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Regeneracion de Ananas comosus (L.) Merr, ecotipo Tabe Kana, mediante organogenesis indirecta.

Regeneration of Ananas comosus, ecotype Tabe Kana, by indirect organogenesis

INTRODUCCION

La pina (Ananas comosus (L.) Merr, forma parte de la familia Bromeliaceae y todas las variedades de pina de interes comercial pertenecen a esa especie (Santa Cruz et al., 2006). Este fruto tropical tiene gran produccion a nivel mundial, siendo Tailandia el principal productor. Venezuela ocupa el numero catorce con una produccion de 425.000 toneladas metricas, y en el pais este cultivo representa el quinto rubro de origen vegetal en produccion precedido por el arroz, azucar, maiz y banano; se cultiva en los estados Tachira, Merida, Trujillo, Lara, Monagas, Anzoategui, Sucre y los margenes del rio Orinoco en el estado Amazonas (FAOSTAT, 2012).

El ecotipo de pina Tabe Kana, autoctono del Amazonas, es uno de los once ecotipos que son cultivados en esa region principalmente por los aborigenes de la etnia Piaroa. La planta posee hojas con espinas en sus margenes y el fruto se caracteriza por ser mas dulce y de mayor tamano, en comparacion con los frutos de la variedad comercial Espanola Roja. Es usado predominantemente para consumo como fruta fresca, en jugos y conservas.

A. comosus presenta incompatibilidad reproductiva expresada por la inhibicion del crecimiento del tubo polinico en el tercio superior del estilo, por lo que su propagacion tradicional se realiza vegetativamente mediante brotes laterales y por el enraizado de las hojas de la corona. Los Piaroa cultivan las pinas autoctonas de la region como parte de su cultura ancestral y la multiplican por el metodo convencional. Sin embargo, por este metodo obtienen un numero limitado de propagulos, lo cual restringe la disponibilidad de material vegetal para la plantacion a mayor escala.

La propagacion in vitro ha sido ampliamente utilizada para lograr la rapida multiplicacion de numerosas especies vegetales, y entre ellas, la pina (Roostika y Mariska, 2003; Amin et al., 2005; Roostika et al., 2012). El exito de esta tecnica en escala comercial depende de la habilidad de transferir las plantas a condiciones ex vitro, la adecuada implementacion de la tecnica empleada y la obtencion de una alta tasa de supervivencia de las plantas (Hazarika, 2006).

Debido a la importancia agricola y economica del ecotipo de pina Tabe Kana para la actividad fruticola de la comunidad Piaroa del Amazonas venezolano, en este trabajo se planteo establecer un sistema de regeneracion in vitro via organogenesis como metodo de propagacion clonal de la misma para la obtencion de vitroplantas que puedan ser multiplicadas como material de propagacion para suplir las necesidades de los productores, y favorecer la actividad productiva de esta comunidad. Parte de este material pasaria a formar parte del germoplasma in vitro de la institucion ejecutora.

MATERIALES Y METODOS

El area de recoleccion de las plantas de pina correspondio a la region habitada por indigenas de la etnia Piaroa, ubicada en la cuenca hidrografica del rio Cataniapo, municipio Atures del estado Amazonas, aproximadamente a 30 km de la capital del estado. El clima de esta region se puede considerar de tipo tropical monzonico, con una corta estacion seca comprendida entre los meses de enero y marzo, precipitacion anual de 2847 mm y temperatura que oscila entre 24 y 32 [grados]C. Los sucios predominantes son oxisoles y ultisoles, con baja capacidad de intercambio cationico, bajos contenidos de nutrientes y alta acidez (Villa et al., 2012).

Se empicaron como explantes segmentos de bases de hojas de aproximadamente 25 [mm.sup.2] provenientes de plantas micropropagadas de A. comosus del ecotipo autoctono del Amazonas Tabe Kana obtenidas a partir de yemas de la corona c hijos basales de las mismas, y mantenidas in vitro durante 8 meses a 25 [+ o -] 1 [grados]C, bajo luz blanca continua de 50 [micron]mol x [m.sup.-2] x [s.sup.-1], en el banco de germoplasma del Laboratorio de Biotecnologia, Instituto de Biologia Experimental de la Universidad Central de Venezuela (De Garcia et al., 2008; Blanco et al., 2011).

Los medios de cultivo utilizados durante la investigacion se prepararon en base a las sales de Murashigc y Skoog (MS), suplementados con 0,4 mg x [L.sup.-1] de tiamina, 100 mg x [L.sup.-1] de mio-inositol y 30 g x [L.sup.-1] de sacarosa. El pH de los medios fue ajustado a 5,8 con NaOH 0,1 M y se anadieron 8 g x [L.sup.-1] de agar como agente gelificante. Un volumen de 30 mL de estos medios fue distribuido en frascos de vidrio y posteriormente esterilizado en autoclave durante 20 minutos (121 [grados]C y 0,1 MPa).

Se establecieron tres diferentes medios de cultivo: a) el medio control MS1, al cual no le fueron anadidos reguladores de crecimiento, b) el medio MS2 al cual se le anadieron 5 mg x [L.sup.-1] de acido naftalenacetico (ANA) mas 0,25 mg x [L.sup.-1] de benciladenina (BA), y c) el medio MS3 que recibio la adicion de 2,5 mg x [L.sup.-1] de acido 2,4-dichlorofenoxiacetico (2,4-D). Las concentraciones de los fitoreguladores se seleccionaron basados en experiencias previas donde se demuestra que el 2,4-D es efectivo en originar callos organogenicos en explantes de organos de pina cultivados in vitro (Roostika et al., 2012; Pineda et al., 2012), lo que permitiria disminuir el costo del metodo. El caso del ANA en combinacion con BA, tambien es producto de estudios previos realizados con la variedad de pina Espanola Roja (Pineda et al., 2012). Por su parte, el medio de Murashige y Skoog ha propiciado mejor respuesta que otros medios cuando se ha utilizado para el cultivo in vitro de otra especie crasulacea como el cocuy (Gonzalez et al., 2012).

Los explantes se inocularon en los medios de cultivo en camara de flujo laminar bajo condiciones de asepsia a razon de 10 secciones por frasco, con 5 replicas cada uno, obteniendose un total de 50 explantes por tratamiento. El material fue incubado en una camara de crecimiento a una temperatura de 25 [+ o -] 1 [grados]C, en total oscuridad durante un mes para la induccion de la formacion de callo y una vez que los explantes daban origen a tejidos de callo, los tejidos eran transferidos a otra camara de crecimiento con condiciones de luz fluorescente continua (50 [micron]mol x [m.sup.-2] x [s.sup.-1]) y temperatura de 27 [+ o -] 1 [grados]C. La transferencia de los explantes fue realizada a medios con composicion quimica igual a la original, suplementados con 100 mg x [L.sup.-1] de acido ascorbico, con la finalidad de prevenir la oxidacion. La transferencia del material a medio fresco se realizo cada dos meses.

Para evaluar el proceso organogenico, en cada cultivo se realizaron determinaciones del porcentaje de explantes con formacion de callo, promedio de raices por explante, promedio de brotes por explante e indice de formacion de brotes. Asimismo, se llevo el registro de las caracteristicas del callo y explantes, tiempos de respuesta, porcentaje de contaminacion de los explantes y porcentaje de plantas aclimatadas. Todas las observaciones fueron realizadas utilizando una lupa estereoscopica.

El indice de formacion de brotes (1FB) se calculo mediante la siguiente formula (Kikuta y Okazawa, 1984):

IFB = No brotes formados x No explantes con brotes/ [(No explantes cultivados).sup.2]

Con el fin de establecer la naturaleza del proceso de regeneracion in vitro, se observaron los cambios estructurales de los tejidos. Para ello se llevo a cabo un estudio anatomico del material vegetal, para determinar si la organogenesis ocurria en forma directa o indirecta. Se efectuaron cortes a mano alzada del material vegetal en las diferentes etapas del proceso de regeneracion, los cuales fueron tenidos con azul de toluidina en solucion acuosa al 1 % y fijado en glicerina al 50 %. Los cortes anatomicos fueron observados a traves de microscopios opticos de luz visible y de luz polarizada. En cada caso, se tomaron fotografias utilizando una camara digital acoplada a ellos.

Para la aclimatacion de las plantas regeneradas, se transfirieron 50 de ellas obtenidas por organogenesis, con una altura aproximada de 6 cm, a un sustrato conformado por suelo abonado con residuos organicos de plantas, y arena lavada en una proporcion 1:1 y se colocaron durante 15 dias en propagadores con alta humedad (80-93 % de humedad relativa) y baja luminosidad (10 [micron]molx [m.sup.-2] x [s.sup.-1]). Luego, las plantas fueron transferidas a condiciones de vivero durante tres meses y finalmente llevadas al campo a plena exposicion solar.

El analisis estadistico de los datos se realizo a traves de analisis de varianza y pruebas de Duncan utilizando el programa Statistica version 5.5.

RESULTADOS

Establecimiento del cultivo in vitro: En el proceso de establecimiento del cultivo in vitro, se obtuvo un porcentaje minimo de contaminacion fungica y bacteriana, observandose un 100 % de explantes libres de contaminacion en el medio MSI y MS2, y 90 % en el medio MS3. Esta baja tasa de contaminacion se corresponde con explantes extraidos de plantas obtenidas y mantenidas in vitro.

Induccion del callo: Los explantes cultivados en el medio control (MSI) no presentaron cambios morfologicos y solo se observo la oxidacion de los mismos. En los medios MS2 y MS3 se observaron cambios en los explantes a partir de la tercera semana de cultivo, notandose la deformacion extema del explante debido a un crecimiento diferencial en su superficie, presencia de hiperhidricidad de los tejidos externos y cambio de coloracion del explante (verde a amarillento). Posteriormente, a las seis semanas, se observo callo granular friable de color claro en la region donde se realizo el corte de la hoja para escindir el explante (Figura 1).

[FIGURA 1 OMITIR]

A los tres meses de cultivo, se pudo observar que los explantes en el medio MS2 presentaron aproximadamente el triple de cantidad de callo que los explantes cultivados en el medio MS3, y en ambos casos los callos fueron de apariencia heterogenea, con zonas amarillentas translucidas friables, otras zonas compactas de coloracion marron conformada por tejido oxidado y otras zonas de color verde, donde posteriormente ocurrio la regeneracion de brote (Figura 2). En algunos casos, el callo se formo unicamente en los extremos del explante y en otros en toda la superficie de este.

En el medio MS2 se obtuvo un mayor porcentaje de explantes con formacion de callos en comparacion con el medio MS3 a los tres meses de crecimiento (84 vs. 10 %; P[menor que o igual a]0,05); no obstante, a los siete meses se logro una alta proporcion de explantes con callo formado (90-100 %) en ambos medios de cultivo, sin diferencias entre ellos (Cuadro 1).

Regeneracion de brotes: Se encontro mayor numero de raices y de brotes por explante en el MS2 con relacion al MS3 (P[menor que o igual a]0,05), tanto a los tres como a los siete meses de cultivo (Cuadro 1). En promedio, la respuesta en el MS2 cuadruplico la respuesta obtenida en el MS3 para las variables mencionadas. Similar tendencia mostro el indice de formacion de brotes.

[FIGURA 2 OMITIR]

Los brotes regenerados en el MS2 (Figura 3) alcanzaron una mayor altura a los siete meses de cultivo, en comparacion a los brotes obtenidos en el MS3 (7,0 y 6,2 cm, respectivamente). Para ese momento, las raices formadas en ambos medios de cultivo alcanzaron una longitud promedio de 2,0 cm y presentaron una raiz notablemente desarrollada, de color amarillento y con numerosos pelos radicales.

En la Figura 4 se puede observar el corte longitudinal de yemas formadas de novo en el MS2, a partir de callo organogenico a los siete meses de cultivo. El corte muestra haces vasculares de diferentes brotes originados en la masa callosa, lo que indica la presencia de una organogenesis ocurrida por via indirecta, ya que los haces vasculares no se originan a partir de un tejido diferenciado preexistente; este proceso se observo en callos que crecian tanto en MS2 como en MS3.

El proceso se inicio con la formacion de callos en el explante a partir de la tercera semana de cultivo; algunos de ellos dieron origen a brotes y otros a raices despues de dos meses de cultivo en el MS2 y a partir de los tres meses en el MS3 (Figura 5).

[FIGURA 3 OMITIR]

[FIGURA 4 OMITIR]

Aclimatacion de las plantas regeneradas: Luego de transferir plantas de 4 a 6 cm de altura a un sustrato con suelo mineral y mantenerlas en propagadores, se obtuvo 95 % de sobrevivencia. En la Figura 6A se observan las plantas luego de tres meses de aclimatacion, y en la Figura 6 B un ano despues de trasladadas al campo.

DISCUSION

El uso de bases de hojas como explantes resulto satisfactorio para la propagacion via organogenesis del ecotipo de pina Tabe Kana tal como ha sido reportado para diferentes variedades de pina (Firoozabady y Moy, 2004; Pineda et al., 2012; Roostika et al., 2012). En relacion a este punto, Firoozabady y Moy (2004) senalan que las bases de las hojas de pina presentan regiones meristematicas (meristemos axilares) o poseen tejidos con celulas jovenes de rapida division, las cuales son sensibles a los procesos de morfogenesis en condiciones de cultivo de tejidos in vitro. Adicionalmente, Alves et al. (2006) reportan que la zona basal de las hojas de las monocotiledoneas y especialmente de las bromelias, presenta elementos vasculares con celulas competentes para la rediferenciacion cuando son activadas por senales reguladoras.

[FIGURA 5 OMITIR]

[FIGURA 6 OMITIR]

No se observo la formacion de callo en los explantes de hojas cultivados en el medio sin reguladores de crecimiento (MS1). Es decir, para lograr la respuesta del explante fue necesario aplicar fitorcguladorcs y modificar el balance hormonal endogeno de los explantes. La formacion de callo se observo en los explantes cultivados en los medios MS2 (5 mg x [L.sup.-1] de ANA + 0,25 mg x [L.sup.-1] de BA) y MS3 (2,5 mg x [L.sup.-1] de 2,4D), a las tres semanas de cultivo, alcanzando 100% de explantes con callo en el medio MS2 a los siete meses. Este resultado es similar al reportado por Amin et al. (2005), quienes obtuvieron callos en A. comosus cv. Giant Kew en bases de hojas a partir de la cuarta semana de cultivo en un medio MS suplementado con una auxina y una citocinina (2,4-D y BA). Los periodos de tiempo para la iniciacion del callo reportados en el presente trabajo, y los senalados por Amin et al. (2005), resultaron mayores que el reportado por Sripaoraya et al. (2003), quienes indican que obtuvieron la formacion de callos a las dos semanas de cultivo a partir de bases de hojas de pina cv. Phuket, en medio MS suplementado igualmente con 0,5 mg[L.sup.-1] de 2,4-D y 2,0 mg x [L.sup.-1] de BA.

Desde el punto de vista morfogenico, la caracteristica mas importante del callo es la presencia de pequenas regiones con celulas totipotcntcs, capaces de formar nodulos meristematicos bajo condiciones nutricionales, hormonales y ambientales, apropiadas, y expresar su determinacion hacia el inicio de eventos morfogeneticos, que se traduce en la formacion de brotes, y/o raices, dependiendo fundamentalmente del balance auxina/citocinina (Christianson y Warnick, 1983). Un aspecto interesante en esta investigacion es que no fue necesaria la transferencia de los callos a un medio de regeneracion ya que la formacion de raices y/o brotes en los explantes ocurrio en los mismos medios de induccion de callo.

En el medio MS2 (5 mg x [L.sup.-1] ANA + 0,25 mg x [L.sup.-1] de BA) se obtuvo un promedio de 4,98 brotes por explante a los siete meses de cultivo. Otros investigadores tambien han obtenido brotes de pina via organogenesis in vitro, utilizando los fitoreguladores ANA y BA en los cultivares de pina 'Cayena Lisa' (Firoozabady y Gutterson, 2003), 'Phuket' (Amin et al., 2005), y 'Espanola Roja' (Pineda et al., 2012). Al respecto, Sinha y Roy (2002), en un trabajo con Gladiolus primulinus, reportan el efecto positivo de la combinacion BA/ANA sobre la formacion de brotes.

La organogenesis observada en esta investigacion, tanto en el medio MS2 como en el MS3, fue indirecta; sin embargo, Roostika y Mariska (2003) reportaron el desarrollo de organogenesis tanto directa como indirecta en explantes de pina cultivada en medios similares al MS2. Estos autores cultivaron yemas apicales y obtuvieron regeneracion de brotes, un 99 % via organogenesis directa y 86 % via indirecta. Pineda et al. (2012), usando tambien los mismos medios MS2 y MS3, para cultivar secciones de base de hoja de la variedad Espanola Roja, observaron organogenesis indirecta de brotes y raices en medio MS2, y formacion directa e indirecta de raices en medio MS3. La organogenesis directa indica que los explantes contienen celulas con balances endogenos de reguladores de crecimiento, lo cual les permite estar predeterminados para el proceso organogenico (Christianson y Warnick, 1988).

En el medio de cultivo MS3, suplementado solamente con auxina (2,4-D), se obtuvo un promedio de 1,78 brotes/explante a los siete meses de cultivo. Otros investigadores tambien han reportado la induccion de organogenesis en diferentes especies vegetales usando el 2,4-D (Khanam et al., 2000; Vidoz et al., 2004; Pineda et al., 2012).

En el presente estudio, si bien en el medio MS3 se logro la induccion de formacion de organos (brotes y raices), se observa que los resultados fueron significativamente inferiores a los alcanzados en el medio MS2 (Cuadro 1), por lo que se sugiere que la presencia en el medio del BA, una citocinina que induce division celular, origino un balance de reguladores de crecimiento que potencia el efecto del ANA sobre el proceso organogenico en el tejido calloso de estos explantes. Soneji et al. (2002), trabajando con un sistema similar al nuestro, demostraron la necesidad de la presencia de auxinas y citocininas en el medio para optimizar la organogenesis.

Es interesante hacer notar que a diferencia de otros trabajos (Sripaoraya et al., 2003; Amin et al., 2005; Roostika et al., 2012), en la presente investigacion, tanto el proceso de induccion de callos como la diferenciacion de organos, se logro en un mismo medio, y no fue necesario cambiar ni variar la concentracion de los fitoreguladores, lo cual representa un ahorro en el costo del protocolo de propagacion utilizado.

Con relacion a la importancia de que se lleve a cabo la fase de aclimatacion, la misma radica en lograr la adaptacion de las plantas obtenidas in vitro a condiciones autotrofas, donde tendran que regular adecuadamente sus procesos de absorcion, translocacion y transpiracion (Santa Cruz et al., 2006). En nuestra investigacion se logro un alto porcentaje de aclimatacion de las plantas de pina ecotipo Tabe Kana obtenidas por organogenesis in vitro, empleando individuos de 4-6 cm de altura. Por su parte, Dal Vesco et al. (2001), utilizando plantas micropropagadas in vitro de pina cv. Perola, encontraron que el mayor porcentaje de aclimatacion (93,8 %) se obtuvo en plantas transferidas al sustrato cuando tenian mas de 7 cm de altura. Asimismo, Casale y De Garcia (1987), De Garcia et al. (2008) y Pineda et al. (2012) lograron un 100 % de supervivencia de plantas micropropagadas de pina var. Espanola Roja, empleando un sustrato de arena y suelo abonado, similar a la composicion del utilizado en la presente investigacion.

CONCLUSIONES

En esta investigacion se logro el establecimiento de un sistema de organogenesis in vitro en Ananas comosus a partir de segmentos de bases de hojas de plantas del ecotipo autoctono del Amazonas Tabe Kana, siendo el medio de cultivo MS2 (5 mg x [L.sup.-1] de ANA y 0,25 mg x [L.sup.-1] de BA) el tratamiento mas eficiente para la induccion de dicho proceso, produciendo 4,98 brotes por explante.

Tanto el medio MS2 (con ANA y BA) como el MS3 (con 2,4-D) indujeron procesos de diferenciacion y en ambos se logro observar organogenesis indirecta de raiz y brote. Sin embargo, la mayor formacion de estos organos en callos de secciones de bases de hojas ocurrio en el medio MS2, lo que indica que la presencia de la citocinina (BA) origino un balance de reguladores de crecimiento que potencia el efecto del ANA sobre ambos procesos organogenicos. El 95 % de las vitroplantas obtenidas se aclimataron exitosamente a las condiciones de vivero.

La induccion de callo y la diferenciacion de brotes y raices ocurrio en el mismo medio (MS2 o MS3), y no se requirio de cambiar o variar las concentraciones de los fitoreguladores de crecimiento, lo cual abarata el costo del sistema.

AGRADECIMIENTO

A las instituciones que financiaron esta investigacion: Consejo de Desarrollo Cientifico y Humanistico de la UCV (proyecto PSU-7617-2009/2) y al Fondo Nacional de Ciencia Tecnologia e Innovacion (FONACTT) (proyecto contrato No 201201031).

LITERATURA CITADA

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Recibido: Abril 3, 2014

Aceptado: Agosto 29, 2014

Adriana Pineda [1], Teresa Edith Vargas [1] y Eva Garcia de Garcia [1]

[1] Instituto de Biologia Experimental, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela. Caracas. Venezuela, e-mail: eva.cristina.garcia@gmail.com; teoriedu@gmail.com
Cuadro 1. Efecto de los reguladores de crecimiento sobre el proceso
de organogenesis en segmentos de bases de hojas de pina ecotipo Tabe
Kana a los tres y siete meses de crecimiento

Medio de    Formacion de callo    Promedio de raices
cultivo            (%)               por explante

                 Tres meses de crecimiento

MS1                 0                     --
MS2                84 a                 1,78 a
MS3                10b                  0,44 b

                 Siete meses de crecimiento

MS1                 0                     --
MS2               100 a                 5,54 a
MS3                90 a                 1,40 b

Medio de   Promedio de brotes   Indice de formacion
cultivo       por explante           de brotes

                 Tres meses de crecimiento

MS1                --                   --
MS2              3,43 a                3,13
MS3              0,79 b                0,71

                 Siete meses de crecimiento

MS1                --                   --
MS2              4,98 a                4,98
MS3              1,78 b                1,60

MS1: Medio sin sustancias de crecimiento; MS2: Medio con 5 mg x
[L.sup.-1] de ANA y 0,25 mg x [L.sup.-1] de BA; MS3: Medio con 2,5
mg x [L.sup.-1] de 2,4-D. Valores con letras distintas indican
diferencias significativas segun la prueba de Duncan (P[menor que o
igual a]0,05)
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Author:Pineda, Adriana; Edith Vargas, Teresa; Garcia de Garcia, Eva
Publication:BIOAGRO
Date:Dec 1, 2014
Words:4696
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