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Regeneracao de plantas apos fusao de protoplastos de tangelo 'page' e toranja 'Lau Tau'.

PLANT REGENERATION AFTER PROTOPLAST FUSION OF 'PAGE' TANGELO AND 'LAU TAU' PUMMELO

INTRODUCAO

Hibridos interespecificos de citros podem ser obtidos via cruzamentos controlados, mas com limitacoes, devido a aspectos da biologia reprodutiva do genero, como o longo periodo de juvenilidade, presenca de embrioes nucelares, incompatibilidade e esterilidade sexual, alta heterozigose (Grosser & Gmitter Junior, 1990). A utilizacao de ferramentas biotecnologicas podem auxiliar na superacao destas limitacoes do melhoramento genetico convencional, contribuindo, assim, para o desenvolvimento de novas cultivares. Uma destas tecnicas e a hibridacao somatica, a partir da qual podem ser produzidos hibridos interespecificos, buscando combinar caracteristicas desejaveis dos genitores em uma mesma planta (Grosser & Gmitter Junior, 2005).

Os porta-enxertos de citros oriundos da hibridacao somatica tem levado a ganhos significativos na qualidade dos frutos e na producao de sementes, alem de reducao do porte das plantas. Verificou-se tambem que o hibrido somatico laranja-azeda + limao 'Cravo' tem demonstrado tolerancia ao virus da tristeza dos citros (CTV) (Grosser & Chandler, 2003).

Protoplastos derivados de folhas de citros nao tem potencial embriogenico e nao sofrem morfogenese nas condicoes-padrao de cultivo (Grosser & Gmitter Junior, 1990). Entretanto, muitas plantas diploides, morfologicamente identicas ao genitor, cujos protoplastos sao de origem foliar, foram regeneradas apos fusoes simetricas interespecificas entre especies diploides. Analises destas plantas com base em marcadores moleculares tem indicado que as mesmas sao hibridos aloplasmicos ou cibridos, apresentando genoma nuclear do genitor nao-embriogenico e o mtDNA do genitor embriogenico (Moreira et al., 2000; Liu et al., 2002).

Ate recentemente, o valor Agrnomico dos cibridos de citros era pouco conhecido, pois caracteristicas horticulturais importantes, associadas com genomas de organelas, ainda nao haviam sido identificadas (Grosser et al., 2000); no entanto, a avaliacao de cibridos de tangerinas e laranjas-doces no campo tem mostrado variacao significativa em caracteristicas Agrnomicas importantes, incluindo a epoca de maturacao do fruto e conteudo de sementes, indicando que a cibridizacao e uma fonte potencial de variacao genetica para o melhoramento de variedades de citros (Grosser & Gmitter Junior, 2005).

Buscou-se, neste trabalho, a hibridacao somatica entre tangelo 'Page' e toranja 'Lau Tau' visando a producao de portaenxerto semelhante a laranja-azeda, por esta especie ser considerada um hibrido provavel entre C. reticulata e C. grandis (Nicolosi et al., 2000).

MATERIAL E METODOS

Isolamento, fusao e cultivo de protoplastos e regeneracao de plantas

Protoplastos de tangelo 'Page' (C. reticulata x C. paradisi) foram isolados de suspensoes celulares derivadas de calos embriogenicos, cultivadas em meio de cultura EME ou H + H, no escuro, a 27 [degre]C (Grosser & Gmitter Junior, 1990). Protoplastos de "seedling" de toranja 'Lau Tau' (Citrus grandis) selecionada para a resistencia a Phytophthora sp. (Calixto et al., 2003) foram obtidos de folhas jovens de plantas cultivadas em casa de vegetacao. Procedimentos relacionados ao isolamento, purificacao, fusao e cultivo de protoplastos foram realizados de acordo com protocolos anteriores (Mendes et al., 2001; Costa et al., 2003).

A regeneracao de plantas [degre]Correu por embriogenese somatica em meio de cultura EME modificado pela adicao de maltose (37 mM) (Benedito et al., 2000). Os embrioes formados foram entao transferidos para o meio 1500 (Grosser & Gmitter Junior, 1990). As plantulas originadas foram enxertadas in vitro por garfagem em laranja 'Hamlin' (C. sinensis). As plantas obtidas foram entao transferidas para casa de vegetacao, sendo cultivadas em substrato comercial.

Analise das plantas regeneradas

Todas as plantas regeneradas foram caracterizadas morfologicamente pela avaliacao da espessura das folhas, formato do limbo e peciolo foliares e coloracao.

A determinacao da ploidia foi realizada atraves da analise de citometria de fluxo, sendo utilizado um citometro PAS II-III Partec[R] equipado com lampada HBO 100W e filtros KG1, BG 38 e CG 435. As suspensoes nucleares foram isoladas e coradas com o tampao do kit CyStain UV precise T-DAPI (Partec[R]), seguindo as recomendacoes do fabricante. O material foi processado com tres repeticoes e analisados pelo software FlowMax[R] v 2.6 (Partec[R]). Nao menos que 5.000 nucleos foram analisados, e amostras com coeficiente de variacao (CV) acima de 5% foram descartadas. Os histogramas gerados pelo software foram calibrados para um parametro (SSC) e dimensionados no eixo de X em escala linear com 10 bits.

Para a analise de marcadores moleculares do tipo RAPD, o DNA genomico das plantas regeneradas e de seus genitores foi extraido a partir de folhas, utilizando-se da metodologia de Hoisington et al. (1994). A selecao de 'primers' polimorficos foi realizada a partir de uma avaliacao dos produtos de amplificacao gerados pelos 'primers' do Kit A-1 a A-20 e AA7 (Operon Technologies). Apos selecao, os 'primers' OPA1, OPA2, OPA3, OPA7, OPA8 e OPA9 foram utilizados em reacoes de PCR na avaliacao das plantas regeneradas. A reacao da PCR, incluindo a amplificacao, separacao e analise dos produtos, foi realizada de acordo com protocolos anteriores, com, pelo menos, tres repeticoes para cada 'primer' selecionado (Costa et al., 2003).

RESULTADOS E DISCUSSAO

A fusao de protoplastos envolvendo tangelo 'Page' e toranja 'Lau Tau' resultou na regeneracao de 17 plantas, as quais foram enxertadas in vitro sobre porta-enxerto laranja 'Hamlin', devido ao fato de nao terem desenvolvido sistema radicular adequado. A combinacao Citrus sinensis + Clausena lansium tambem apresentou dificuldade na formacao de raizes, tendo-se associado este fato a assimetria cromossomica, a dupla carga cromossomica ou mesmo eliminacao cromossomica (Fu et al., 2003)

A analise morfologica das plantas resultantes da fusao de protoplastos de tangelo 'Page' + toranja 'Lau Tau' revelou caracteristicas completamente diferentes dos genitores, com o apice da folha arredondado e com tamanho reduzido, alem da coloracao verde-escura, mesofilo enrugado e ausencia de peciolo alado, caracteristica presente em ambos os genitores (Figura 1). A morfologia dos hibridos simetricos interespecificos e intergenericos e, geralmente, intermediaria a dos genitores. Caracteristicas, como folhas mais espessas, arredondadas, normalmente mais escuras e com peciolo alado maior ou intermediario aos parentais e glandulas de oleo aparentes na face abaxial, podem ser comparadas com os genitores para a comprovacao da hibridacao (Takami et al., 2004). Plantas com morfologia intermediaria tem tambem sido derivadas de fusoes assimetricas. A morfologia de plantas regeneradas a partir do mesmo evento de fusao pode ser diversa, isto e, cada individuo gerado pode ser morfologicamente distinto do outro (Liu et al., 2005).

Em citros, a selecao de celulas hibridas pode ser feita pelo cultivo em elevada concentracao de sacarose (0,6 M) (Ohgawara et al., 1985), em concordancia com a metodologia empregada neste trabalho. Guo & Grosser

(2005) descrevem que a maioria das plantas regeneradas a partir de experimentos de fusao somatica sao hibridos somaticos tetraploides e quando as plantas regeneradas incluem plantas diploides semelhantes a um ou a ambos os genitores, as que primeiro regeneram, sao usualmente hibridos somaticos. Isto sugere que hibridos somaticos sao mais vigorosos e tem maior capacidade para a embriogenese comparada com regenerantes do genitor calo embriogenico.

Na analise por citometria de fluxo das suspensoes nucleares obtidas das folhas, os picos de leitura da quantidade de DNA em G1, apos a coloracao com DAPI, resultaram histogramas com resolucao suficiente para confirmar a ploidia, revelando que as plantas regeneradas das fusoes de protoplastos de tangelo 'Page'+ toranja 'Lau Tau' tratam-se de individuos diploides (2n=2x=18) (Figura 2). A [degre]Correncia de diploidia nas plantas regeneradas e semelhanca com um dos genitores pode indicar que as mesmas sejam um variante somaclonal da planta doadora de protoplastos de calo embriogenico, ou de um hibrido aloplasmico ou cibrido (Cabasson et al., 2001).

Pesquisas relacionadas a esse assunto indicam que diversas plantas diploides foram regeneradas apos fusoes simetricas entre especies diploides. Essas plantas foram denominadas tipo genitor foliar porque eram morfologicamente identicas a planta doadora de protoplastos de mesofilo utilizado na fusao. Analises subsequentes dessas plantas, baseadas em marcadores moleculares, indicaram que eram hibridos aloplasmicos ou cibridos. A maioria dessas plantas surgiu a partir de combinacoes interespecificas (Liu et al., 2002). Embora a formacao de cibridos atraves de hibridacao somatica em Citrus pareca [degre]Correr somente em combinacoes de especies dentro do genero (Moriguchi et al., 1996), plantas cibridas da combinacao entre Microcitrus papuana e Citrus aurantium foram obtidas (Xu et al., 2004).

[FIGURA 1 OMITIR]

Comparado com o DNA nuclear, o modelo de heranca do DNA mitocondrial e cloroplastidial e relativamente mais complexo. Para cloroplastos, a transmissao uniparental tem sido predominantemente detectada em muitas combinacoes, nao importando se sao intergenericas ou interespecificas. A transmissao ao acaso significa que o DNA cloroplastidial pode ser herdado tanto de protoplastos provenientes de mesofilo foliar, quanto de celulas provenientes de calos embriogenicos. Um exemplo deste fato e descrito por Guo et al. (2004) em tres hibridos somaticos tetraploides de tangelo 'Page' e tangor 'Murcott', cujas analises moleculares mostraram que dois foram identicos a tangor 'Murcott' e um igual a tangelo 'Page'.

A analise molecular por marcadores RAPD do genoma total das plantas provenientes da fusao de protoplastos de tangelo 'Page' + toranja 'Lau Tau' indica semelhanca entre bandas do genitor embriogenico tangelo 'Page' e a planta regenerada para os 'primers' selecionados (Figura 1). Esses resultados sugerem que a planta regenerada tangelo 'Page' + toranja 'Lau Tau' se trata de um variante somaclonal de tangelo 'Page'. A variacao somaclonal esta presente na maioria das especies estudadas e tem gerado efeito sobre inumeras caracteristicas, sendo as principais: alteracoes de padrao morfologico, de pigmentacao, de crescimento, producao de alcaloides e mudancas na producao e habituacao a auxinas e citocininas (Larkin & Scowcroft, 1981). [degre]Chatt & Caso (1986) verificaram que pereiras regeneradas a partir de protoplastos diferiram de plantas-modelo micropropagadas, tanto na morfologia das folhas como na capacidade de enraizamento. As causas dessa instabilidade genetica e pouco entendida. Entretanto, acredita-se que a instabilidade cromossomica seja uma das principais causas que induzem a variacao na cultura de tecidos (Roux et al., 2004).

Para avaliar se a planta regenerada apresenta o genoma nuclear de toranja 'Lau Tau' e o genoma mitocondrial de tangelo 'Page', analises moleculares mais detalhadas devem ser realizadas, utilizando-se de marcadores do tipo RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) que requerem a hibridizacao com sondas cloroplastidiais e mitocondriais. Da mesma forma, para afirmar que a planta regenerada se trata de um protoclone variante, uma nova e detalhada analise de RAPD deve ser realizada envolvendo DNA do tangelo 'Page' e da planta regenerada, verificando se ha ocorrencia de bandas polimorficas.

[FIGURA 2 OMITIR]

CONCLUSOES

Os protocolos utilizados para isolamento, fusao e cultura de protoplastos, bem como para a regeneracao e aclimatizacao de plantas permitiram a obtencao 17 plantas da combinacao entre tangelo 'Page' e toranja 'Lau Tau', com morfologia diferente dos dois genitores envolvidos.

REFERENCIAS

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DAYSE CRISTINA DE CARVALHO (2), FRANCISCO DE ASSIS ALVES MOURAO FILHO (3), BEATRIZ MADALENA JANUZZI MENDES (4), CARLOS ROBERTO DE CARVALHO (5)

(1) (Trabalho 163-06). Recebido em: 20-10-2006. Aceito para publicacao em : 20-04-2007.

(2) Enga Agra, MSc., Aluna do PPG em Fitotecnia (Doutorado), Universidade de Sao Paulo, ESALQ, Piracicaba-SP.

(3) Eng. Agr, Dr., Professor Associado. Universidade de Sao Paulo, ESALQ, Departamento de Producao Vegetal, Caixa Postal 9, 13418-900, Piracicaba-SP. Autor Correspondente. famourao@esalq.usp.br

(4) Enga. Agra, Dra, Professora Associada. Universidade de Sao Paulo, CENA, Laboratorio de Biotecnologia Vegetal, Piracicaba-SP.

(5) Eng.Agr.,Prof.Adjunto, Universidade Federal de Vicosa, Departamento de Biologia Geral, Vicosa-MG
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Author:De Carvalho, Dayse Cristina; Filho, Francisco De Assis Alves Mourao; Mendes, Beatriz Madalena Januzz
Publication:Revista Brasileira de Fruticultura
Date:Aug 1, 2007
Words:2961
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