritter PM, Baltzer A, Srinivasan A, Jaggi R. Caspases: decoders of apoptotic signals during mammary involution. Caspase activation during involution. Adv Exp Med Biol 2000; 480:195-201.

(28.) Metcalfe AD, Gilmore A, Klinowska T, Oliver J, Valentijn AJ, Brown R, Ross A, MacGregor G, Hickman JA, Streuli CH. Developmental regulation of Bcl-2 family protein expression in the involuting mammary gland. J Cell Sci 1999; 112 (Pt 11):1771-1783.

(29.) Kayisli UA, Guzeloglu-Kayisli O, Arici A. Endocrine-immune interactions in human endometrium. Ann N Y Acad Sci 2004; 1034:50-63.

(30.) Harada T, Kaponis A, Iwabe T, Taniguchi F, Makrydimas G, Sofikitis N, Paschopoulos M, Paraskevaidis E, Terakawa N. Apoptosis in human endometrium and endometriosis. Hum Reprod Update 2004; 10:29-38.

(31.) Hopwood D, Levison DA. Atrophy and apoptosis in the cyclical human endo metrium. J Pathol 1976; 119:159-166.

(32.) Harada T, Taniguchi F, Izawa M, Ohama Y, Takenaka Y, Tagashira Y, Ikeda A, Watanabe A, Iwabe T, Terakawa N. Apoptosis and endometriosis. Front Biosci 2007; 12:3140-3151.

(33.) Tao XJ, Tilly KI, Maravei DV, Shifren JL, Krajewski S, Reed JC, Tilly JL, Isaacson KB. Differential expression of members of the bcl-2 gene family in proliferative and secretory human endometrium: glandular epithelial cell apoptosis is associated with increased expression of bax. J Clin Endocrinol Metab 1997; 82:2738-2746.

(34.) Jones RK, Searle RF, Bulmer JN. Apoptosis and bcl-2 expression in normal human endometrium, endometriosis and adenomyosis. Hum Reprod 1998; 13:3496-3502.

(35.) Wei P, Jin X, Tao SX, Han CS, Liu YX. Fas, FasL, Bcl-2, and Bax in the endometrium of rhesus monkey during the menstrual cycle. Mol Reprod Dev 2005; 70:478-484.

(36.) Yamashita H, Otsuki Y, Matsumoto K, Ueki K, Ueki M. Fas ligand, Fas antigen and Bcl-2 expression in human endometrium during the menstrual cycle. Mol Hum Reprod 1999; 5:358-364.

(37.) Otsuki Y. Apoptosis in human endometrium: apoptotic detection methods and signaling. Med Electron Microsc 2001; 34:166-173.

(38.) Selam B, Kayisli UA, Mulayim N, Arici A. Regulation of Fas ligand expression by estradiol and progesterone in human endometrium. Biol Reprod 2001; 65:979-985.

(39.) McLeod BS, Retzloff MG. Epidemiology of endometriosis: an assessment of risk factors. Clin Obstet Gynecol 2010; 53:389-396.

(40.) Wu MH, Shoji Y, Chuang PC, Tsai SJ. Endometriosis: disease pathophysiology and the role of prostaglandins. Expert Rev Mol Med 2007; 9:1-20.

(41.) Sampson JA. Peritoneal endometriosis due to menstrual dissemination of endometrial tissue into the peritoneal cavity. Am J Obstet Gynecol 1927; 14:422-469.

(42.) Jensen JR, Coddington CC. III. Evolving spectrum: the pathogenesis of endometriosis. Clin Obstet Gynecol 2010; 53:379-388.

(43.) Ulukus M, Cakmak H, Arici A. The role of endometrium in endometriosis. J Soc Gynecol Investig 2006; 13:467-476.

(44.) Meresman GF, Vighi S, Buquet RA, Contreras-Ortiz O, Tesone M, Rumi LS. Apoptosis and expression of Bcl-2 and Bax in eutopic endometrium from women with endometriosis. Fertil Steril 2000; 74:760-766.

(45.) Dmowski WP, Gebel H, Braun DP. Decreased apoptosis and sensitivity to macrophage mediated cytolysis of endometrial cells in endometriosis. Hum Reprod Update 1998; 4:696-701.

(46.) Meresman GF, Auge L, Baranao RI, Lombardi E, Tesone M, Sueldo C. Oral contraceptives suppress cell proliferation and enhance apoptosis of eutopic endometrial tissue from patients with endometriosis. Fertil Steril 2002; 77: 1141-1147.

(47.) McLaren J, Prentice A, Charnock-Jones DS, Sharkey AM, Smith SK. Immunolocalization of the apoptosis regulating proteins Bcl-2 and Bax in human endometrium and isolated peritoneal fluid macrophages in endometriosis. Hum Reprod 1997; 12:146-152.

(48.) Dufournet C, Uzan C, Fauvet R, Cortez A, Siffroi JP, Darai E. Expression of apoptosis-related proteins in peritoneal, ovarian and colorectal endometriosis. J Reprod Immunol 2006; 70:151-162.

(49.) Deligdisch L. Hormonal pathology of the endometrium. Mod Pathol 2000; 13:285-294.

(50.) Pierro E, Minici F, Alesiani O, Miceli F, Proto C, Screpanti I, Mancuso S, Lanzone A. Stromal-epithelial interactions modulate estrogen responsiveness in normal human endometrium. Biol Reprod 2001; 64:831-838.

(51.) Rider V, Kimler BF, Justice WM. Progesterone-growth factor interactions in uterine stromal cells. Biol Reprod 1998; 59: 464-469.

(52.) Moyer DL, Felix JC. The effects of progesterone and progestins on endometrial proliferation. Contraception 1998; 57:399-403.

(53.) Critchley HO, Tong S, Cameron ST, Drudy TA, Kelly RW, Baird DT. Regulation of bcl-2 gene family members in human endometrium by antiprogestin administration in vivo. J Reprod Fertil 1999; 115:389-395.

(54.) Grundker C, Schlotawa L, Viereck V, Eicke N, Horst A, Kairies B, Emons G. Antiproliferative effects of the GnRH antagonist cetrorelix and of GnRH-II on human endometrial and ovarian cancer cells are not mediated through the GnRH type I receptor. Eur J Endocrinol 2004; 151:141-149.

(55.) Borroni R, Di Blasio AM, Gaffuri B, Santorsola R, Busacca M, Vigano P, Vignali M. Expression of GnRH receptor gene in human ectopic endometrial cells and inhibition of their proliferation by leuprolide acetate. Mol Cell Endocrinol 2000; 159:37-43.

(56.) Vignali M. Molecular action of GnRH analogues on ectopic endometrial cells. Gynecol Obstet Invest 1998; 45 Suppl 1:2-5.

(57.) Andreu C, Parborell F, Vanzulli S, Chemes H, Tesone M. Regulation of follicular luteinization by a gonadotropin-releasing hormone agonist: relationship between steroidogenesis and apoptosis. Mol Reprod Dev 1998; 51:287-294.

(58.) Wang Y, Matsuo H, Kurachi O, Maruo T. Down-regulation of proliferation and up-regulation of apoptosis by gonadotropin-releasing hormone agonist in cultured uterine leiomyoma cells. Eur J Endocrinol 2002; 146:447-456.

(59.) Tesone M, Bilotas M, Baranao RI, Meresman G. The role of GnRH analogues in endometriosis-associated apoptosis and angiogenesis. Gynecol Obstet Invest 2008; 66 Suppl 1:10-18.

(60.) Bilotas M, Baranao RI, Buquet R, Sueldo C, Tesone M, Meresman G. Effect of GnRH analogues on apoptosis and expression of Bcl-2, Bax, Fas and FasL proteins in endometrial epithelial cell cultures from patients with endometriosis and controls. Hum Reprod 2007; 22:644-653.

(61.) Ferrero S, Abbamonte LH, Anserini P, Remorgida V, Ragni N. Future perspectives in the medical treatment of endometriosis. Obstet Gynecol Surv 2005; 60:817-826.

(62.) Bilotas M, Meresman G, Stella I, Sueldo C, Baranao RI. Effect of aromatase inhibitors on ectopic endometrial growth and peritoneal environment in a mouse model of endometriosis. Fertil Steril 2010; 93: 2513-2518.

(63.) Olivares C, Bilotas M, Buquet R, Borghi M, Sueldo C, Tesone M, Meresman G. Effects of a selective cyclooxygenase-2 inhibitor on endometrial epithelial cells from patients with endometriosis. Hum Reprod 2008; 23:2701-2708.

(64.) Goss PE. Breast cancer prevention-clinical trials strategies involving aromatase inhibitors. J Steroid Biochem Mol Biol 2003; 86: 487-493.

(65.) Thiantanawat A, Long BJ, Brodie AM. Signaling pathways of apoptosis activated by aromatase inhibitors and antiestrogens. Cancer Res 2003; 63:8037-8050.

(66.) Meresman GF, Bilotas M, Abello V, Buquet R, Tesone M, Sueldo C. Effects of aromatase inhibitors on proliferation and apoptosis in eutopic endometrial cell cultures from patients with endometriosis. Fertil Steril 2005; 84:459-463.

(67.) Basu GD, Pathangey LB, Tinder TL, Gendler SJ, Mukherjee P. Mechanisms underlying the growth inhibitory effects of the cyclo-oxygenase-2 inhibitor celecoxib in human breast cancer cells. Breast Cancer Res 2005; 7:R422-R435.

(68.) Jendrossek V, Handrick R, Belka C. Celecoxib activates a novel mitochondrial apoptosis signaling pathway. FASEB J 2003; 17:1547-1549.

(69.) Matsuzaki S, Canis M, Darcha C, Dallel R, Okamura K, Mage G. Cyclooxygenase-2 selective inhibitor prevents implantation of eutopic endometrium to ectopic sites in rats. Fertil Steril 2004; 82:1609-1615.

(70.) Lai GH, Zhang Z, Sirica AE. Celecoxib acts in a cyclooxygenase-2-independent manner and in synergy with emodin to suppress rat cholangiocarcinoma growth in vitro through a mechanism involving enhanced Akt inactivation and increased activation of caspases-9 and -3. Mol Cancer Ther 2003; 2:265-271.

(71.) Olivares C, Ricci A, Bilotas M, Baranao RI, Meresman G. The inhibitory effect of celecoxib and rosiglitazone on experimental endometriosis. Fertil Steril 2011; 96: 428-433.

(72.) Kim R. Recent advances in understanding the cell death pathways activated by anticancer therapy. Cancer 2005; 103:1551-1560.

Gabriela Meresman

Instituto de Biologia y Medicina Experimental, IBYME-CONICET. Ciudad Autonoma de Buenos Aires, Argentina.

Autor de correspondencia: Gabriela Fabiana Meresman. Instituto de Biologia Experimental, IBYME-CONICET. Vuelta de Obligado 2490, Ciudad Autonoma de Buenos Aires (1428), Argentina. Telefono: 5411-47832869. Correo electronico: g.meresman@ibyme.conicet.gov.ar.
TABLA I
PRINCIPALES DIFERENCIAS ENTRE APOPTOSIS Y NECROSIS

Necrosis                             Apoptosis

Perdida de la integridad de          No hay perdida de integridad
membrana y liberacion del            membrana
contenido celular

Floculacion de la cromatina          Agregacion de la cromatina en la
                                     membrana nuclear interna

Dilatacion de la celula y lisis      Condensacion y/o reduccion celular

No hay formacion de vesiculas,       Formacion de vesiculas limitadas
lisis completa                       por membrana (cuerpos apoptoticos)

Desintegracion de organelas (por     No hay desintegracion de
dilatacion)                          organelas, permanecen intactas

No requiere energia (proceso         Requiere ATP (proceso activo)
pasivo)

Digestion del DNA al azar            Fragmentacion del DNA en mono- y
                                     oligonucleosomas

Muerte de grupos de celulas          Muerte de celulas individuales

Originada por estimulos no           Inducida por estimulos
fisiologicos                         fisiologicos

Fagocitosis por macrofagos           Fagocitosis por macrofagos

Respuesta inflamatoria               NO hay respuesta inflamatoria
COPYRIGHT 2011 Universidad del Zulia
No portion of this article can be reproduced without the express written permission from the copyright holder.
Copyright 2011 Gale, Cengage Learning. All rights reserved.

 
Article Details
Printer friendly Cite/link Email Feedback
Author:Meresman, Gabriela
Publication:Investigacion Clinica
Article Type:Perspectiva general de la enferm
Date:Sep 1, 2011
Words:7924
Previous Article:Melanosis de la vagina e infeccion por virus del papiloma humano, una patologia poco comun: reporte de un caso.
Next Article:Diagnostico microscopico de amibiasis: Metodo obsoleto pero necesario en el mundo en desarrollo.
Topics:

Terms of use | Privacy policy | Copyright © 2018 Farlex, Inc. | Feedback | For webmasters