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Ram semen cryoprotector based on egg yolk plasma maintain the viability of acrosomal membrane/Crioprotetor para semen de carneiro a base de plasma de gema mantem membrane acrossomal intacta apos a descongelacao.

INTRODUCAO

As alteracoes atribuidas ao processo de criopreservacao geralmente afetam a estrutura da membrana plasmatica, alterando principalmente a disposicao da bicamada lipidica da membrana do espermatozoide (LEBOEUF et al., 2000). Com isso, a baixa eficiencia do congelamento do semen ovino pode ser atribuida ao choque termico, ao estresse osmotico e ao efeito citotoxico, decorrente da adicao e remocao de substancias crioprotetoras, alem da desidratacao celular e formacao dos cristais de gelo. Dessa forma, a acao conjunta destes fatores pode comprometer a integridade da membrana plasmatica e viabilidade espermatica apos o descongelamento (WATSON, 2000; SALAMON& MAXWELL, 2000). Portanto, a manutencao da integridade da membrana plasmatica e fundamental para manter a viabilidade do espermatozoide no trato reprodutivo da femea, ate a fertilizacao (FLESCH & GADELLA, 2000).

Apos o descongelamento, e possivel identificar uma grande quantidade de espermatozoides moveis, embora com membrana plasmatica lesada. Dessa forma, os espermatozoides tem a motilidade comprometida quando incubados a 37[degrees]C. Portanto, um dos pontos criticos para o sucesso da criopreservacao dos espermatozoides de carneiros e a manutencao da integridade da membrana plasmatica (VALCARCEL et al., 1997).

Uma alternativa viavel e o uso do plasma da gema de ovo, composto por 85% de lipoproteinas de baixa densidade (LDL) e 15% por levitinas. Essas proteinas sao soluveis e podem ser separadas dos granulos lipidicos atraves de centrifugacao (NILSSON et al., 2006). Em bovinos, foi demonstrado que as LDL presentes na gema de ovo sao substancias importantes para protecao dos espermatozoides durante a criopreservacao (MOUSSA et al., 2002; AMIRAT et al., 2004). Entretanto, as LDL competem com os peptideos cationicos presentes no plasma seminal, os quais sao prejudiciais a membrana espermatica, alem de formar um complexo contra as proteinas do plasma seminal (PPS) (MANJUNATH et al., 2002; MANJUNATH & THERIEN, 2002).

A purificacao das LDL a partir do plasma de gema de ovo tem sido utilizada para criopreservacao de semen ovino (TONIETO et al., 2010; MOUSTACAS et al., 2011). MOUSSA et al. (2002) propuseram uma tecnica utilizando Sulfato de Amonio para o isolamento das LDL, porem esta tecnica necessita de cuidados especiais no seu processo. MOUSTACAS et al. (2011) criopreservaram semen de carneiro com diluidor TRIS, adicionado de 8, 12, 16 e 20% de LDL purificada nao liofilizada, e obtiveram a concentracao de 8%, 20% de espermatozoides com membrana plasmatica e acrossomal intactas, avaliadas por sondas fluorescentes. Apos a descongelacao, TONIETO et al. (2010) obtiveram semen com motilidade superior a 40%, integridade de membrana plasmatica de 23% e integridade de acrossoma acima de 38% usando semen de carneiro congelado com TRIS-LDL-glicerol. O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade crioprotetora das LDL nao purificadas, presentes no plasma de gema de ovo, adicionado ao TRIS para congelamento de semen ovino, buscando assim um diluente para semen de carneiro que preserve a integridade da membrana plasmatica e possibilite a manutencao da motilidade espermatica apos o processo de criopreservacao.

MATERIAL E METODOS

O experimento foi realizado na Regiao Central do Rio Grande do Sul--Brasil, durante os meses de Abril a Julho de 2012. Foram utilizados tres Carneiros das racas Ille de France, Texel e Sufolk com idade media de tres anos, mantidos em piquetes com pastagens formadas por aveia e azevem e suplementados com concentrado comercial, sal mineral e agua a vontade durante a estacao reprodutiva. As coletas de semen foram realizadas com uso de vagina artificial uma vez por semana, perfazendo 12 coletas por animal, totalizando 36 ejaculados. Apos a coleta, cada ejaculado foi avaliado quanto ao volume (medido em tubo graduado), concentracao (camara de Neubauer), movimento em massa, percentual de espermatozoides moveis e vigor, de acordo com SALAMON & MAXWELL (2000). Foram utilizados apenas ejaculados com volume superior a 0,5mL, concentracao minima de espermatozoides de 2,5x[10.sup.9]celulas [mL.sup.-1], motilidade massal e vigor minimo de 3 (escore 0-5), percentual de espermatozoides moveis superior a 80% e percentual de patologias espermaticas inferior a 15%. As amostras que nao apresentaram os parametros citados foram descartadas.

Diluidor I: TRIS Gema (TRISG)-composto de 3,63g de TRIS (Merck-1.08382-Germany), 1g de glicose (Merck-1.0024-Germany), 1,96g de acido citrico (Merck-1.05323-Germany), 0,06g de penicilina G (Sigma-P 3032-USA), 0,1g de estreptomicina (Sigma-S 6501-USA), 5mL de glicerol (Merck 1.04094 -Germany), 15mL de gema de ovo e 100mL agua bidestilada (SALAMON & MAXWELL, 2000).

Diluidor II: TRIS Plasma de gema de ovo (TRISP)-composto de 3,63g de TRIS (Merck-1.08382 -Germany), 1g de glicose (Merck-1.0024 -Germany), 1,96g de acido citrico (Merck-1.05323 -Germany), 0,06g de penicilina G (Sigma-P 3032 -USA), 0,1g de estreptomicina (Sigma-S 6501 USA), 5mL de glicerol (Merck-1.04094-Germany), 15mL de plasma de gema de ovo e 100mL de agua bidestilada (SALAMON & MAXWELL, 2000).

Para a obtencao do plasma da gema de ovo, foi utilizada ultracentrifugacao, conforme metodologia adaptada de MOUSSA et al. (2002). A gema foi diluida em solucao salina de baixa forca ionica (NaCl 0,17M), na proporcao de 1:2 e homogeneizada por 30 minutos. A solucao foi centrifugada a 12.000xg/45minutos/5[degrees]C. O pellet foi descartado e o sobrenadante foi centrifugado novamente (12.000xg/45minutos/5[degrees]C). Ao final, o sobrenadante resultante e o plasma da gema.

Apos a formacao do pool (minimizando o efeito individual), cada ejaculado foi dividido em duas partes iguais, sendo uma parte diluida em TRISG e outra em TRISP a 35[degrees]C em banho-maria, na concentracao de 200x[10.sup.6]sptz [mL.sup.-1]. Apos a diluicao pelo metodo One Step, o semen foi envasado em palhetas de 0,5mL previamente identificadas, na concentracao de 100x[10.sup.6]sptz [mL.sup.-1]. As palhetas foram lacradas e mantidas por 5[degrees]C/2h para estabilizacao da temperatura e, em seguida, colocadas a 5cm de altura do nitrogenio liquido/15min. Decorrido esse tempo, as palhetas foram mantidas ate a descongelacao em botijao com nitrogenio liquido (-196[degrees]C).

Apos a criopreservacao, as palhetas de semen foram descongeladas em banho-maria a 37[degrees]C/30 segundos. Uma amostra do semen foi analisada no microscopio de contraste de fase (CF) em aumento de 100x, para observacao da motilidade e vigor. O restante das palhetas foi incubada em banhomaria a 38[degrees]C/4h para o teste de termo resistencia lento (TTRL), objetivando analisar a longevidade e resistencia dos espermatozoides para as mesmas caracteristicas de avaliacao.

A avaliacao da viabilidade da membrana plasmatica e acrossomal foi realizada com sondas fluorescentes em microscopia de epifluorescencia. A coloracao foi feita atraves de sondas fluorescentes de iodeto de propideo, associada ao isotiocianato de fluoresceina conjugado com Pisum SativumAgglutinin (IP + FITC-PSA), de acordo com a metodologia descrita por CELEGHINI et al. (2010) e SEVERO et al. (2011). Apos a descongelacao, uma aliquota de 150[micro]L de semen foi diluida em meio TALP esperma (25x[10.sup.6]sptz [mL.sup.-1]), colocada em tubo aquecido e, em seguida, adicionado 3[micro]L de IP (0,5mg [mL.sup.-1]) e 50[micro]L de FITC-PSA (100[micro]g [mL.sup.-1]). As amostras foram incubadas durante 8 minutos em camara escura a 37[degrees]C. Uma amostra de 8[micro]l foi colocada entre lamina e laminula e avaliada em microscopio de epifluorescencia (Leica, modelo DMI 4000B, Wetzlar, Germany), apresentando um conjunto: L5-BP (480/40, RKP 505, BP 527/30; N2.1-BP (515-560 RKP 580 LP 590). Foram contados 200 espermatozoides por lamina sob objetiva de imersao e classificados com base na cor da fluorescencia, emitida a partir de cada sonda.

A normalidade dos dados foi verificada por meio do teste de Shapiro-Wilk e os dados em porcentagem transformados em arco-seno para melhorar a sua distribuicao. Para os dados de vigor, utilizou-se a analise nao parametrica de Kruskal-Wallis. A media e o desvio padrao foram usados para apresentacao dos parametros do semen fresco. Para a avaliacao do semen congelado, foi utilizada a analise de variancia (ANOVA), avaliando os parametros entre os tratamentos TRISG e TRISP por ocasiao da descongelacao e apos o TTRL, considerando nivel de significancia de P<0,05 (SAS).

RESULTADOS E DISCUSSAO

Os parametros do semen fresco dos carneiros utilizados neste trabalho estao descritos na tabela 1. Para minimizar o efeito individual e racial, foram agrupadas as amostras do semen de cada animal para obtencao do pool. Diante disso, os resultados demonstraram que os parametros (motilidade, vigor, membrana plasmatica intacta, acrossoma intacto, membrana e acrossoma intactos) do semen dos carneiros avaliados imediatamente apos a descongelacao nao diferiram significativamente para o TRISG e TRISP (Tabela 2). Na avaliacao do semen descongelado apos TTRL, nao foi observada diferenca (P>0,05) entre os tratamentos TRISG e TRISP em relacao a motilidade, vigor e membrana plasmatica (Figura 1). Entretanto, a variavel acrossoma intacto (ACI) foi significativa, sendo o diluidor TRISP superior (P<0,032) em comparacao ao diluidor TRISG (Figura 1).

No presente estudo, utilizou-se o diluidor TRIS adicionado de plasma de gema, que, segundo NILSSON et al. (2006), possui 85% de LDL, sendo esta a principal substancia crioprotetora de membrana espermatica. Apenas a adicao de plasma de gema nao mostrou melhora das funcoes do espermatozoide por ocasiao do descongelamento do semen, quando comparado ao desempenho do diluidor ja conhecido, TRISG (Tabela 2). Este fato pode ser explicado pelo uso do plasma da gema e nao de LDL purificadas, concordando com os relatos de MOUSSA et al. (2002); AMIRAT et al. (2005); BERGERON & MANJUNATH (2006), os quais afirmam que as LDL competem com os peptideos cationicos presentes no plasma seminal, alem de formar um complexo contra as proteinas do plasma seminal (PPS). Por outro lado, MOUSTACAS et al. (2011) verificaram que o uso das LDL purificadas e sem liofilizacao resultou em motilidade espermatica semelhante ao diluente TRIS adicionado de gema de ovo. O presente estudo utilizou plasma de gema de ovo (85% de LDL), o qual e obtido em processo rapido, simples e que apresentou resultados condizentes aos obtidos com diluentes adicionados de LDL purificado.

Apos a descongelacao do semen, foi encontrado 49,25% ( [+ or -] 1,93) e 50,41% ( [+ or -] 1,76) de espermatozoides com membrana e acrossoma intactos para os diluidores TRISG e TRISP, respectivamente. Estes resultados foram superiores aos achados de TONIETO et al. (2010) e MOUSTACAS et al. (2011), os quais encontraram valores abaixo de 22% de espermatozoides com membrana plasmatica e acrossomal intactas, quando congelados com TRIS adicionado de 8% de LDL. Esta discrepancia pode ser decorrente da metodologia de congelamento, concentracao dos constituintes do diluidor ou da purificacao das LDL.

Apos o TTRL, foi constatada a manutencao dos espermatozoides com membrana plasmatica intacta e acrossoma intacto (16% [+ or -] 1,18), empregando o TRISP como diluidor em relacao ao TRISG (13,5% [+ or -] 1,1). Os resultados obtidos nesta pesquisa possibilitaram melhorias dos parametros seminais, utilizando o TRISP como diluidor (Figura 1) sem a necessidade do processo de purificacao das LDL. Esses resultados sao reforcados pelos relatos de VALCARCEL et al. (1997), os quais afirmam que espermatozoides com membrana lesada perdem a motilidade rapidamente, quando incubada a 37[degrees]C. Na avaliacao da integridade do acrossoma (Figura 1), o diluidor TRISP foi significativo (17,41% [+ or -] 1,39) quando comparado com o TRISG (13,33% [+ or -] 1,1; P<0,032), igualmente aos insultados descritos por VALCARCEL et al. (1997), os quais referem-se a que a membrana plasmatica apresenta maior fragilidade em relacao a membrana acrossomal externa.

Segundo BERGERON et al. (2004), quando o semen e diluido logo apos a coleta, em diluente incluido de gema de ovo, as LDL sequestram as proteinas presentes no plasma seminal (PPS), impedindo que estas fiquem disponiveis para atuarem na membrana, e reduzindo assim a intensidade das alteracoes desta. O presente estudo foi realizado com amostras de semen provenientes de pool de tres ejaculados e o tempo para a confeccao do "pool" ate a diluicao do semen pode ter sofrido influencias das PPS sobre a membrana plasmatica do espermatozoide, influenciando no resultado apos TTRL, com resultados que sao semelhantes aos relatos descritos por MANJUNATH et al. (2002) e MANJUNATH & THERIEN (2002).

CONCLUSAO

A utilizacao de diluente rico em LDL nao purificado, obtido pela ultracentrifugacao do plasma da gema de ovo, adicionado ao TRIS, e uma alternativa para criopreservacao do semen de carneiros, pois, permite uma melhora da caracteristica seminal em relacao ao diluente TRIS gema, mas sem a necessidade do processo de purificacao das LDL.

http://dx.doi.org/10.1590/0103-8478cr20131451

AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico (CNPq) e Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS) pelo financiamento e ao Setor de Ovinocultura da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM).

REFERENCIAS

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Ivo Walter dos Santos (I) Jandui Escariao da Nobrega Junior (II) Matheus Pedrotti de Cesaro (II) Gustavo Freitas Ilha (II) Monique Tomazele Rovani (II) Paulo Bayard Dias Goncalves (II)

(I) Departamento de Medicina Veterinaria, Universidade Federal do Parana (UFPR), 85950-000, Palotina, PR, Brasil. E-mail: santosiw@ufpr.br. Autor para correspondencia.

(II) Laboratorio de Biotecnologia e Reproducao Animal, Departamento de Clinica de Grandes Animais, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil.

Recebido 30.10.13 Aprovado 18.10.14 Devolvido pelo autor 05.02.15 CR-2013-1451.R4

Tabela 1--Parametros avaliados no semen fresco dos
Carneiros para formacao dos "pool", colhidos com vagina
artificial, media e desvio padrao ([+ or -]).

Parametros                            Media   ([+ or -])

Turbilhao (0-5)                        3,8       0,55
Motilidade (%)                        86,7       3,3
Vigor (0-5)                            3,9       0,4
Concentracao (bilhoes/mL)              2,5       1,9
Membrana plasmatica intacta (%)       85,2       2,0
Acrossoma intacto (%)                 87,5       2,6
Membrana e acrossoma intactos (%)     84,8       1,7

Tabela 2--Parametros do semen dos carneiros diluidos com
TRIS-gema de ovo (TRISG) ou TRIS- plasma de gema de ovo (TRISP).
Media e desvio padrao ([+ or -]) apos descongelacao.
Letras diferentes demonstram diferencas entre
os tratamentos (P<0,05).

Parametros                           --Crioprotetor--

                                TRISG                 TRISP

Motilidade (%)           57,1 ([+ or -] 1,9)   57,9 ([+ or -] 1,6)
Vigor(0-5)               3,6 ([+ or -] 0,1)    3,7 ([+ or -] 0,1)
Membrana plasmatica      49,4 ([+ or -] 1,9)   50,6 ([+ or -] 1,7)
intacta (%)
Acrossoma intacto (%)    51,7 ([+ or -] 1,9)   52,4 ([+ or -] 2,0)
Membrana e acrossoma     49,2 ([+ or -] 1,9)   50,4 ([+ or -] 1,8)
intactos (%)
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Title Annotation:reproduccion animal; texto en portugues
Author:Santos, Ivo Walter dos; da Nobrega, Jandui Escariao, Jr.; de Cesaro, Matheus Pedrotti; Ilha, Gustavo
Publication:Ciencia Rural
Date:Jun 1, 2015
Words:3200
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