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Quantification of resistance enzymes in different populations of Tribolium castaneum (Herbst) (Coleoptera: Tenebrionidae)/Cuantificacion de enzimas de resistencia en diferentes poblaciones de Tribolium castaneum (Herbst) (Coleoptera: Tenebrionidae)/Quantificacao de enzimas de resistencia em diferentes populacoes de Tribolium castaneum (Herbst) (Coleoptera: Tenebrionidae).

Introduccion

En Mexico se registran 55 especies de insectos asociados con el dano a granos y productos almacenados; entre ellas se encuentran las especies del genero Tribolium (Tenebrionidae), las cuales se alimentan de granos partidos o lesionados, harinas, cereales y derivados amilaceos (Gutierrez, 1999). La especie Tribolium castaneum (Herbst) (Coleoptera: Tenebrionidae) o gorgojo de las harinas esta catalogada como la principal plaga de granos y productos almacenados (Howe, 1965). Las perdidas en granos causadas por este insecto se estiman en 10-25% de la produccion mundial (Weifen et al., 2003) y entre 34 y 40% en harinas y cereales (Ajayi y Rahman, 2006). El control de T. castaneum se basa principalmente en el uso de insecticidas y fumigantes. Sin embargo, su uso generalizado ha causado problemas tales como residuos toxicos en los productos almacenados, toxicidad para los consumidores y la resistencia a insecticidas (Ribeiro et al., 2003), donde la resistencia de tipo fisiologico es la mas importante, por los sistemas enzimaticos (Lagunes y Villanueva, 1994).

Los principales sistemas enzimaticos responsables del metabolismo e inhibicion de insecticidas son las oxidasas (Wilkinson, 1983), esterasas y carboxiesterasas (Yasutomi, 1983), glutation s-transferasas (Dauterman, 1983) y acetil colinesterasa (Hama, 1983). Al respecto, Abdul (2000) menciona valores elevados de esterasas y oxidasas, en poblaciones resistentes de T. castaneum a productos fosforados. Reidy et al. (1990) reportan una correlacion elevada entre glutation s-transferasa y resistencia a piretroides en esta misma especie. Asi mismo, Haubruge et al. (2002) mencionan un incremento en 44 veces de la actividad de carboxiesterasas en una linea resistente de T. castaneum en relacion a una linea susceptible. Por lo anterior, el monitoreo y deteccion de la resistencia es esencial en el manejo de insecticidas (Dennehy y Granett, 1984). La forma convencional de la deteccion de la resistencia se basa en pruebas de susceptibilidad en terminos de concentracion letal media ([CL.sub.50]) o dosis de diagnostico (Brown, 1976), requiriendo numerosos organismos que permiten cuantificar el nivel de resistencia, pero sin detectar los mecanismos. Por otro lado tenemos los perfiles de ADN que muestran a los genes responsables, sin detectar los mecanismos y niveles de resistencia (Keiding, 1986) y, finalmente, las pruebas bioquimicas, que son una herramienta efectiva para conocer los mecanismos y cantidad de enzimas responsables de este fenomeno (Hemingway, 1986). Ademas, se puede conocer los fenotipos multirresistentes mediante ensayos replicados (Chan, 1985) y es posible detectar las etapas iniciales de resistencia en una poblacion (Brown y Brogdon, 1987). Por lo anterior, el objetivo del presente estudio fue generar informacion sobre los mecanismos enzimaticos de resistencia en las diferentes lineas de T. castaneum del Norte de Mexico y su cuantificacion mediante pruebas bioquimicas.

Materiales y Metodos

Lineas de T. castaneum

Se usaron cinco lineas de Tribolium castaneum (Herbst) (Coleoptera: Tenebrionidae). Una linea susceptible (T-s), facilitada por la Universidad Autonoma Agraria Antonio Narro (UAAAN), mantenida desde el ano 2002 sin presion de seleccion por insecticidas, alimentada con harina de trigo comercial en camaras bioclimaticas a 35 [+ or -] 2[grados]C, 40-50% HR y 12:12 L:O. Las otras cuatro lineas fueron recolectadas en dos almacenes de harineras del estado de Coahuila (C1), de un almacen del estado de Nuevo Leon (NL1), otro de Tamaulipas (T1) y la ultima de un almacen del estado de Aguascalientes (A1).

Cria de las colonias de T. castaneum

Para obtener individuos de la misma edad cronologica para las pruebas bioquimicas, las poblaciones de T. castaneum recolectadas fueron colocadas en recipientes de vidrio, utilizando harina de trigo comercial como sustrato. La harina fue previamente esterilizada al colocarla por tres dias a -20[grados]C, con la finalidad de evitar contaminacion por otras especies de insectos. Los recipientes fueron tapados con tela de tul y asegurados con ligas para evitar la salida de los insectos, y mantenidos en una camara de cria a de 35 [+ or -] 2[grados]C, 40-50% HR y 12:12 L:O por 72h, con la finalidad de que los adultos recolectados ovipositaran. Los adultos fueron luego retirados y los huevos observados hasta llegar a su etapa adulta (F1), para ser utilizados en las pruebas bioquimicas.

Pruebas bioquimicas para estimar niveles de enzimas

En las cinco colonias de T. castaneum se utilizaron seis pruebas bioquimicas para la determinacion de los niveles de las enzimas [alpha]-esterasas, [beta]-esterasas, oxidasas, glutation S-transferasas, acetilcolinesterasas y acetilcolinesterasas insensibles. Todas las pruebas se corrieron por triplicado en placas de 96 pozos y fueron leidas mediante el lector de microplacas Stat fax-2100[R].

Los reactivos utilizados fueron: tampon fosfato de potasio 0,05M y pH 7.2 (BFP), [alpha] o [beta]-naftil acetato ([alpha] o [beta]NAF), o-dianisidina (OD), albumina serica bovina (ASB), homogeneizado de gorgojos (HM), dihidrocloruro de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMBZ), metanol (ME), acetato de sodio (ACE) 0,25M, pH 5, peroxido de hidrogeno 3% (PER), glutation reducido (GR), 1-cloro-2,4' dinitrobenzeno (CDNB), yoduro de acetilcolina (ATCH), y 5,5'-ditiobis-2-acido nitrobenzoico (DTNB).

Determinacion de proteina

La determinacion y cuantificacion de proteina contenida en tejidos y fluidos es la base para la realizacion de las pruebas bioquimicas, por lo que se determino la cantidad de gorgojos por muestra tomando como referencia la proteina por mosquito, usandose el metodo de Bradford (1976) modificado por Brogdon (1984), con el Kit-II de Bio-Rad y ASB como proteina de referencia. Se usaron hembras adultas de 3 dias de edad en cinco concentraciones diferentes en relacion al numero de gorgojos (0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 1,0; 2,0 y 3,0), cada una con 30 repeticiones.

Preparacion de los homogenatos

Una vez determinada la cantidad de muestra en relacion a la proteina (0,5 gorgojos= 100 [micro]g de proteina/ml), se homogenizo en 100 ml de BFP y se diluyo a 1ml (Brogdon, 1984). Se prepararon 90 muestras para cada una de las lineas.

Determinacion de los niveles enzimaticos

Para determinar los niveles de [alpha]-esterasas (aEST), [beta]-esterasas (PEST), oxidasas (Ox), glutation s-transferasas (GST), acetilcolinesterasa (ACE) y acetilcolinesterasa insensible (ACE in), se utilizaron las metodologias descritas por Brogdon (Brogdon et al., 1997). Para determinar los niveles enzimaticos; para las [alpha] y el [beta]-esterasas, se colocaron 100 [micro]l del HM a cada pocilio de la microplaca y 100 [micro]l de [alpha] o [beta]NAF acetato (mMezcla de 56mg de [alpha] o [beta]NAF en 20ml de acetona y aforada a 100ml con BFP) y se dejo reaccionar 15min. Se adicionaron 100 [micro]l de OD y se tomo la lectura usando el filtro de 545nm. Para las GST, se colocaron 100 [micro]l del HD mas 100 [micro]l de GR y 100 [micro]l de CDNB (mezcla de 20mg de CDNB diluida en 10ml y aforada con 90ml de BFP). Se tomo la lectura a [T.sub.0] con filtro de 340nm. Se dejo reaccionar por 10min y se tomo la lectura con el mismo filtro. La diferencia de lecturas se uso para el analisis de los resultados. Para las oxidasas, se colocaron 100 [micro]l del HM mas 200pl de TMBZ (mezcla de 50mg de TMBZ, diluida con 25ml de ME y aforada con 75ml de ACE y 25 [micro]l de PER). Se dejo reaccionar por 10min y se tomo la lectura con el filtro de 630nm. Finalmente, para la ACH y ACH in, se colocaron 100 [micro]l del HM mas 100 [micro]l de ATCH (mezcla de 75mg de ATCH/100ml de BFP) y 100 [micro]l de DTNB (mezcla de 13mg de DTNB/100ml de BFP). Se tomo la lectura a [T.sub.0] con filtro de 405nm, se dejo reaccionar por 15min y se tomo la lectura con el mismo filtro. La diferencia de lecturas se empleo para el analisis de los resultados. Para determinar los niveles de ACH in, la metodologia fue similar a la anterior, a diferencia que en la solucion de ATCH se agregaron 25mg de Naled como inhibidor.

Analisis de los resultados

Con las absorbancias de cada enzima se realizo una distribucion de frecuencias, donde la absorbancia fue la variable y la frecuencia el numero de muestras de gorgojos. Se establecio el umbral de resistencia, con los valores maximos obtenidos de la linea T-s y se determino la proporcion de resistencia. Por ultimo, se realizo un ANVA de clasificacion simple y una prueba de separacion de medias Tukey (P= 0,05), utilizando el programa SAS system for Windows ver 9.0 (SAS, 2002), para determinar las diferencias en la actividad enzimatica de las poblaciones. Asi mismo se calculo la frecuencia de individuos resistentes en cada poblacion utilizando la ecuacion de Hardy-Weinberg, asumiendo que la poblacion estaba en equilibrio genetico.

Resultados

En la Tabla I se puede observar que las muestras de 1 a 3 gorgojos presentan cantidad de proteina elevada, que sobrepasan el intervalo de proteina requerido (60 a 140 [micro]g). La muestra de tres gorgojos, muestra valores que sobrepasan el rango lineal del metodo. Las muestras con 0,2 a 0,5 gorgojos son las que presentan valores dentro del intervalo apropiado, por lo que se seleccionaron 0,5 gorgojos para trabajar por muestra, ya que presenta valores de proteina mas altos, estables y evita la variabilidad de resultados.

En la Tabla II se presentan los valores maximos de absorbancia obtenidos para cada una de las poblaciones, asi como el numero de muestras que superaron el umbral de tolerancia. Como puede observarse, los valores maximos de absorbancia para la linea susceptible (L-s) fueron de 0,0437; 0,5421; 1,1377; 2,6433; 0,0457 y 0,2527 para las enzimas ACE, ACE-in, [alpha]ET, [beta]EST, GST y Ox, respectivamente, valores que se toman para establecer los umbrales de resistencia. Para la linea A1 las enzimas que superaron el umbral de resistencia fueron [alpha]ET, [beta]EST y Ox con 30, 48 y 36 muestras respectivamente (Tabla II). Asi mismo la frecuencia genica mostro valores de 0,18; 0,31 y 0,22 (Tabla III) para estas mismas enzimas. Para la linea NL1, las enzimas [alpha]ET y [beta]EST superaron el umbral de resistencia con 12 y 24 muestras (Tabla II); ademas, obtuvieron frecuencia genica de 0,06 y 0,14 (Tabla III). Para la linea C1 12, 6, 18 y 12 muestras superaron el umbral de resistencia de las enzimas ACE, [alpha]ET, [beta]EST y Ox, respectivamente (Tabla II), con frecuencias de 006; 0,03; 0,10 y 0,06 para dichas enzimas. Finalmente, para la linea T1 los valores maximos de absorbancia oscilaron entre 0,0458 y 3,2573, superando el umbral de resistencia las enzimas ACE, [alpha]ET, [beta]EST y Ox con 18, 12, 36 y 30 muestras (Tabla II) y frecuencias de 0,10; 0,06; 0,22 y 0,18.

En la linea A1 las enzimas que presentaron los mayores valores fueron [alpha]ET, [beta]EST y Ox, con un 33,3; 53 y 40% de la poblacion que superan el umbral de resistencia (Figura 1). Para la linea NL1 (Figura 2) la enzima que presento el mayor porcentaje de la poblacion que supero el umbral de resistencia fue la [beta]EST con un 26,6%. En relacion a la linea C1 (Figura 3) fue la [beta]EST con un 20% y, finalmente, para la linea T1 (Figura 4) fueron las enzimas ACE, [beta]EST y Ox con 20; 40 y 33,3% de la poblacion que supero el umbral de resistencia.

Discusion

En relacion al contenido de proteina las muestras de 1 a 3 gorgojos presentaron un elevado contenido de proteina, sobrepasando el intervalo de proteina requerido, por lo que fueron descartadas para el estudio. Al respecto, Bradford (1976) menciona que valores fuera del intervalo no son confiables para la cuantificacion de proteina en tejidos y fluidos. De este modo, las muestras con 0,2 a 0,5 gorgojos fueron las que presentaron los valores dentro del intervalo apropiado, por lo que se selecciono 0,5 gorgojos para trabajar por muestra en este estudio. Al respecto, Dary et al. (1990) mencionan que existe estrecha relacion entre tamano de muestra y cantidad de proteina, por lo que se pueden presentar diferencias en los resultados obtenidos y la cantidad de proteina es utilizada para corregir la actividad enzimatica en base al tamano y etapa de desarrollo de los organismos de prueba.

La enzima mas frecuente en las cuatro poblaciones de campo fue [beta]EST, con 53; 26,6; 20 y 40% de las poblaciones A1, NL1, C1 y T1 superando el umbral de resistencia. Al respecto, Lagunes y Villanueva (1994) mencionan que los insecticidas usados convencionalmente en el control de plagas de granos almacenados son insecticidas organofosforados, carbamicos y piretroides, los cuales son altamente susceptibles al ataque de enzimas esterasas, provocando en las poblaciones de insectos el incremento de esterasas como mecanismo detoxificativo de los plaguicidas.

El segundo grupo de enzimas que presento los valores mas altos fueron las Ox, con valores de 40 y 33,3% de las poblaciones A1 y T1, que superaron el umbral de resistencia. Pimentel et al. (2008) mencionan que las oxidasas juegan un papel fundamental en la detoxificacion de diversos compuestos de plaguicidas, participando directamente en la inhabilitacion del producto u oxidandolo para que entren otros sistemas enzimaticos y puedan ser detoxificados (Benhalima et al., 2004). Varios autores reportan a las enzimas GST, ACE y ACE-in como causa de resistencia en especies de insectos (Dauterman, 1983). Sin embargo, en el presente estudio estos sistemas fueron los menos relevantes. Finalmente cabe mencionar que esta tecnica es una herramienta muy eficaz para estudios de resistencia a plaguicidas, al proporcionarnos el mecanismo responsable y la frecuencia de la resistencia en la poblacion. Al respecto, Reidy et al. (1990) reportan una alta correlacion de niveles elevados de enzimas con la resistencia a plaguicidas.

Conclusion

La linea de campo A1 fue la que presento los niveles, frecuencias y porcentajes mas altos en todas las enzimas detoxificativas. Los sistemas enzimaticos responsables de la generacion de la resistencia en la mayoria de las poblaciones en estudio fueron las esterasas y oxidasas.

Recibido: 12/06/2013. Modificado: 29/09/2014. Aceptado: 01/10/2014.

Ernesto Cerna Chavez. Doctor en Parasitologia, Agricola, Universidad Autonoma Agraria Antonio Narro (UAAAN), Mexico. Profesor Investigador, UAAAN, Mexico. Asesor, Berni Labs S.A de C.V, Mexico.

Yisa Maria Ochoa Fuentes. Doctora en Parasitologia Agricola, UAAAN, Mexico. Profesora Investigadora, UAAAN, Mexico. Direccion: Departamento de Parasitologia, UAAAN. Buenavista, Saltillo, Coahuila, Mexico. C.P. 25315. e-mail: yisa8a@ yahoo.com

Santiago Perez Ocampo. Maestro en Ciencias en Parasitologia Agricola, UAAAN, Mexico. Alumno del postgrado en Parasitologia Agricola, UAAAN, Mexico.

Jeronimo Landeros Flores. Doctor en Doctor en Ciencias, Instituto Tecnologico de Estudios Superiores de Monterrey, Mexico. Profesor Investigador, UAAAN, Mexico.

REFERENCIAS

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TABLA I

ABSORBANCIAS Y CONCENTRACION DE
PROTEINA EN HOMOGENATOS DE TRIBOLIUM
CASTANEUM EN DILUYENTE BUFFER DE FOSFATO (PH: 7.2)

Concentracion       Absorbancia        mg/ml de   [micro]g de
                                       proteina    proteina

0,1             0,659 [+ or -] 0,015   -0,100 *       --
0,2             0,789 [+ or -] 0,018    0,030       68,640
0,3             0,832 [+ or -] 0,020    0,080       99,816
0,4             0,857 [+ or -] 0,022    0,093       115,039
0,5             0,889 [+ or -] 0,034    0,106       140,113
1,0             0,992 [+ or -] 0,37     0,380       215,800
2,0             1,126 [+ or -] 0,031    0,402       312,937
3,0             1,330 [+ or -] 0,043   0,528 *        --

Intervalo lineal: 0,050-0,500 (* Valor no
confiable, fuera del intervalo lineal).
Tukey (P = 0,05).

TABLA II

NIVELES MAXIMOS DE ABSORBANCIA ([+ or -] DESV. EST.) PARA CADA ENZIMA
DE LAS POBLACIONES DE TRIBOLIUM CASTANEUM DE AGUASCALIENTES
(A1 NUEVO LEON (NL1) COAHUILA (C1) Y TAMAULIPAS (T1), Y NUMERO DE
MUESTRAS QUE SUPERAN EL UMBRAL DE TOLERANCIA

                          Absorbancia

Enzima                    Linea susceptible

Acetilcolinesterasa       0,0437 (&) [+ or -] 0,0012
Acetilcolinesterasa       0,5421 (&) [+ or -] 0,0076
  insensible
[alpha]-esterasa          1,1377 (&) [+ or -] 0,0849
[beta]-esterasa           2,6433 (&) [+ or -] 0,1048
Glutation S-transferasa   0,0457 (&) [+ or -] 0,0051
Oxidasa                   0,2527 (&) [+ or -] 0,0132

                          Absorbancia

Enzima                    Linea A1                   N

Acetilcolinesterasa       0,0754 [+ or -] 0,0126     18 (+)
Acetilcolinesterasa       0,0690 [+ or -] 0,0135     6 (+)
  insensible
[alpha]-esterasa          1,4753 [+ or -] 0,0191     30 (+)
[beta]-esterasa           3,5104 [+ or -] 0,1324     48 (+)
Glutation S-transferasa   0,0475 [+ or -] 0,0066     18 (+)
Oxidasa                   0,3103 [+ or -] 0,0,0649   36 (+)

                          Absorbancia

Enzima                    Linea NL1                N

Acetilcolinesterasa       0,0443 [+ or -] 0,0016   0
Acetilcolinesterasa       0,0560 [+ or -] 0,0121   0
  insensible
[alpha]-esterasa          1,2347 [+ or -] 0,081    12 (+)
[beta]-esterasa           3,341 [+ or -] 0,0824    24 (+)
Glutation S-transferasa   0,0460 [+ or -] 0,0086   6 (+)
Oxidasa                   0,2544 [+ or -] 0,0649   0

                          Absorbancia

Enzima                    Linea C1                 N

Acetilcolinesterasa       0,0531 [+ or -] 0,0028   12 (+)
Acetilcolinesterasa       0,0556 [+ or -] 0,061    0
  insensible
[alpha]-esterasa          1,2473 [+ or -] 0,0719   6 (+)
[beta]-esterasa           3,341 [+ or -] 0,0824    18 (+)
Glutation S-transferasa   0,0460 [+ or -] 0,0086   0
Oxidasa                   0,2783 [+ or -] 0,0837   12 (+)

                          Absorbancia

Enzima                    Linea T1                   N

Acetilcolinesterasa       0,0583 [+ or -] 0,0083     18 (+)
Acetilcolinesterasa       0,0539 [+ or -] 0,023      0
  insensible
[alpha]-esterasa          1,2254 [+ or -] 0,0264     12 (+)
[beta]-esterasa           3,2573 [+ or -] 0,0424     36 (+)
Glutation S-transferasa   0,0458 [+ or -] 0,0076     0
Oxidasa                   0,3063 [+ or -] 0,0,0467   30 (+)

(+) Numero de muestras que superaron el umbral de tolerancia.
& Umbral de tolerancia para cada enzima.

TABLA III VALOR DE FRECUENCIA GENICA PARA LOS MECANISMOS
ENZIMATICOS DE LAS DIFERENTES POBLACIONES DE TRIBOLIUM
CASTANEUM

Enzima                                  Poblacion

                                 A1     NL1    C1     T1

Acetilcolinesterasa              0,10   0      0,06   0,10
Acetilcolinesterasa insensible   0,03   0      0      0
[alpha]-esterasa                 0,18   0,06   0,03   0,06
[beta]-esterasa                  0,31   0,14   0,10   0,22
Glutation S-transferasa          0,10   0,03   0      0
Oxidasa                          0,22   0      0,06   0,18
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Author:Chavez, Ernesto Cerna; Fuentes, Yisa M. Ochoa; Ocampo, Santiago Perez; Flores, Jeronimo Landeros
Publication:Interciencia
Date:Oct 1, 2014
Words:3797
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