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Relacoes filogeneticas e diversidade de isolados de guignardia spp oriundos de diferentes hospedeiros nas regioes ITS1-5,8S-ITS2.

PHYLOGENETIC RELATIONSHIPS AND DIVERSITY OF Guignardia spp ISOLATED FROM DIFFERENT HOSTS ON ITS1-5,8S-ITS2 REGION

INTRODUCAO

O genero Guignardia (Reino Fungi, Filo Acomycota, Classe Dothideomycetes, Ordem Botryosphaeriales, Familia Botryosphaeriaceae) compreende cerca de 330 especies identificadas ate o momento, sendo muitas delas ainda sem a fase anamorfica identificada (Crouws et al., 2004). Neste genero, encontram-se especies consideradas endofiticas, como G. mangiferae, e tambem especies patogenicas, como G. citricarpa e G. psidii. Entre as especies patogenicas, G. citricarpa e o agente causal de uma importante doenca para a citricultura, a Mancha-Preta dos Citros (MPC) (Sutton e Waterston, 1966). Ja G. psidii e apontada como a responsavel por podridoes de pos-colheita que acarretam grandes perdas, principalmente em frutos de goiabeira (Tozello e Ribeiro, 1998).

Embora seja causadora de manchas foliares em mangueira, a especie G. mangiferae foi isolada em ampla gama de outros hospedeiros e, em muitos casos, considerada endofitica para o hospedeiro, por ter sido isolada a partir de tecidos assintomaticos. Estes hospedeiros incluem plantas tropicais brasileiras, como peroba-rosa (Apidosperma polineuron), cajuacu (Anacardium giganteum), aroeira (Myracrodreun urundeuva), caja (Spondias mombin), sucupira (Bowdichia nitida) e fedegoso (Cassia occidentalis) (Rodrigues et al., 2004). Plantas citricas tambem sao reconhecidamente hospedeiras de G. mangiferae (Baayen et al., 2002), embora a mesma seja considerada endofitica por nao estar relacionada a nenhum tipo de sintoma de doenca apresentada por esta planta.

Em varios estudos envolvendo fungos, o cistron que codifica o RNA ribossomal (rDNA) tem sido utilizado para estudos de sistematica molecular e filogenia. O grande numero de copias em serie desta sequencia e a uniformidade das mesmas, geralmente mantida atraves da evolucao harmonica, sao as maiores vantagens dos genes e regioes intergenicas para a analise filogenetica (White et al., 1990). Por serem mais conservadas, as regioes que compreendem os genes 18S e 28S podem ser utilizadas para diferenciacao de individuos em nivel de genero e especie (Gargas & Depriest, 1996), enquanto as regioes espacadoras ITS e IGS, por acumularem maior variabilidade genetica, sao mais utilizadas para estudos de discriminacao de especies, de subpopulacoes ou mesmo de individuos de uma mesma especie (Ristaino et al., 1998; Dresler-Nurmi et al., 1999; Baciarelli-Falini et al., 2006).

No Brasil, apesar de terem sido detectadas plantas hospedeiros de fungos do genero Guignardia, pouco se conhece acerca de quais seriam as especies do fungo, de outros possiveis hospedeiros e da diversidade genetica associada as populacoes em cada hospedeiro. Este trabalho teve por objetivo isolar e identificar isolados de Guignardia oriundos de citros, mangueira, goiabeira, eucaliptos, jabuticabeira e pitangueira, bem como caracterizar a diversidade genetica existente atraves da analise da sequencia de DNA do cistron ITS1-5,8S-ITS2.

MATERIAL E METODOS Isolamento e teste do meio aveia-agar. Os isolamentos foram realizados em tres especies citricas, laranja-'Azeda' (Citrus aurantium), limaacida 'Tahiti' (Citrus latifolia) e laranja-'Pera' (Citrus sinensis). Todas as folhas foram coletadas no municipio de Conchal-SP. Em lima-acida 'Tahiti' e laranja-'Pera', foram coletadas folhas de 30 diferentes plantas em pomar, enquanto em laranja-'Azeda' foram coletadas folhas aleatoriamente em plantas ao longo de uma fileira. A partir de tecidos de folhas de lima acida 'Tahiti'`, laranja-'Azeda' e laranja-'Pera', foram obtidos fragmentos de aproximadamente 5 mm2, retirados da parte central de um dos lobulos do limbo foliar. Esses fragmentos foram imersos em etanol 70% por um minuto e, posteriormente, em solucao de hipoclorito de sodio:agua esterilizada 1:3 v/v, por 3 minutos, e enxague em agua esterilizada por 30 segundos. Apos secagem desse material em papel de filtro esteril, tais fragmentos foram justapostos em placas de Petri contendo meio BDA (BatataDextrose-Agar) e incubados em condicao ambiente por 7 dias. Apos esse periodo, colonias tipicas de Phyllosticta spp. obtidas foram repicadas para obtencao de isolados puros. A seguir, foi realizado o isolamento dos fungos a partir das lesoes de frutos de laranja-'Pera', coletados tambem em pomar de Conchal-SP. Nos frutos, os isolamentos foram dirigidos a lesoes dos tipos mancha preta (MP) ou mancha-dura, falsa melanose (FM), mancha-sardenta (MS) mancha-trincada (MT) e mancha- rendilhada (MR). A mesma amostragem em folhas foi realizada em mangueira (Mangifera indica) (amostragem em Conchal-SP e Jaboticabal-SP) e goiabeira (Psidium guajava) (Jaboticabal-SP e Monte Alto-SP). As amostragens em eucaliptos (Eucalytus sp.), pitangueira (Eugenia uniflora) e jabuticabeira (Myrciaria cauliflora) foram realizadas unicamente em Jaboticabal-SP.

Todos os isolados obtidos foram submetidos ao teste do meio de cultura aveia-agar (AA), utilizado para distinguir os isolados patogenicos e endofiticos de Guignardia spp. (Baayen et al., 2002; Baldassari et al., 2008). Nesse estudo, um disco de 0,5 cm2 da colonia dos isolados foi colocada no centro de placas contendo o meio AA. Foram realizadas quatro replicas para cada isolado, que foram incubadas a 25[degre]C [+ ou -] 1 [degre]C e fotoperiodo 12/12 h.a 25[degre]C, por um periodo de 7--10 dias, quando entao foram avaliados quanto a formacao ou nao de halo amarelo caracteristico.

Extracao de DNA, amplificacao e sequenciamento das regioes ITS1-5,8S-ITS2. O DNA dos isolados foi extraido conforme KuramaeIzioka (1997). Para a amplificacao das regioes ITS15,8S-ITS2, utilizou-se do par de primers ITS1/ITS4 (White et al., 1990), obtendo-se o fragmento esperado de cerca de 650 pb. As reacoes de PCR foram realizadas, utilizando-se de tampao 1X (KCl 50 mM, Tris-HCl 200 mM, pH 8,4); 0,2 mM de dNTPs, 1,5 U de Taq DNA polimerase, 2 mM de MgCl2, 5 pmol de cada primer, 60 ng de DNA e agua pura esteril q.s.p. 20 [micro]L. O DNA foi amplificado em termociclador PTC-100 Programmable Thermal Controller--MJ Research, inc., com um ciclo inicial de 94[degre]C, por 2 minutos; 39 ciclos a 94[degre]C, por 1 minuto; 60 [degre]C, por 1 minuto, e 72[degre]C, por 1 minuto e 30 segundos) com um ciclo final de 10 minutos, a 72[degre]C. As amostras amplificadas foram submetidas a eletroforese em gel de agarose a 1,2%, contendo brometo de etidio (0,5 mg/mL) e padrao de concentracao pGem e apos visualizadas sob luz UV em equipamento de fotodocumentacao (GEL DOC 1000--BioRad). O DNA do fragmento amplificado de cada isolado foi entao submetido a PCR de sequenciamento utilizando-se do DYEnamic ET Dye Terminator Kit (GE Healthcare), conforme instrucoes do fabricante. O programa de termociclagem foi o mesmo utilizado para a amplificacao dos fragmentos desta regiao. As amostras com os fragmentos foram precipitadas com a isopropanol a 75% e lavadas com etanol a 70%, ressuspendidas em 3 mL de "loading buffer" padrao (5:1 formamida deionizada/ 50 mM EDTA, pH 8.0), aquecidas a 95oC, por 2 minutos, e aplicadas em gel de sequenciamento. A eletroforese foi conduzida em sequenciador ABI Prism 3700 DNA Sequencer (Applied Biossytems, Foster City, USA). As regioes ITS de cada isolado foi submetida a sequenciamento por duas vezes para maior confiabilidade da sequencia obtida. Analise das sequencias de DNA obtidas. Os eletroferogramas obtidos foram visualizados e analisados por meio do software ABI Analysis Data Collection e convertidos em sequencias de nucleotideos por meio do software DNA Sequencing Analysis Software Versao 3.3. Os eletroferogramas gerados pelo processo de sequenciamento foram submetidos ao pacote de programas Phred/Phrap/ Consed (Gordon et al., 1998) e Sequencher TM (versao 4.05 (Gene Codes Corp, Ann Arbor, USA)), para a verificacao da sua qualidade, alinhamento e corte das extremidades. As sequencias obtidas foram submetidas a comparacao em banco de dados atraves da ferramenta BLAST (Altschull et al., 1997) para verificar sua similaridade em relacao a sequencias ja depositadas no banco de dados NCBI. As sequencias foram entao alinhadas e utilizadas na construcao de dendrogramas para a verificacao da similaridade dos isolados obtidos entre si, e para as analises de distancia genetica de acordo com o hospedeiro e entre hospedeiros diferentes.

Analise das relacoes geneticas. Os dendrogramas foram construidos pelo metodo da Distancia, com o algoritmo de agrupamento Neighbor Joining (Saitou e Nei, 1987) e modelo de substituicao de Kimura-2-parameter (Kimura, 1980) atraves do software MEGA (Versao 3.1) (Kumar et al., 2004). Para assegurar a confiabialidade do agrupamento, foi realizado teste de bootstrap (Felsenstein, 1985) com 1.000 repeticoes com o mesmo software. Em cada arquivo, foram incluidas sequencias pertencentes a diferentes especies de Guignardia spp.: G. citricarpa clone 75 (ID:AF346782.1); G. citricarpa (ID: AF346772.1); G. mangiferae voucher ICMP 8336 (ID:AY816311.1); G.mangiferae (ID: AM403717.1); G. laricina (ID:AB041245.1); G. philoprina (ID:AB095507.1); G. philoprina specimen-voucher CBS 447.68 (ID: AF312014); G. aesculi (ID:AB095504.1); G. vaccinii (ID:AB041244.1);G. bidwellii (ID:AB095511.1); G. bidwellii (ID: AB095505); G. bidwellii (ID: AB095509); G. gaultheriae (ID: AB095506.1); G. gaultheriae (ID: AB095506); Phyllosticta pyrolae (ID: AF312010); Phyllosticta pyrolae (ID: AB041242) e Phyllosticta spinarum (ID: AF312009). Essas sequencias foram utilizadas para verificar a similaridade das sequencias obtidas com as depositadas no banco (GenBank). Foram selecionadas sequencias de todas as especies disponiveis no banco, embora nem todas as especies conhecidas e identificadas tenham sequencias depositadas no GenBank. Essas sequencias do banco foram selecionadas em detrimento de outras disponiveis das mesmas especies por terem maior tamanho em pares de bases e por estarem com identificacao completa. Sequencias de outros Ascomicetos como Fusarium subglutinans (ID: FSU38556), F. oxysporum (ID: FJ233193.1), Colletotrichum gloeosporioides (ID: FJ434136.1), C. lagenarium (ID: EU622278.1) e Glomerella acutata (ID: AB273195.1) foram utilizadas como outgroup. As sequencias obtidas por este trabalho foram depositadas no GenBank, e seu numero de acesso (ID) encontra-se no Anexo 1.

Distancia genetica intra e interespecifica. Indices de distancia genetica foram calculados entre os grupos de isolados de G. mangiferae de mesma planta, diferentes plantas e tambem entre diferentes hospedeiros e regioes geograficas, para isolados endofiticos e para patogenicos. Esses indices tambem foram calculados para os isolados identificados como G. citricarpa oriundos de citros e tambem para os isolados que nao puderam ser identificados em nivel de especie. As estimativas de distancia genetica foram utilizadas para inferir a divergencia genetica dentro e entre grupos de isolados (Nei, 1972). Essa distancia genetica entre isolados de uma mesma planta foi estimada pela media aritmetica da distancia entre cada um dos individuos, comparados dois a dois (Nei e Kumar, 2000). Ja a distancia entre grupos de isolados de diferentes plantas, hospedeiros ou regiao geografica foi calculada pela media aritmetica de todas as distancias entre os dois grupos (Nei e Kumar, 2000). Esses valores foram obtidos utilizandose do padrao de substituicao de nucleotideos Kimura2-Parameter (Kimura, 1980) atraves do software MEGA (3.1 version) (Kumar et al., 2004).

RESULTADOS

Isolamento e teste do meio aveia-agar. Para este estudo, foram obtidos isolados de diferentes hospedeiros e regioes geograficas, conforme apresentados na Tabela 1.

Todos os isolados obtidos foram submetidos ao teste de meio AA, observando-se que os isolados apresentaram a resposta descrita na literatura para isolados patogenicos e endofiticos (Baayen et al., 2002; Baldassari et al., 2008). Verificou-se que uma terceira e diferente resposta foi apresentada por alguns isolados deste estudo. O teste do meio aveiaagar dividiu os isolados em tres categorias (Figura 1 e Tabela 2): o primeiro grupo nao apresentou formacao de halo amarelo, o que caracterizou os isolados como nao-patogenicos ou endofiticos, sendo este grupo formado por isolados de folhas de lima-acida 'Tahiti', de laranja-'Azeda', mangueira, goiabeira, eucaliptos, pitangueira e jabuticabeira. Outro grupo apresentou a formacao de halo caracteristico de isolados patogenicos, de cor amarela, composto por isolados oriundos de lesoes de MPC, de folhas de lima-acida 'Tahiti' e de laranja'Azeda'. O terceiro grupo apresentou a formacao de um halo branco-amarelado, ainda nao descrito em literatura, sendo composto por isolados oriundos exclusivamente de mangueira.

Analise das sequencias de DNA obtidas. As regioes ITS1-5,8S-ITS2 de todos os isolados mostraram similaridade igual ou maior do que 90% com sequencias de fungos pertencentes ao genero Guignardia depositadas no NCBI, demonstrando que todos os isolados deste trabalho pertencem ao genero Guignardia. As sequencias das regioes ITS15,8S-ITS2 tambem se mostraram eficientes em identificar a maioria dos isolados em nivel de especie. Quando as sequencias foram comparadas uma a uma no banco de dados, foi possivel identificar isolados da especie G. mangiferae e G. citricarpa com similaridades superiores a 97% em todos os hospedeiros, embora para um grupo de isolados oriundos de mangueira nao tenha sido encontrada similaridade suficiente para a identificacao da especie. Em mangueira, foram encontrados tres diferentes grupos de Guignardia, dos quais somente um pode ser identificado de acordo com as regioes ITS. O grupo identificado como G. mangiferae apresentou similaridade superior a 97% com sequencias depositadas no banco de dados NCBI classificadas como sendo desta especie. Os outros dois grupos, diferentes de G. mangiferae e tambem diferentes entre si, mostraram similaridades menores do que 97% com sequencias depositadas no banco de dados. Os isolados MC apresentaram similaridade de 92% a 94 % com G. philoprina e tambem com G. pyrolae (ou Phyllosticta pyrolae). Ja o grupo M/MM apresentou similaridade de 91 a 93 % com G. citricarpa. Estes dois grupos, M/MM e MC, apresenta uma similaridade de 92% com ambas as especies G. mangiferae e G. citricarpa, indicando nao pertencerem a nenhuma das duas, quando analisados individualmente por BLAST em banco de dados.

Analise das relacoes geneticas. Os isolados obtidos de lesoes de MPC em frutos de laranja-'Pera' agruparam-se com sequencias de DNA depositadas em banco de dados pertencentes a G. citricarpa (Figura 2), assim como alguns isolados oriundos de folhas assintomaticas de lima-acida 'Tahiti' (Figura 3), de laranja-'Pera' (Figura 4) e de laranja-'Azeda' (Figura 5). Ja outros isolados obtidos de folhas assintomaticas de lima- acida 'Tahiti', laranja-'Pera' e de laranja-'Azeda' agruparam-se com sequencias do banco pertencentes a G. mangiferae. Todos os isolados obtidos de eucaliptos (Figura 6), pitangueira (Figura 7) e jabuticabeira (Figura 8) tambem se agruparam no dendrograma com G. mangiferae, assim como todos os isolados obtidos de goiabeira (Figura 9), inclusive os obtidos de sintomas de podridao de fruto. Em mangueira (Figura 10), alem das sequencias identificadas como pertencentes a G. mangiferae, dois grupos de isolados nao apresentaram similaridade suficiente para serem identificados em nivel de especie, embora no dendrograma um grupo dos isolados M e MM tenha-se aproximado de G. citricarpa, demonstrando serem geneticamente mais proximos a esta especie. O outro grupo, formado por isolados MC, aproximou-se de diferentes especies, como G. bidwellii, G. philoprina, G. aesculi e G. gaultheriae, alem de Phyllostica spinarum e P. pyrolae. Um dos grupos de Guignardia sp. identificado como MM/M foi encontrado colonizando plantas de mangueira em duas regioes geograficas diferentes, Jaboticabal e Conchal-SP, enquanto os isolados identificados como MC foram encontrados somente em Jaboticabal-SP. As sequencias consenso obtidas para cada grupo de isolados da Tabela 2 nao demonstraram alteracao da identificacao obtida com as sequencias individuais, embora os isolados MC tenham-se aproximado de Phyllosticta spinarum (Figura 11), embora provavelmente nao pertencam a esta especie.

Distancia genetica intra e intergrupos. Para as analises de distancia genetica intra e intergrupos, os isolados foram divididos de acordo com sua resposta ao meio aveia-agar, identificacao de acordo com as regioes ITS1-5,8S-ITS2, hospedeiro e regiao geografica, obtendo-se assim 18 grupos de isolados, de acordo com a Tabela 2. Verificou-se que o grupo de isolados obtidos de lima-acida 'Tahiti' e identificados como G. mangiferae, seguidos pelos isolados de pitangueira e jabuticabeira, apresentaram a maior distancia genetica entre si. Embora todos tenham sido classificados como nao-patogenicos pelo meio aveia-agar e como G. mangiferae pelas regioes ITS1-5,8S-ITS2, estes grupos apresentaram maior diversidade genetica entre seus componentes. Os isolados oriundos de goiabeira e tambem identificados como G. mangiferae, tanto de folhas como de frutos sintomaticos e assintomaticos, mostraram menores indices de distancia genetica e, portanto, apresentando maior homogeneidade genetica.

A analise entre os grupos de isolados demonstrou que as menores distancias geneticas foram apresentadas entre grupos de isolados de mesma especie, tanto G. citricarpa quanto G. mangiferae, mesmo quando oriundos de diferentes hospedeiros (Tabela 3). Os isolados identificados como G. citricarpa e G. mangiferae apresentaram uma distancia genetica media de 0.10 entre si. Ja os isolados oriundos de mangueira, que nao puderam ser identificados em nivel de especie, apresentaram uma distancia genetica maior em relacao a G. mangiferae do que em relacao a G. citricarpa, embora a distancia genetica observada tenha demonstrado que os mesmos sao distintos em relacao a estas duas especies e tambem entre si.

DISCUSSAO

Os resultados obtidos atraves das sequencias de DNA das regioes ITS1-5,8S-ITS2 mostraram que plantas de citros sao hospedeiras da especie patogenica G. citricarpa e tambem de G. mangiferae. Entretanto, apesar de serem hospedeiras da especie patogenica, laranja-'Azeda' e lima-acida 'Tahiti'nao apresentam sintomas da MPC, mesmo quando em presenca de grandes quantidades de fontes de inoculo ou proximas a pomares com alta incidencia da doenca. As amostragens para lima-acida 'Tahiti' e laranja-'Azeda' deste trabalho foram realizadas em Conchal-SP, em locais de alta incidencia da doenca. O fato de lima-acida 'Tahiti' ser hospedeira da especie patogenica G. citricarpa foi anteriormente relatada (Baldassari et al., 2008), mas o fato da laranja'Azeda' apresentar comportamento semelhante constitui-se uma informacao nova e de grande importancia. Assim, o fato de hospedarem a especie patogenica sem apresentarem sintomas torna estas duas especies citricas interessantes para programas de melhoramento visando a resistencia a MPC. Embora a natureza do mecanismo que impede o aparecimento de sintomas nestas duas especies seja ainda desconhecido, e provavel que o mesmo seja estrutural, genetico, metabolico ou oriundo de alguma combinacao entre estes fatores. Em plantas citricas, tambem foi observado que isolados das duas especies, G. citricarpa e G. mangiferae, coexistem em uma mesma planta, uma vez que ambas foram isoladas em folhas assintomaticas de uma mesma planta em laranja'Azeda', laranja-'Pera' e lima-acida 'Tahiti'. Desta forma, e provavel que nao haja competicao pelo mesmo nicho por estas duas especies, da mesma forma que em mangueira, onde G. mangiferae coexiste em uma mesma planta com os outros dois grupos de Guignardia ainda nao identificados. Os resultados obtidos pelo teste do meio AA e pelo sequenciamento das regioes ITS1-5,8S-ITS2 mostraram concordancia entre si. Os isolados que apresentaram formacao de halo amarelo agruparamse com alta similaridade (maior ou igual a 97%) com sequencias obtidas do banco de dados pertencentes a G. citricarpa, enquanto os isolados que nao apresentaram formacao de halo agruparam-se com sequencias pertencentes a G. mangiferae tambem com alta similaridade (maior ou igual a 97%). Baldassari et al. (2008) tambem utilizaram esse meio de cultura na identificacao previa de seus isolados e constataram que os isolados que apresentaram halo amarelo em meio aveia-agar se mostraram patogenicos em testes de patogenicidade a campo, enquanto os que nao mostraram formacao de halo tambem nao causaram sintomas em diferentes variedades de laranjas-doces. Segundo esse autor, a utilizacao do meio aveia-agar mostrou-se uma alternativa simples, eficiente e relativamente rapida na distincao entre isolados de patogenicos e endofiticos para citros.

Ao contrario da especie G. citricarpa, que entre os hospedeiros deste trabalho foi encontrada unicamente em citros, a especie G. mangiferae demonstrou ter uma ampla gama de hospedeiros, taxonomicamente muito diferentes entre si. Assim, plantas ja descritas como hospedeiras de G. mangiferae, como mangueira (Mangifera indica L.), bananeira (Musa sp.), citros (Citrus sp.), goiabeira (Psidium guajava), eucaliptos (Eucalytus sp.) e plantas da familia Ericaeae (Okane et al., 2001) somam-se aos novos hospedeiros deste fungo encontrados por este trabalho, pitangueira (Eugenia uniflora) e jabuticabeira (Myrciaria cauliflora). No caso de jabuticabeira e pitangueira, aparentemente G. mangiferae as coloniza como endofitico, pois nenhum sintoma de doenca foi associado a presenca do fungo na planta. Os resultados obtidos por este trabalho atraves da analise das regioes ITS1-5,8SITS2 indicam que isolados obtidos das diferentes especies de plantas pertencem a uma mesma especie, G. mangiferae.

A analise destas regioes tambem indica que isolados obtidos de folhas e frutos assintomaticos de goiabeira, bem como em frutos sintomaticos para podridao, apresentam similaridade suficiente nesta regiao para serem todos identificados como G. mangiferae. Desta forma, mesmo que isolados causadores de podridao em frutos de goiabeira sejam descritos na literatura como G. psidii (Tozello e Ribeiro, 1998)--e apesar de nao haver disponibilidade de sequencias classificadas como G. psidii no banco de dados ate 08-12-2008 para fins de comparacao -, os isolados obtidos de sintomas de podridao por este trabalho mostraram similaridade superior a 98%, e em alguns casos de 100%, com sequencias de G. mangiferae. A posicao de todos os isolados obtidos de goiabeira no dendrograma apresenta-se muito proxima a G. mangiferae e distante das outras especies de Guignardia utilizadas como referencia.

Assim, a exemplo de outras especies de fungos, e possivel que G. mangiferae comporte-se de forma endofitica para algumas plantas, como citros, e endofitica e patogenica em outras, como goiabeira. A maioria, senao todas as plantas estudadas apresentam fungos endofiticos, que, na maioria das vezes, sao beneficos para a planta, embora haja relatos de endofiticos que se tornaram patogenos sob determinadas condicoes (Kogel et al.,2006). Os mesmos autores inferem que, uma vez que a condicao doenca e considerada uma excecao nas interacoes planta-microrganismos, as mesmas podem ser consideradas como um estado desbalanceado de uma simbiose. Outros autores argumentam que, na interacao planta-endofiticos ha um grau de virulencia por parte do fungo, o que permite a infeccao e a colonizacao do hospedeiro, embora os mecanismos de defesa da planta limitem o desenvolvimento do invasor, e, por consequencia, nao permitem o aparecimento da doenca (Schultz e Boyle, 2005).

Outra possibilidade e que G. mangiferae e G. psidii sejam conspecificas. Trabalhando com especies nativas do Japao, Okane et al. (2001) notaram grande similaridade entre os isolados endofiticos obtidos, que identificaram como G. endophyllicola, e isolados de G. mangiferae, de tal forma que nao era possivel diferencia-los morfologica e molecularmente, e sugeriram que as duas especies eram conspecificas. A observacao das colonias do fungo obtido de folhas assintomaticas e dos frutos sintomaticos de goiabeira, neste trabalho, mostrou que nao e possivel diferencia-las visualmente, alem de apresentarem o mesmo tipo de resposta ao teste do meio aveia-agar, bem como sequencias de DNA altamente similares das regioes ITS1-5,8S-ITS2 utilizadas para a analise, o que reforca a hipotese da conspecificidade.

Uma vez que isolados obtidos de goiabeira, bem como de mangueira e dos outros hospedeiros deste estudo foram identificados como pertencentes a G. mangiferae, e provavel que esta mesma especie tenha muitos outros hospedeiros ainda nao identificados no Brasil. No Japao, isolados de Guignardia sp. foram obtidos de folhas saudaveis de 94 especies de plantas pertencentes a 69 diferentes generos (Okane et.al., 2003), o que leva a supor que o numero de hospedeiros de Guignardia no Brasil seja elevado. Baayen et al. (2002) descreveram G. mangiferae como um simbionte de grande sucesso por colonizar um grande numero de especies arboreas de grande distribuicao mundial.

A observacao de uma mesma especie de fungo colonizando diferentes hospedeiros, como e o caso de G. mangiferae, pode ser devida ao fato de que esta especie nao apresenta coevolucao com seu hospedeiro e que saltos evolucionarios para outros hospedeiros, muitas vezes nao relacionados, ocorrem frequentemente, ou ainda que os mesmos coevoluem com seu hospedeiro, mas que a extincao de especies e frequente (Rodrigues et al., 2004). Os mesmos autores ressaltam que a ocorrencia de G. mangiferae em diferentes especies de plantas deve ser devida a estes saltos evolucionarios. A uniformidade observada entre os grupos de isolados de G. mangiferae de diferentes hospedeiros tambem pode ser devida a presenca de fluxo genico entre as populacoes, uma vez que os diferentes hospedeiros sao frequentemente encontrados espacialmente proximos.

Em relacao aos isolados obtidos de mangueira e que nao encontraram homologia em banco de dados para serem identificados em nivel de especie, e possivel que estes dois grupos pertencam a outras especies, ainda nao descritas e/ ou identificadas no Brasil, e para as quais ainda nao existem sequencias ITS1-5,8S-ITS2 depositadas em banco de dados. Os isolados M/MM e MC apresentaram uma distancia genetica maior em relacao a G. mangiferae do que em relacao a G. citricarpa, embora a distancia genetica observada tenha demonstrado que os mesmos sao distintos em relacao a estas duas especies e tambem entre si, evidenciando a probabilidade de que sao especies distintas das utilizadas como padroes e que possuem sequencias depositadas em banco de dados. Assim, verifica-se que plantas de mangueira sao hospedeiras de G. mangiferae e tambem de duas outras especies de Guignardia sp., aqui neste trabalho identificadas como MM/M e MC, esta ultima encontrada somente em Jaboticabal-SP. Embora G. citricarpa tenha sido relatada como causadora de manchas foliares em manga na Florida (McMillan, 1986), e que os isolados MM/M tenham-se mostrado mais proximos desta especie do que de G. mangiferae, a resposta ao meio aveia-agar e a similaridade obtida com as regioes ITS1-5,8S-ITS2 foram muito baixas para identifica-las como sendo G. citricarpa, motivo pelo qual se acredita tratar-se de outra especie. Esta mesma possibilidade e creditada aos isolados identificados como MC.

A utilizacao de tecnicas moleculares na identificacao e caracterizacao de fungos e de grande interesse, principalmente em funcao da rapidez com que pode ser realizada se comparada com as tecnicas convencionais. Tecnicas de sequenciamento menos custosas e, por consequencia, mais acessiveis, e o continuo aprimoramento da bioinformatica, que possibilita analise de grandes quantidades de dados, tem contribuido consideravelmente para o crescimento exponencial na genomica de fungos (Robbertse et al., 2006; Xu, 2006), bem como tem impulsionado a area da sistematica de fungos, principalmente em relacao a mapeamento global de diversidade genetica (Robbertse et al., 2006). Embora um dos fatores limitantes para o incremento da filogenetica molecular de fungos seja o pequeno numero de genes facilmente acessiveis para tal--geralmente os genes ribossomais e suas regioes internas--e inegavel que a utilizacao dos mesmos propiciou grandes avancos para a area (Robbertse et al., 2006). Uma vez que um grande numero de fungos sao reconhecidos como causadores de problemas fitossanitarios, e considerando que da maioria destes se conhecem apenas caracteristicas morfologicas, a possibilidade de utilizacao de sequencias de DNA para sua classificacao e de grande importancia, e a continua alimentacao de bancos de dados com novas informacoes acerca de novas especies de fungos aumenta a precisao na identificacao de novos isolados (Bridge et al., 2005; Crouws, 2005). Neste trabalho, verificou-se que as sequencias de DNA depositadas em banco de dados foram eficientes para a identificacao dos isolados obtidos dos diferentes hospedeiros, sendo que se espera que as sequencias obtidas das regioes ITS15,8S-ITS2 destes novos isolados, uma vez depositadas em banco de dados, tambem auxiliem a identificar ou a refinar a classificacao dos ja existentes ou de novos isolados. Assim sendo, espera-se tambem que a continua alimentacao destes bancos por diferentes pesquisadores possa informar, num futuro proximo e com mais precisao, a quais especies pertencem os dois grupos de isolados encontrados em mangueira.

[FIGURA 1 OMITTED]

[FIGURA 2 OMITTED]

[FIGURA 3 OMITTED]

[FIGURA 4 OMITTED]

[FIGURA 5 OMITTED]

[FIGURA 6 OMITTED]

[FIGURA 7 OMITTED]

[FIGURA 8 OMITTED]

[FIGURA 9 OMITTED]

[FIGURA 10 OMITTED]

[FIGURA 11 OMITTED]

CONCLUSOES

1-Fungos da especie G. citricarpa foram encontrados unicamente em citros.

2-Fungos da especie G. mangiferae foram encontrados em diferentes hospedeiros.

3-Fungos causadores de podridao em frutos de goiabeira foram identificados como G. mangiferae de acordo com a analise das regioes ITS1-5,8S-ITS2.

4-Plantas de mangueira sao hospedeiras de duas formas de Guignardia ainda nao identificadas em nivel de especie, alem de G. mangiferae.

5-Plantas de pitangueira e jabuticabeira sao hospedeiras de G. mangiferae.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos a FAPESP (Fundo de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo) pelo financiamento deste trabalho atraves dos projetos 04/10560-4 (Pos-Doutoramento do primeiro autor), 06/51941-6 (Iniciacao Cientifica) e 01/10993-0 (Projeto Tematico), bem como ao CNPq e CAPES pela concessao de bolsas de Iniciacao Cientifica, Doutorado e Produtividade em Pesquisa.
ANEXO 1--Relacao dos isolados utilizados neste trabalho com os
respectivos numeros de acesso no GenBank.

Isolado // ID GenBank   Isolado // ID GenBank

G-10 // FJ769581        GP1_1 // FJ769619
G-11 // FJ769582        GP1_2 // FJ769620
G-12 // FJ769583        GP1_3 // FJ769621
G-13 // FJ769584        EU-1 // FJ769622
G-14 // FJ769585        EU-2 // FJ769623
G-15 // FJ769586        EU-3 // FJ769624
G-16 // FJ769587        EU-4 // FJ769625
G-17 // FJ769588        EU-5 // FJ769626
G-18 // FJ769589        EU-6 // FJ769627
G-19 // FJ769590        EU-7 // FJ769628
G-1 // FJ769591         EU-8 // FJ769629
G-20 // FJ769592        EU-9 // FJ769630
G-21 // FJ769593        EU-10 // FJ769631
G-22 // FJ769594        EU-11 // FJ769632
G-23 // FJ769595        EU-12 // FJ769633
G-24 // FJ769596        FLP-15 // FJ769634
G-26 // FJ769597        FLP-25 // FJ769635
G-2 // FJ769598         FLP-4 // FJ769636
G-3 // FJ769599         FLP-6 // FJ769637
G-4 // FJ769600         FLP-12 // FJ769638
G-5 // FJ769601         FLP-14 // FJ769639
G-6 // FJ769602         FLP-16 // FJ769640
G-7 // FJ769603         FLP-17 // FJ769641
G-8 // FJ769604         FLP-19 // FJ769642
G-9 // FJ769605         FLP-21 // FJ769643
GM-10 // FJ769606       FLP-23 // FJ769644
GM-1 // FJ769607        Jabot1 // FJ769645
GM-2 // FJ769608        Jabot2 // FJ769646
GM-3 // FJ769609        Jabot3 // FJ769647
GM-4 // FJ769610        Jabot5 // FJ769648
GM-5 // FJ769611        Jabot6 // FJ769649
GM-6 // FJ769612        LAC_1 // FJ769650
GM-7 // FJ769613        LAC_2 // FJ769651
GM-8 // FJ769614        LAC_3 // FJ769652
GM-9 // FJ769615        LAC_4 // FJ769653
GF-1 // FJ769616        LAC_5 // FJ769654
GF-2 // FJ769617        LAC_6 // FJ769655
GF-3 // FJ769618        LAC_7 // FJ769656

Isolado // ID GenBank   Isolado // ID GenBank

LAC_8 // FJ769657       LC-25 // FJ769695
LAC_9 // FJ769658       LC-26 // FJ769696
PC-10 // FJ769659       LC-27 // FJ769697
PC-11 // FJ769660       LC-29 // FJ769698
PC-12 // FJ769661       LC-2 // FJ769699
PC-13 // FJ769662       LC-31 // FJ769700
PC-14 // FJ769663       LC-3 // FJ769701
PC-15 // FJ769664       LC-4 // FJ769702
PC-16 // FJ769665       LC-7 // FJ769703
PC-17 // FJ769666       LC-8 // FJ769704
PC-18 // FJ769667       LC-9 // FJ769705
PC-19 // FJ769668       LC-14 // FJ769706
PC-1 // FJ769669        LC-19 // FJ769707
PC-20 // FJ769670       M-10 // FJ769708
PC-21 // FJ769671       M-11 // FJ769709
PC-24 // FJ769672       M-13 // FJ769710
PC-26 // FJ769673       M-14 // FJ769711
PC-27 // FJ769674       M-15 // FJ769712
PC-2 // FJ769675        M-1 // FJ769713
PC-3 // FJ769676        M-2 // FJ769714
PC-6 // FJ769677        M-3 // FJ769715
PC-9 // FJ769678        M-4 // FJ769716
PC-4 // FJ769679        M-5 // FJ769717
PC-5 // FJ769680        M-6 // FJ769718
PC-22 // FJ769681       M-7 // FJ769719
PC-7 // FJ769682        M-8 // FJ769720
LC-10 // FJ769683       M-9 // FJ769721
LC-11 // FJ769684       MC-1 // FJ769722
LC-12 // FJ769685       MC-2 // FJ769723
LC-13 // FJ769686       MC-3 // FJ769724
LC-15 //FJ769687        MC-4 // FJ769725
LC-16 // FJ769688       MC-6 // FJ769726
LC-17 // FJ769689       MC-7 // FJ769727
LC-18 // FJ769690       MM-10 // FJ769728
LC-1 // FJ769691        MM-11 // FJ769729
LC-20 // FJ769692       MM-12 // FJ769730
LC-22 // FJ769693       MM-13 // FJ769731
LC-23 // FJ769694       MM-14 // FJ769732

Isolado // ID GenBank

MM-15 // FJ769733
MM-16 // FJ769734
MM-17 // FJ769735
MM-19 // FJ769736
MM-1 // FJ769737
MM-20 // FJ769738
MM-21 // FJ769739
MM-22 // FJ769740
MM-23 // FJ769741
MM-2 // FJ769742
MM-3 // FJ769743
MM-4 // FJ769744
MM-5 // FJ769745
MM-6 // FJ769746
MM-7 // FJ769747
MM-8 // FJ769748
MM-9 // FJ769749
Pit1 // FJ769750
Pit3 // FJ769751
Pit4 // FJ769752
Pit6 // FJ769753
Pit7 // FJ769754
Pit8 // FJ769755
Pit9 // FJ769756
Pit10 // FJ769757
Pit10 // FJ769757
Pit12 // FJ769759
Pit13 // FJ769760
Pit14 // FJ769761
Pit15 // FJ769762
Pit16 // FJ769763
Pit18 // FJ769764
Pit19 // FJ769765
Pit20 // FJ769766
Pit21 // FJ769767
Pit22 // FJ769768
Pit23 // FJ769769
Pit24 // FJ769770


REFERENCIAS

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ESTER WICKERT (2), ANTONIO DE GOES (3), ELIANA GERTRUDES DE MACEDO LEMOS (4), ANDRESSA DE SOUZA (5), ERICO LEANDRO DA SILVEIRA (6), FERNANDA DIAS PEREIRA (5), DAVI RINALDO (5)

(1) (Trabalho 233-08). Recebido em: 09-09-2008. Aceito para publicacao em: 16-02-2009.Artigo extraido dos resultados obtidos pelo Projeto Fapesp 04/10560-4--Pos-doutoramento do primeiro autor.

(2) Pos-Doutoranda em Genetica e Melhoramento de Plantas. Epagri--C.P. 277- Itajai-SC. Bolsista Fapesp. esterwickert@epagri.sc.gov.br

(3) Prof. Titular do Depto. de Tecnologia FCAV/UNESP.Bolsista Produtividade em Pesquisa CNPq. egerle@fcav.unesp.br

(4) Prof. Adjunto do Depto. de Tecnologia FCAV/UNESP.Bolsista Produtividade em Pesquisa CNPq. agoes@fcav.unesp.br

(5) Graduandos do curso de Agronomia da FCAV/UNESP--Jaboticabal-SP. Depto. de Fitossanidade. Bolsistas CNPq/PIBIC e FAPESP. andressa_unesp@yahoo.com, fekimera@hotmail.com, davi.rinaldo@yahoo.com.

(6) Doutorando em Microbiologia Agropecuaria. Depto. de Tecnologia FCAV/UNESP. Bolsista CAPES. ericosilveira@gmail.com
TABELA 1--Hospedeiros, regiao geografica e tecido de origem dos
isolados, sigla de acordo com o hospedeiro e numero de isolados
obtidos em cada amostragem.

Hospedeiro          Local de origem   Tecido

Laranja-Pera        Conchal-SP        Fruto sintomatico
Laranja-Pera        Conchal-SP        Folhas assintomaticas
Laranja-Azeda       Conchal-SP        Folhas assintomaticas
Lima-acida Tahiti   Conchal-SP        Folhas assintomaticas
Mangueira           Jaboticabal-SP    Folhas assintomaticas
Mangueira           Conchal-SP        Folhas assintomaticas
Goiabeira           Jaboticabal-SP    Folhas assintomaticas
Goiabeira           Monte Alto-SP     Folhas assintomaticas
Goiabeira           Monte Alto-SP     Fruto assintomatico
Goiabeira           Monte Alto-SP     Fruto sintomatico
Eucalipto           Jaboticabal-SP    Folhas assintomaticas
Pitangueira         Jaboticabal-SP    Folhas assintomaticas
Jabuticabeira       Jaboticabal-SP    Folhas assintomaticas

Hospedeiro          Sigla             No. isolados

Laranja-Pera        PC                24
Laranja-Pera        FLP               11
Laranja-Azeda       LAC               9
Lima-acida Tahiti   LC                26
Mangueira           M e MC            20
Mangueira           MM                22
Goiabeira           G                 25
Goiabeira           GM                10
Goiabeira           GF                3
Goiabeira           GP                3
Eucalipto           Eu                12
Pitangueira         Pit               24
Jabuticabeira       Jabot             5

                    Numero total      197
                    de isolados

TABELA 2--Numero de isolados por grupo de acordo com hospedeiro e
resposta ao teste do meio aveiaagar, e distancia genetica apresentada
pelos isolados de um mesmo grupo.

         No.        Resposta ao meio     Distancia
Grupos   isolados   aveia-agar           intragrupo   ITS1-5,8S-ITS2

PC       24         Com halo amarelo     0.0116       G. citricarpa

FLP-E    3          Sem halo             0.0103       G. mangiferae
FLP-P    8          Com halo amarelo     0.0006       G. citricarpa

LAC-E    3          Sem halo             0.0243       G. mangiferae
LAC-P    6          Com halo amarelo     0.0054       G. citricarpa

LC-E     23         Sem halo             0.0615       G. mangiferae
LC-P     3          Com halo amarelo     0.0129       G. citricarpa

M        13         Com halo             0.0211       Guignardia sp
                      branco-amarelado
MM       20         Com halo             0.0108       Guignardia sp
                      branco-amarelado
MM/M-E   3          Sem halo             0.0225       G. mangiferae
MC       6          Com halo             0.0146       Guignardia sp
                      branco-amarelado

G        25         Sem halo             0.0084       G. mangiferae
GM       10         Sem halo             0.0077       G. mangiferae
GF       3          Sem halo             0.0017       G. mangiferae
GP       3          Sem halo             0.0034       G. mangiferae

Eu       12         Sem halo             0.0007       G. mangiferae

Pit      24         Sem halo             0.0419       G. mangiferae

Jabot    5          Sem halo             0.0364       G. mangiferae

E: nao patogenico de acordo com comportamento em meio aveia-agar.
P: patogenico de acordo com comportamento em meio aveia-agar.

TABELA 3--Distancia genetica apresentada pelos isolados de Guignardia
dos diferentes grupos.

Grupos       PC (A)      FLP-E (B)    FLP-P (A)   LAC-E (B)

PC (A)       --
FLP-E (B)    0.1077      --
FLP-P (A)    0.0094      0.1000       --
LAC-E (B)    0.1106      0.0173       0.1039      --
LAC-P (A)    0.0137      0.1115       0.0106      0.1154
LC-E (B)     0.1099      0.0169       0.1037      0.0185
LC-P (A)     0.0387      0.1135       0.0335      0.1194
M (C)        0.0567      0.1191       0.0498      0.1227
MM (C)       0.0524      0.1153       0.0462      0.1190
M/MM-E (B)   0.1068      0.0178       0.1009      0.0211
MC (C)       0.1017      0.1308       0.0959      0.1372
G (B)        0.1064      0.0118       0.0990      0.0154
GM (B)       0.1063      0.0128       0.0985      0.0151
GF (B)       0.1033      0.0112       0.0952      0.0130
GP (B)       0.1061      0.0120       0.0979      0.0139
EU (B)       0.1100      0.0056       0.1024      0.0203
Pit (B)      0.1253      0.0330       0.1187      0.0341
Jabot (B)    0.1220      0.0301       0.1157      0.0304

Grupos       LAC-P (A)   LC-E (B)     LC-P (A)    M (C)

PC (A)
FLP-E (B)
FLP-P (A)
LAC-E (B)
LAC-P (A)    --
LC-E (B)     0.1131      --
LC-P (A)     0.0410      0.1168       --
M (C)        0.0565      0.1224       0.0700      --
MM (C)       0.0524      0.1181       0.0652      0.0165
M/MM-E (B)   0.1108      0.0170       0.1151      0.1195
MC (C)       0.1058      0.1385       0.1112      0.1213
G (B)        0.1097      0.0112       0.1132      0.1190
GM (B)       0.1097      0.0108       0.1134      0.1192
GF (B)       0.1065      0.0081       0.1105      0.1162
GP (B)       0.1095      0.0089       0.1132      0.1190
EU (B)       0.1139      0.0220       0.1149      0.1204
Pit (B)      0.1296      0.0289       0.1331      0.1382
Jabot (B)    0.1276      0.0257       0.1303      0.1355

Grupos       MM (C)      M/MM-E (B)   MC (C)      G (B)

PC (A)
FLP-E (B)
FLP-P (A)
LAC-E (B)
LAC-P (A)
LC-E (B)
LC-P (A)
M (C)
MM (C)       --
M/MM-E (B)   0.1152      --
MC (C)       0.1177      0.1382       --
G (B)        0.1334      0.0149       0.1334      --
GM (B)       0.1346      0.0146       0.1346      0.0080
GF (B)       0.1330      0.0123       0.1330      0.0054
GP (B)       0.1338      0.0138       0.1338      0.0061
EU (B)       0.1167      0.1204       0.1306      0.0159
Pit (B)      0.1350      0.0333       0.1533      0.0267
Jabot (B)    0.1325      0.0301       0.1489      0.0238

Grupos       GM (B)      GF (B)       GP (B)      Eu (B)

PC (A)
FLP-E (B)
FLP-P (A)
LAC-E (B)
LAC-P (A)
LC-E (B)
LC-P (A)
M (C)
MM (C)
M/MM-E (B)
MC (C)
G (B)
GM (B)       --
GF (B)       0.0047      --
GP (B)       0.0056      0.0025       --
EU (B)       0.0177      0.0168       0.0176      --
Pit (B)      0.0262      0.0229       0.0239      0.0388
Jabot (B)    0.0234      0.0200       0.0207      0.0359

Grupos       Pit (B)     Jabot (B)

PC (A)
FLP-E (B)
FLP-P (A)
LAC-E (B)
LAC-P (A)
LC-E (B)
LC-P (A)
M (C)
MM (C)
M/MM-E (B)
MC (C)
G (B)
GM (B)
GF (B)
GP (B)
EU (B)
Pit (B)      --
Jabot (B)    0.0378      --

(E): nao patogenico de acordo com comportamento em meio aveia-agar.

(P): patogenico de acordo com comportamento em meio aveia-agar.

(A): identificado como G. citricarpa atraves das regioes
ITS1-5.8S-ITS2.

(B): identificado como G. mangiferae atraves das regioes
ITS1-5.8S-ITS2.

(C): sem identificacao de especie atraves das regioes ITS1-5.8S-ITS2
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Author:Wickert, Ester; de Goes, Antonio; Gertrudes de Macedo Lemos, Eliana; de Souza, Andressa; da Silveira
Publication:Revista Brasileira de Fruticultura
Date:Jun 1, 2009
Words:6877
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