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Regeneracion via embriogenesis somatica de una variedad colombiana elite de Theobroma cacao L.

Regeneration through somatic embryogenesis of an elite colombian Theobroma cacao L. variety

Introduccion

Theobroma cacao es un arbol perteneciente a la familia Malvaceae que crece en zonas tropicales humedas y es considerado un importante cultivo a nivel mundial como materia prima para la fabricacion del chocolate, el cual se produce a partir de las semillas (Despreaux, 2001). Su importancia economica es evidente en las 3.61 millones de toneladas producidas a nivel mundial. La produccion para Colombia en el periodo 09/10 fue de 41 mil toneladas, lo que genero para el pais un estimado de 38 mil empleos a familias campesinas de bajos recursos (FEDECACAO, 2011; ICCO, 2010).

En Colombia las variedades se obtienen basicamente por metodos tradicionales de cruces injertados entre diferentes clones, proceso que puede tomar mas de 13 anos para desarrollar una variedad premium. Los arboles de cacao elite presentan un alto grado de segregacion cuando son multiplicados por semilla, debido a esto se han empleado diferentes sistemas de propagacion clonal, tales como injertacion y produccion de estacas enraizadas (UNCTAD, 2008; Chavez y Mansilla, 2004). Dichos sistemas tienen un grado de efectividad variable al ser dependientes de las condiciones ambientales, de la cohesion entre la planta madre y el donador y de las enfermedades que aparecen durante el prendimiento.

Por consiguiente, se han evaluado otros metodos de propagacion mediante la tecnica de cultivo de tejidos. La regeneracion de plantas de cacao mediante embriogenesis somatica se ha establecido exitosamente a partir de explantes florales (Solano, 2008; Monsalve et al., 2005; Chanatasig, 2004), no obstante etapas como la aclimatizacion y evaluacion en campo solo se han reportado con variedades provenientes del Oeste de la India (Maximova et al., 2008).

Inicialmente los trabajos en embriogenesis somatica de cacao se enfocaron en la produccion de embriones somaticos a partir de tejidos zigoticos sin lograr su desarrollo hasta planta (Janick et al., 1980). La limitacion a la hora de trabajar con tejidos zigoticos es que al ser resultado de polinizacion cruzada, el material clonal no replica el genotipo del arbol, perdiendose asi la ganancia genetica.

Posteriormente los esfuerzos se dirigieron al desarrollo de sistemas de cultivo de tejidos somaticos incluyendo hojas, con las que se presento baja frecuencia de embriogenesis somatica usando sales MS (Murashige y Skoog, 1962) y altos contenidos de auxina (Litz, 1986); con tejido nucelar se obtuvieron embriones somaticos, pero estos no maduraron (Janick, 1993; Sondahl, 1991; Esan, 1977), y utilizando explantes florales como petalos y estaminodios se ha obtenido hasta un 90% de produccion de embriones somaticos y 20% de germinacion (Alemmano et al., 1997; Lopez-Baez et al., 1993; Sondahl, 1991 y Sondahl et al. 1989). Aunque dichos sistemas fueron satisfactorios en produccion de embriones somaticos, todavia eran de utilidad limitada, siendo aplicables solo a algunos genotipos y con muy bajas tasas de conversion a plantula.

Experimentos posteriores reconocieron la importancia de los reguladores de crecimiento como el Acido Abscisico (ABA) y el Acido Naftalenacetico (ANA) en embriogenesis somatica de cacao (Janick et al., 1980). Por otro lado, Guiltinan et al. (2003) desarrollaron un metodo eficiente de propagacion usando TDZ (Thidiazuron) y las sales basales DKW (Driver y Kuniyuki, 1984), con lo que se logro establecer un protocolo para embriogenesis somatica secundaria (ESS) a partir de embriones somaticos primarios, los cuales fueron convertidos a plantulas obteniendose entre un 3.3 y 27.1% de germinacion, para posteriormente establecerlas bajo condiciones de invernadero. Estos resultados constituyen una de las principales bases de la embriogenesis somatica para cacao en el mundo.

Actualmente la cadena productiva colombiana de cacao enfrenta varios problemas, principalmente en el sector primario. Por un lado las condiciones ambientales fluctuantes, entre ellas los altos niveles de pluviosidad, dificultan el establecimiento de los injertos comerciales al favorecer la pudricion y, por otro, el caracter permanente de la produccion del cacao que conlleva a la falta de renovacion de los cultivos y el consecuente envejecimiento de los mismos (los cuales pueden alcanzar hasta 20 anos), generan bajas productividades; ademas las plantaciones viejas se hacen susceptibles a enfermedades como la moniliasis (Moniliophthora roreri) y escoba de bruja (Moniliophthora perniciosa), las cuales causan entre el 10 y el 95% de las perdidas del cultivo (Observatorio de Agrocadenas, 2008). Lo anterior se manifiesta a escala comercial, la cual hoy acude para la importacion del grano y asi responder a la demanda interna. Estas importaciones incrementan el costo del producto terminado, el cual se refleja en el precio para el consumidor (FEDECACAO 2011).

En este sentido, establecer una rapida produccion masiva de clones elite que elimine la dependencia climatica y el efecto de las plagas y enfermedades seria una alternativa efectiva para responder a las necesidades del mercado colombiano. De acuerdo con el estudio realizado por Solano (2008), los protocolos de propagacion de cacao en general evidencian un fuerte efecto genotipico. Por tal motivo, se hace necesario establecer un protocolo de propagacion para cada variedad de cacao. El objetivo de esta investigacion fue evaluar protocolos de propagacion clonal via embriogenesis somatica en dos variedades elite de cacao por su alta concentracion de polifenoles, tamano de grano y alta productividad.

Materiales y metodos

Material vegetal y desinfeccion

Botones florales de dos variedades de Theobroma cacao, BIOB (desarrollada en Colombia) e ICS95 (variedad introducida), fueron suministrados por la Compania Nacional de Chocolates (CNCH), San Vicente de Chucuri, departamento de Santander.

Los ensayos preliminares de desinfeccion se basaron en el protocolo descrito por Guiltinan et al. (2003). Dado el alto porcentaje de contaminacion bacteriana obtenido, se decidio evaluar diferentes antibioticos y tiempos de exposicion. Los antiobiogramas permitieron determinar la estreptomicina a 250 ppm como la concentracion mas adecuada para el control bacteriano. El protocolo consistio en sumergir los botones florales en una solucion de hipoclorito de sodio (NaCIO) al 1% durante 30 minutos en constante agitacion, luego se realizaron tres lavados con agua destilada esteril, se sumergieron en una solucion de estreptomicina 250 ppm por 30 minutos y, finalmente, se enjuagaron de nuevo antes de la siembra.

Medios de cultivo

Se seleccionaron dos protocolos de propagacion por embriogenesis somatica evaluados exitosamente en otras variedades de cacao. Los protocolos fueron el desarrollado por Guiltinan et al. (2003) en Penn State University y el descrito por Fontanel et al. (2002) del Centro de Investigacion de Nestle en Tours, Francia. Las sales basales de los protocolos consistieron en DKW, MS y McCown's (Lloyd and McCown, 1981). Las fases de estos protocolos fueron: Induccion, Formacion, Maduracion y Mantenimiento. La denominacion de los medios, de acuerdo con los autores, se presenta en la tabla 1.

Se utilizo tambien el medio de Fontanel et al. (2002) CM2 para evaluar la embriogenesis somatica secundaria. Todos los medios fueron esterilizados en autoclave a 121[grados]C y 120 libras de presion durante 20 minutos. El manejo del material vegetal se llevo a cabo en camara de flujo laminar horizontal.

Induccion y formacion de embriones somaticos

Para la etapa de induccion se extrajeron las bases de petalo y los estaminodios de cada boton floral y se sembraron en cajas de Petri de 60X15 mm, conteniendo 20 ml de medio de cultivo PCG o INDI. Los cultivos se mantuvieron en oscuridad por 30 dias a temperatura de 25[grados]C [+ o -] 2[grados]C. Se sembraron 10 explantes por caja y se establecieron 4 cajas por cada repeticion. Se realizaron 3 repeticiones por tipo de explante para un total de 240 explantes.

Despues de este tiempo de cultivo los explantes siguieron la secuencia de subcultivos descrita en la figura 1 (segun el protocolo establecido inicialmente), hasta la formacion de los embriones somaticos. Las condiciones de cultivo se mantuvieron constantes. Las variables respuesta, porcentaje de callo y porcentaje de callo embriogenico fueron registradas despues de la siembra a las 4 y 8 semanas respectivamente.

Maduracion

Los embriones somaticos expresados en el medio INDexp del protocolo de Fontanel et al. (2002), que alcanzaron el estado cotiledonar, se aislaron y se subcultivaron en el medio de maduracion MM6 del mismo protocolo. Se mantuvieron bajo un fotoperiodo de 12 horas luz /12 de oscuridad, intensidad luminica de 32mmol/[m.sup.2]s y temperatura de 25[grados]C [+ o -] 2[grados]C. El porcentaje de plantas enraizadas, la altura (cm) y el numero de hojas por planta fueron registrados 45 dias despues del subcultivo en MM6.

Despues de 4-6 semanas, las plantulas se subcultivaron en el medio de mantenimiento del mismo protocolo. Pasados 30 dias la mayoria de las plantulas se tornaron cloroticas, por lo que se reemplazo el medio de mantenimiento de Fontanel et al. (2002) por el medio de mantenimiento RD modificado del protocolo de Guiltinan et al. (2003), considerando que este contiene calcio, sulfuro y magnesio en una mayor concentracion, y que dichos elementos son clave para un adecuado desarrollo de las hojas (Azcon y Talon, 2008).

[FIGURA 1 OMITIR]

Enraizamiento adventicio

En esta etapa se procedio a inducir raices adventicias en las plantulas procedentes del medio RD debido a que la mayoria solo habia desarrollado la raiz principal, aspecto que dificultaba el establecimiento ex vitro. De acuerdo con los trabajos realizados por Pruski et al. (2005) y Traore et al. (2003) se seleccionaron dos pulsos de IBA como los mas adecuados para el desarrollo de raices, 0.5mg/L y 0.5g/L cada uno aplicado durante 1 minuto. Se tuvo en cuenta un control en el que no se aplico pulso de IBA. Un total de 67 plantas fueron usadas para este experimento. La metodologia consistio en sumergir la parte radical de cada una de las plantas en la solucion enraizadora por un minuto y, posteriormente, se sembraron en medio basal DKW libre de reguladores. Las condiciones de cultivo fueron las mismas de la etapa de maduracion. El porcentaje de plantas enraizadas y el numero de raices por planta se registraron 45 dias despues de la aplicacion del pulso.

Embriogenesis somatica secundaria (ESS)

Embriones somaticos en estado globular y cotiledonar de un tamano promedio de 1-4 mm (dependiendo del estado de desarrollo) se cortaron transversalmente y se sembraron en cajas de Petri (60x15mm) con 10 ml del medio de multiplicacion CM2. Los cultivos permanecieron en oscuridad a una temperatura de 25[grados]C [+ o -] 2[grados]C. El porcentaje de explantes formando embriones somaticos secundarios fue registrado 45 dias despues del cultivo en el medio CM2. Los embriones secundarios obtenidos se aislaron del callo madre y se subcultivaron en el medio MM6 para su conversion a plantula.

Analisis histologico

Con el objetivo de corroborar el caracter embriogenico de los callos y desarrollo normal de los embriones somaticos, se realizo un analisis histologico empleando explantes en diferentes estados de desarrollo. Estos fueron procesados siguiendo el protocolo de Maximova et al. (2002), modificado como se describe a continuacion: Los embriones fueron fijados en paraformaldehido 2%, glutaraldehido 1% y cafeina 1% (w/v), deshidratados con series de alcohol 70% 60 minutos, 95% 15 minutos, 95% 30 minutos y 100% 15 minutos, seguidos por imbibicion en parafina PARAPLAST (Ref 501006). El material embebido fue fraccionado en un microtomo rotatorio (LEICA Model RM 2125) en secciones de 4 |jm de grosor. Las secciones se colorearon siguiendo la tecnica de tincion Safranina-Fast Green. El registro fotografico se realizo en un microscopio de luz Carl Zeiss Primo Star.

Analisis estadistico

Los resultados fueron analizados con el paquete estadistico SAS 9.1. Para los resultados de respuesta callogenica y enraizamiento se realizaron analisis categoricos. Para los datos obtenidos en la embriogenesis primaria y secundaria y maduracion se realizo un analisis factorial. En las variables se determino la media general con un nivel de confianza P [inferieur ou egal a] 0.05.

Resultados

Desinfeccion

El protocolo de asepsia optimizado permitio obtener resultados promedios de desinfeccion del 85% para el clon ICS95 y del 96% para el clon BIOB, porcentajes considerados altos para genotipos cuya procedencia fue de campo, donde se reconoce que la carga microbiana es mayor que para plantas provenientes de invernadero.

Induccion y formacion de embriones somaticos

Los explantes cultivados en los medios PCG e INDI incrementaron dos veces su tamano original y posteriormente sobre su superficie se formo un callo compacto blanco granular. En ambos medios y variedades, la formacion de callo fue mayor al 90% despues de un mes de cultivo (figura 2a). Los embriones somaticos en estado globular fueron evidentes 15 dias despues del subcultivo en los medios SCG e INDExp, principalmente en las bases de petalo para el clon ICS95 y exclusivamente en los estaminodios para el clon BIOB. Sin embargo solo los embriones del clon BIOB alcanzaron la etapa cotiledonar. Los embriones del clon ICS95 se formaron en la superficie del callo blanco compacto (Figura 2b), en tanto que embriones independientes o agrupados (clusters) del clon BIOB se formaron a partir de un callo granular cafe de textura friable (Figura 2c y 2d). Para el clon BIOB, el numero de embriones independientes por explante y el de clusters formados por explante, arrojaron una media de 3 y 15 respectivamente, obteniendose la maxima produccion dos meses despues del subcultivo (tabla 2).

Maduracion

Los embriones somaticos del clon BIOB, 45 dias despues de ser transferidos al medio MM6, alcanzaron una altura no superior a un centimetro, un numero de hojas inferior a 2 y solo iniciaron la formacion de la raiz principal. Cuando las plantas se subcultivaron en el medio de mantenimiento, el enraizamiento, altura y numero de hojas no mejoraron, por el contrario las plantas perdieron vigor y algunas se tornaron necroticas, lo cual fue indicativo de una baja respuesta respecto a lo reportado para el protocolo en otras variedades.

Teniendo en cuenta que el tiempo de respuesta contemplado en este protocolo puede ser corto para los procesos de desarrollo en plantas lenosas como el cacao, se evaluo la transferencia a medio fresco MM6 cada 30 dias durante dos meses adicionales. La permanencia por mas de 45 dias en este medio favorecio el vigor de las plantulas reflejado en la altura (1.44 + 0.94 cm), numero de hojas (2.40 [+ o -] 1.41) y porcentaje de plantas enraizadas (91.23%) (figura 3a). Las plantas de 3-4 cm de altura se adaptaron a condiciones ex vitro sin necesidad de un subcultivo previo en el medio de mantenimiento como lo describe el protocolo original de Fontanel et al. (2002). El porcentaje de conversion a plantula fue del 68,42 y el de establecimiento ex vitro fue del 66% (figura 3b).

Para el clon ICS95, teniendo en cuenta que los embriones formados en el medio INDExp solo alcanzaron la etapa globular, se procedio a evaluar de acuerdo con la literatura disponible el Acido Abscisico (ABA) y diferentes concentraciones de sacarosa, con miras a mejorar el proceso de maduracion de estos embriones (Alemanno et al., 1997, Fang et al., 2004). Los resultados de estos ensayos no mostraron un mejoramiento del proceso de maduracion y desarrollo de los embriones somaticos, los cuales, por el contrario, formaron un callo blanco granular en su superficie (dato no mostrado).

Enraizamiento adventicio

Dado que las plantas del clon BIOB en el medio de mantenimiento perdian vigor y desarrollaban un sistema radicular pobre (maximo dos raices por planta), se realizo un ensayo paralelo al planteado para maduracion (periodo prolongado en el medio MM6), con el fin de mejorar el enraizamiento in vitro de estas plantulas.

En el pulso de 0.5g/L de IBA se obtuvo un 13% de plantas enraizadas y un mayor numero de raices (413), y para el pulso de 0.5mg/L se obtuvo un mayor numero de plantas enraizadas (33%), pero con menor numero de raices (maximo 2 por planta). En ambos casos, las raices eran delgadas y se originaron de nuevo en la parte basal del vastago. El analisis estadistico no mostro diferencias significativas en la formacion de raices (P = 0.3152) para ambos pulsos, no obstante en la aplicacion del pulso de 0.5mg/L la formacion de callo fue menor en la parte radical, contrario a lo que se obtuvo con el pulso de 0.5g/L.

[FIGURA 2 OMITIR]

Embriogenesis somatica secundaria (ESS)

El porcentaje promedio de embriones somaticos secundarios, obtenido para el total de explantes, arrojo un valor alrededor del 23% (tabla 3). No se presento diferencia significativa en la respuesta a partir de los dos tipos de explantes utilizados. Estos embriones se originaron directamente del explante o de un escaso callo granular de color cafe-claro previamente formado (figura 4).

[FIGURA 3 OMITIR]

[FIGURA 4 OMITIR]

Analisis histologico

En los cortes histologicos realizados a los callos embriogenicos y embriones cotiledonares, se pudo observar la independencia del tejido madre de los embriones formados, estos ademas presentaron un estado bipolar en el que se pudo apreciar el eje apical y el radical (figura 5a). En los embriones se visualizo una capa de celulas bien definida que formaba la epidermis, seguida de celulas parenquimaticas que rodeaban la zona procambial y los haces vasculares. En algunos cortes fue posible observar la presencia de una protuberancia tipo suspensor en el polo radical de los embriones (figura 5b), mientras en otros cortes fue evidente el desarrollo de embriones malformados (unidos a traves de un solo sistema vascular, figura 5c).

[FIGURA 5 OMITIR]

Discusion

Induccion y expresion de embriones somaticos

La respuesta de explantes florales a la callogenesis en la induccion de embriogenesis somatica en cacao se ha estudiado anteriormente, obteniendose diversos resultados de acuerdo con la metodologia aplicada (Lopez- Baez et al., 2000; Li et al., 1998; Pence, 1995; Sondahl et al., 1993). Varios autores afirman que las diferencias en la respuesta callogenica y embriogenica en cacao dependen del genotipo, condiciones de cultivo y tipo de explante (Monsalve et al. 2005; Chanatasig, 2004; Tan y Furtek, 2003; Maximova et al. 2002), lo cual ha sido corroborado tambien en otras especies (Fisichella et al. 2000; Etienne et al. 1999; Han y Park, 1999; Sreenath et al. 1995).

La respuesta obtenida en los dos genotipos evaluados con relacion al porcentaje de callo fue aproximadamente del 90% y estuvo dentro del rango obtenido por Solano (2008), quien evaluo 4 variedades de cacao entre ellas ICS95, con resultados entre 55 al 96% de respuesta callogenica para un mismo medio de cultivo.

El porcentaje de callo embriogenico fue del 30 y 50% para el clon BIOB e ICS95 respectivamente. Este ultimo clon ha sido reportado anteriormente con resultados entre 0.83 y 1.31%, y una produccion de 0.01 embriones somaticos por cada 100 explantes (Solano, 2008). Una posible explicacion a la diferencia de porcentajes obtenidos con respecto al trabajo de Solano (2008) puede deberse no solo a la variabilidad propia de cada clon, sino tambien al portainjerto que segun dicho autor, influye en la capacidad embriogenica de las variedades. Por otro lado, Li et al. (1998) establecio un numero promedio de embriones somaticos por explante entre 4 y 42, trabajando con los genotipos ICS1, ICS19, ICS39 e ICS67, variedades relacionadas con el clon ICS95. Los resultados revisados confirman que existe una fuerte dependencia del genotipo no solo para la respuesta embriogenica, sino tambien para la cantidad de embriones promedio obtenidos por cada explante.

Los reguladores de crecimiento son determinantes en la respuesta embriogenica ya que estos interactuan con los niveles hormonales endogenos y, en algunos casos, las respuestas estan dadas por la accion conjunta de dos o mas reguladores (Anami et al., 2010; Taiz y Zeiger, 2002). Los protocolos evaluados en las dos variedades, que consideraban combinaciones de auxinas y citoquininas en los medios de induccion, permitieron obtener una respuesta diferencial, resultando efectivo el protocolo de Guiltinan et al. (2003) en la induccion de embriones para el clon ICS 95 con el explante base de petalo y el protocolo de Fontanel et al. (2002) para el clon BIOB con el explante estaminodio.

El tipo de explante se ha considerado como otro factor en la respuesta diferencial a la embriogenesis somatica en cacao (Rivera, 2003). El efecto del tipo de explante en la formacion de embriones somaticos de cacao fue descrito por Monsalve et al. (2005), estos autores afirman que las diferencias obtenidas en la formacion de callo en los explantes se deben, posiblemente, a la naturaleza de las celulas que lo conforman. En el cojin floral, los estaminodios se encuentran fundidos en la base, en contacto con la zona meristematica, en comparacion con los petalos que estan mas externos en la estructura floral. De otro lado, durante la siembra la mayor parte de la superficie del estaminodio queda en contacto con el medio de cultivo, no siendo asi para las bases de petalo, ya que poseen una curva en forma de cuello de cisne. La estructura del estaminodio favorece una division mitotica temprana y la diferenciacion de las celulas somaticas.

La formacion de los embriones somaticos en el clon BIOB se origino de un callo cafe granular, de consistencia friable, diferente del obtenido con el clon ICS95, el cual fue blanco y granular, y donde los embriones somaticos permanecieron en estado globular. Respecto a este evento, Quiroz et al. (2001) mencionan que compuestos fenolicos presentes en el callo pueden actuar como inductores o inhibidores de la embriogenesis somatica. Por su parte Omokolo et al. (1997) respaldan esta afirmacion al indicar que los fenoles como antioxidantes podrian representar un mejor sustrato para las enzimas oxidativas, cuya accion permite la liberacion de las auxinas para promover la diferenciacion embriogenica. Estas observaciones hacen pensar que en cacao los compuestos fenolicos actuan como inductores indirectos de la embriogenesis somatica; no obstante falta mayor investigacion al respecto.

Etapa de maduracion, mantenimiento y enraizamiento adventicio

Durante la etapa de maduracion se da la acumulacion de sustancias necesarias para la germinacion del embrion. Entre los factores que pueden afectar la maduracion de un embrion, se encuentran: las sales minerales, la fuente de carbono, el agente gelificante, suplementos hormonales como el ABA, la adicion de carbon activado, entre otros (Peran-Quesada et al., 2004).

Las plantas que permanecieron en el medio de maduracion por un tiempo mas prolongado (12 semanas) presentaron un mayor vigor, altura y numero de raices en comparacion con las plantulas que permanecieron en el medio de maduracion por 6 semanas y que luego fueron subcultivadas en el medio de mantenimiento. Una de las posibles explicaciones a esta respuesta puede ser que las plantulas que permanecieron por mas tiempo recibieron un efecto prolongado tanto de la combinacion de los reguladores de crecimiento (ANA y GA3 [Acido Giberelico]) como del carbon activado. El efecto promotor del carbon activado en la morfogenesis puede deberse, principalmente, a la adsorcion irreversible de compuestos inhibitorios en el medio de cultivo que disminuye la acumulacion de metabolitos toxicos y exudacion fenolica (Thomas, 2008). Agarwal et al. (2004) explica que estos metabolitos inhiben estados de desarrollo especificos de los embriones somaticos y que al ser adsorbidos por el carbon activado pueden mejorar la maduracion.

El carbon activado, ademas de adsorber sustancias inhibitorias, reduce la intensidad luminica en la base de los vastagos, generando un ambiente adecuado para la acumulacion de auxinas y/o cofactores (Thomas, 2008). Por otro lado, Von Arnold et al. (2002) afirman que generalmente un mes de tratamiento se considera adecuado, no obstante tiempos prolongados de exposicion en el medio con carbon activado pueden incrementar el numero de embriones maduros formados.

Varios autores han reportado el efecto positivo del carbon activado en la maduracion de embriones somaticos, mejorando el crecimiento en altura y sistema radicular (Steinmacher et al., 2007; Groll et al., 2002; Zhang et al., 2000; Linington, 1991). No obstante, existen casos en los que el uso del carbon activado va en detrimento del desarrollo y la maduracion embriogenica, tal es el caso de Myrciaria aureana y Phoenix canariensis (Thomas, 2008). Estas respuestas negativas podrian deberse a que el carbon activado en su papel adsorbente puede tambien retener sustancias importantes para la maduracion. Este podria ser el caso para el clon ICS95, aunque varios reportes apuntan mas bien a definir su genotipo como recalcitrante a la embriogenesis somatica (Solano, 2008; Traore et al., 2003).

Con referencia a los ensayos realizados para mejorar el enraizamiento adventicio (tiempo prolongado en el medio de maduracion y pulsos con IBA), un mayor tiempo en el medio de maduracion resulto favorable tambien para el desarrollo radicular. El carbon activado solo o en combinacion con auxinas ha sido reportado como beneficioso para el enraizamiento en varias especies. Esto es congruente con lo obtenido en este trabajo, debido a que se alcanzo en el medio que contenia ANA, GA3 y carbon activado, un mejor desarrollo radicular comparado a cuando se aplicaron pulsos de IBA.

Los resultados con los pulsos de IBA terminaron en un pobre desarrollo radicular en cuanto al tiempo de exposicion. Esto es coherente con los resultados obtenidos por Traore et al. (2003), quienes evaluando diferentes periodos de induccion de enraizamiento en variedades de cacao, encontraron que periodos cortos (24 o 48 h) produjeron plantulas con una o dos raices, en tanto que un mayor tiempo (16 dias) producia un mayor numero de raices por planta, pero con frecuencia acompanado de la aparicion de callo en el polo radical, lo que dificultaba el posterior desarrollo de las plantulas.

Embriogenesis somatica secundaria

La ESS es el proceso regenerativo por el cual se desarrollan embriones somaticos a partir de embriones somaticos primarios (Da-Silva et al. 2005). En este ensayo se evaluaron como explantes dos estados de desarrollo de los embriones primarios, embriones tipo globular y embriones tipo cotiledonar. Aunque diferentes autores han reportado mejores resultados con explantes cotiledonares (Hernandez et al. 2003; Muralidharan y Mascarenhas, 1995; Pinto et al. 2008; Shi et al. 2010), en este trabajo no se encontraron diferencias significativas en la induccion de embriones secundarios.

Es conocido el uso de auxinas en la induccion de ESS, ya que estos reguladores de crecimiento vegetal parecen ser cruciales no solo en las fases de induccion de la embriogenesis somatica primaria, sino tambien en la induccion y mantenimiento de la ESS (Pinto et al., 2008). Durante la ESS se formaron embriones, unos directamente sobre la superficie del explante y otros sobre un escaso callo granular cafe claro, similar al callo embriogenico formado en la embriogenesis primaria. Se encontro una relacion entre la formacion del tejido calloso y la aparicion de cluster de embriones secundarios.

En este trabajo se obtuvo un 23% de ESS en el medio suplementado con la auxina 2,4,5 T, un resultado superior al 5% obtenido por Oliveira et al. (2005) trabajando con el protocolo de Guiltinan et al. (2003). La capacidad de los embriones somaticos primarios de formar embriones somaticos secundarios o no, puede deberse a la variabilidad celular existente probablemente en su origen. Maximova et al. (2002) describieron el origen celular de embriones somaticos primarios de cacao como pluricelular, y el de los embriones somaticos secundarios como unicelular. Teniendo en cuenta la pluricelularidad en el explante original, es posible pensar que no todas las celulas tendran la misma capacidad de formar embriones somaticos secundarios. A parte de ello se encuentra la variabilidad propia de cada clon discutida anteriormente.

Con respecto al mantenimiento de la embriogenesis secundaria, Muralidharan y Mascarenhas (1995) y Shi et al. (2010) conservaron el potencial embriogenico repetitivo por mas de dos anos para las especies Eucalyptus citriodora y Cinnamomum camphora L. respectivamente, empleando auxinas en el medio de cultivo.

La embriogenesis somatica secundaria tiene gran potencial para la micropropagacion a gran escala, la cual es especialmente importante para especies lenosas que tienen ciclos de generacion largos (como el cacao) y con bajas frecuencias de embriogenesis somatica. A parte de ser efectiva en la eliminacion de virus como el CSSV, promueve la fidelidad genetica en la criopreservacion de cacao (Fang et al. 2009; Quainoo et al. 2008).

Esta continua proliferacion de embriones es tanto efectiva en costo como en tiempo, y representa resultados promisorios para la cadena productiva colombiana de cacao como sistema util para la micropropagacion y futura transformacion genetica.

Analisis histologico

La presencia de una epidermis definida y haces vasculares indican el grado de diferenciacion obtenido con los embriones somaticos. La independencia del tejido madre y la bipolaridad de los embriones permitieron confirmar que el protocolo evaluado indujo la formacion de embriones somaticos viables. Estas caracteristicas tambien fueron descritas por Pinto et al. (2010), Vega et al. (2009) y Ramos et al. (2010).

Igualmente se observo la presencia de embriones fusionados. En especies como Capsicum se reportaron defectos como fusion de embriones cuando los embriones en estado torpedo no se aislaban del callo original (Ramos et al. 2010), lo que significa que la asincronia embriogenica presente en cacao da pie para que se pueda presentar este tipo de eventos. Con los resultados obtenidos no fue posible observar el origen celular de los embriones, no obstante las protuberancias (tipo suspensor) formadas en algunos embriones podrian sugerir un origen unicelular (Ramos et al., 2010).

Conclusion

En este trabajo se obtuvieron embriones somaticos en los clones colombianos ICS95 y BIOB, no obstante solo los embriones de este ultimo clon se desarrollaron hasta la etapa cotiledonar empleando el protocolo de Fontanel et al. (2002). Posteriormente se desarrollaron hasta plantulas en el medio de maduracion MM6 modificado. Un tiempo prolongado en este medio favorecio un buen desarrollo en altura y radicular, aspecto que permitio la adaptacion ex vitro exitosa. Por otro lado, los pobres resultados obtenidos con el clon ICS95 reafirman el fuerte efecto genotipico en la embriogenesis somatica de Theobroma cacao. Este es el primer reporte de conversion a plantula y adaptacion ex vitro exitosa en un genotipo colombiano elite de cacao, sin embargo se requiere mas investigacion al respecto para superar la recalcitrancia asociada a otros genotipos como ICS95.

Agradecimientos

Agradecemos a las entidades Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, Compania Nacional de Chocolates y Universidad de Antioquia por financiar el desarrollo de este trabajo. Al Dr. Camilo Ramirez por su apoyo en la parte estadistica.

Recibido: mayo 15 de 2011

Aprobado: octubre 27 de 2011

Referencias bibliograficas

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Aura Ines Urrea Trujillo, Ph. D. en ciencias, Docente Instituto de Biologia, Universidad de Antioquia (Medellin), Colombia. aurrea@matematicas.udea.edu.co

Lucia Atehortua Garces, Ph. D. en ciencias, Docente Instituto de Biologia, Universidad de Antioquia (Medellin), Colombia. latehor@gmail.com

Adriana Maria Gallego Rua, Cand. Msc. en Biologia, Investigadora grupo de Biotecnologia, Universidad de Antioquia (Medellin), Colombia. adriana.gallego.02@gmail. com
Tabla 1. Descripcion nominal de los medios empleados en las
diferentes fases de la embriogenesis somatica.

Fases                        Protocolos

                  Guiltinan et          Fontanel et
                   al. (2003)           al. (2002)

Induccion        PCG              INDI

Formacion        SCG1, ED         INDExp

Maduracion                        MM6 modificado
                                  (concentracion de
                                  gelificante 3.5g/L)

Mantenimiento    RD

Tabla 2. Respuesta embriogenica en los genotipos de
cacao ICS95 y BIOB. aNo.P. de ES: Numero promedio de
embriones somaticos.

                             Genotipo

Explante                      ICS95        BIOB
                             Petalo    Estaminodio

Callo (%)                      90         92.78
Callo embriogenico (%)         50         32.81
No.P. de ESa/Explante          1.5        3.079
No.P. de cluster/explante       0         15.11

Tabla 3. Respuesta de ESS para el clon BIOB. aPorcentaje de
explantes formando embriones somaticos secundarios.

Genotipo BIOB

      Explante              Respuesta         Numero
                          embriogenica       muestral
                       secundaria (%) (a)

Embrion globular              21.46             21
Embrion cotiledonar           26.16             22
Total respuesta ESS           23.81             43
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Title Annotation:ARTICULO DE INVESTIGACION
Author:Urrea Trujillo, Aura Ines; Atehortua Garces, Lucia; Gallego Rua, Adriana Maria
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Dec 1, 2011
Words:7274
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