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Purificacion y caracterizacion de lipopolisacaridos de Eikenella corrodens 23834 y Porphyromonas gingivalis W83.

Purification and characterization of lipopolysaccharide from Eikenella corrodens 23834 and Porphyromonas gingivalis W83

Introduccion

Estudios epidemiologicos han encontrado una asociacion de riesgo entre enfermedades infecciosas, como la periodontitis, con enfermedad cardiovascular (Elkaim et al., 2008; Kebschull, Demmer, y Papapanaou, 2010). Se ha propuesto que esto sucede por el paso de bacterias viables y su degradacion en plasma, con la posterior liberacion de Lipopolisacaridos o endotoxinas (LPS), induciendo la secrecion de citoquinas, las cuales han sido ampliamente involucradas en los procesos de enfermedad cardiovascular (Lafaurie et al., 2007; Marchesan et al., 2012; Pussinen et al., 2007). Sin embargo, aun falta evidencia clinica e investigativa que sustente este hecho (Thomopoulos et al., 2011).

Dentro de los factores de virulencia presentes en las bacterias Gram negativas se encuentran los LPS, polisacaridos de capsula, fimbrias, hemaglutininas y proteasas (Curtis et al., 2005). Los LPS inducen respuestas inflamatorias sistemicas en el hospedero que pueden estar relacionadas con riesgo cardiovascular aterosclerotico (Kallio et al., 2008; Pussinen et al., 2007; Wiedermann et al., 1999).

Las bacterias Gram negativas sintetizan formas diversas de LPS denominadas Liso (S: smooth) y Rugoso (R: rough). LPS-S consiste de cadenas O-polisacaridas, que estan constituidas de unidades repetidas de oligosacaridos, el nucleo de oligosacaridos y una region altamente conservada denominada el lipido A. Los LPS-R carecen de la cadena especifica O y esta conformada solo del nucleo de oligosacaridos y el lipido A. Existen cinco clases principales de LPS-R (Ra-Re) segun la disminucion en la constitucion del nucleo de oligosacaridos (Raetz, y Whitfield, 2002). Los LPS-SR son aquellos que contienen el antigeno O pero en un menor grado de composicion de polisacaridos (Hitchcock, y Brown, 1983). A pesar de las diferencias en estructura quimica y propiedades fisicoquimicas, los diferentes quimiotipos de LPS actuan como endotoxinas debido a que todos contienen la region del lipido A, la cual alberga el potencial de actividad biologica sobre las celulas.

Porphyromonas gingivalis es uno de los principales microorganismos que causa la progresion y severidad de la enfermedad periodontal. Es una bacteria anaerobia Gram negativa con forma de bacilo corto, que metaboliza principalmente peptidos y azucares como fuente de energia (Lamont y Jenkinson, 1998). E. corrodens es un cocobacilo Gram negativo anaerobio facultativo de crecimiento dificil, habitante normal de la cavidad oral, con caracter de agente patogeno oportunista que se ha asociado con infecciones orales y no orales usualmente como parte de un consorcio microbiano (Jaramillo et al., 2006). E. corrodens esta presente en placa subgingival de pacientes con enfermedad periodontal (Mayorga-Fayad et al., 2007), y pertenece al grupo de las HACEK que ocasiona al menos el 1,4 % de las endocarditis infecciosas (Posch et al., 2013).

Recientes estudios han identificado acidos nucleicos de E. corrodens y P. gingivalis en lesiones ateroscleroticas de individuos con enfermedad cardiovascular y periodontitis (Padilla et al., 2007). Sin embargo, tambien se encuentran en venas saludables (Elkaim et al., 2007); por lo que no es claro el papel que desempenan estos microorganismos en la induccion de enfermedades cardiovasculares. Cuando se relaciona un microorganismo con determinadas entidades clinicas se deben establecer los componentes por medio de los cuales es capaz de producir la enfermedad; es decir, los mecanismos de patogenia que se relacionan en forma directa con sus elementos estructurales, interacciones entre la misma especie y la presencia de un consorcio microbiano, lo que sera util no solo para establecer si este microorganismo es realmente el agente causal de la enfermedad, sino tambien para aplicar una terapeutica eficaz (Jaramillo et al., 2006).

Varios metodos se han reportado para la extraccion de LPS que van desde la utilizacion de fenol, trizol, etanol-Mg[Cl.sub.2], butanol (Darveau, Hancock, 1983; Galanos et al., 1969; Morrison, Leive, 1975; Wu et al., 1987). Sin embargo, el metodo mas utilizado es el de Westphal que utiliza el fenol en agua caliente para extraer los LPS de tipo R o S, con un bajo contenido de proteinas (Apicella, 2008; Darveau, & Hancock, 1983; Westphal, and Jann, 1965). Estos metodos de extraccion siguen vigentes en los procesos de purificacion de LPS (Posch et al., 2013).

Cuando se requiere valorar el potencial que tienen los LPS en inducir respuestas celulares especificas se necesita de procesos de purificacion mas rigurosos para eliminar posibles contaminaciones por otros factores de virulencia presentes en las bacterias Gram negativas (Curtis et al., 2005; Hirschfeld, 2000). La presencia de acidos nucleicos o proteinas que forman complejos fuertes cuando se realiza el metodo convencional con fenol deben ser valorados en los procesos de purificacion de LPS (Perdomo, Rolando, 2006). En el presente estudio se implementa una metodologia para la obtencion de LPS de elevada pureza utilizando tecnicas convencionales previamente descritas para la extraccion, purificacion y caracterizacion de LPS de bacterias periondo-patogenas, cuyos LPS no han sido anteriormente descritos en terminos de sus caracteristicas bioquimicas.

Materiales y metodos

Cultivo celular bacteriano. Las bacterias de referencia Eikenella corrodens ATCC 23834 fueron adquiridas en la American Type Culture Collection y cultivadas en Laboratorio de Microbiologia Oral de la Universidad El Bosque. Las cepas W83 de P. gingivalis y ATCC 23834 de E. corrodens fueron sembradas en agar Brucella (BBL Microbiology Systems, Cockeysville, Md.) enriquecido con 0,3% p/v de Bacto agar, 0,2% p/v de extracto de levadura, 5% v/v de sangre de cordero desfibrinada, 0,2% v/v de sangre hemolizada, 0,0005% p/v de hemina y 0,00005% p/v de menadiona e incubada en atmosfera de anaerobiosis con 9-13% de C[O.sub.2] a concentraciones por debajo del 1% de oxigeno (Anaerogen, Oxoid, Hampshire, England) a 36[grados]C durante 7 dias. Posteriormente, se observaron las caracteristicas macroscopicas de las colonias y se realizaron pruebas bioquimicas con el fin de confirmar la pureza del cultivo.

Porphyromonas gingivalis se confirmo con la prueba de luz ultravioleta negativa y la prueba de CAAM positiva (NCBZ-GLY-GLY-ARG clorhidrato de 7-amido-4-metil coumarina, para la deteccion de enzimas tipo tripsina), E. corrodens fue confirmada por la presencia de oxidasa, y la ausencia de catalasa y motilidad, asi como el uso de sistemas de identificacion comercial Rapid ANA II (RemelTM, Apogent). Se realizo una resiembra masiva de P. gingivalis con el fin de obtener 1,1 g de bacteria completa. Las colonias de E. corrodens fueron suspendidas en caldo ToddHewitt (Jaramillo et al., 2006), se incubaron en condiciones de anaerobiosis durante 7 dias con el fin de obtener 3,5 g de la bacteria. Pasado el tiempo de incubacion se confirmo la pureza del cultivo, se recogio la totalidad de las colonias presentes en el cultivo se pasaron a un tubo Falcon[R] esteril previamente pesado con el fin de conocer el peso seco de la bacteria. La purificacion del LPS se realizo una vez se comprobo la pureza de la bacteria. Las bacterias se conservaron a -80[grados]C hasta la purificacion del LPS.

Purificacion de LPS de E. corrodens ATCC 23834. El procedimiento de extraccion y purificacion de LPS de E. corrodens se realizo segun lo reportado por Gualtero y cols., (2008). La caracterizacion de este LPS se realizo como se describe mas adelante.

Extraccion de lipopolisacaridos con fenol acuoso a partir de bacteria completa de Porphyromonas gingivalis W83. A partir de 1.1 g de bacteria completa en 5.5 mL de agua USP se realizo la extraccion con 18 mL de fenol al 90 % v/v y 18 mL de agua USP, incubando 10 min a 68[grados]C en agitacion a 175 rpm (SHAKER BATH marca LaB-Line) e inmediatamente llevando a bano de hielo por 30 min. Posteriormente se centrifugo a 5000 g por 20 min a 6[grados]C, recuperando la fase acuosa. La fase fenolica fue de nuevo sometida a re-extraccion dos veces mas. Para eliminar las trazas de fenol en la fase acuosa se llevo a cabo una dialisis con membrana de tamano de poro 10 kDa (SnakeSkin[TM].Thermo Scientific, USA) en 1 L de agua esteril grado I (Direct-Q3., Millipore) a 4[grados]C y con cambio de agua cada 8 horas por 3 dias. El extracto obtenido fue centrifugado a 10000 g por 20 min, y al sobrenadante separado se le adiciono acetato de sodio a una concentracion final 0.1 5 M. Para inducir precipitacion se coloco la solucion en bano de hielo, se adiciono etanol 96 % v/v gota a gota en agitacion constante a una proporcion 1:4 (muestra:etanol) con respecto a la cantidad de extracto resultante. La solucion fue almacenada durante 24 h a -20[grados]C para continuar con el proceso de precipitacion. Posteriormente se centrifugo a 4000 g por 5 min a 4[grados]C, eliminando el sobrenadante y se determino la masa del precipitado obtenido. Finalmente, se reconstituyo el precipitado en agua USP a una concentracion final de 25 mg/mL y se liofilizo durante 24 h (HETO POWER DRY LL3000, Bomba Thermo Savant).

Purificacion de lipopolisacaridos de bacteria Porphyromonas gingivalis W83. El procedimiento de purificacion de LPS consistio en un tratamiento enzimatico del extracto crudo, seguido de una separacion por cromatografia de exclusion por tamano.

Tratamiento enzimatico del extracto crudo de Porphyromonas gingivalis W83. El procedimiento de digestion con nucleasas se realizo segun lo reportado por Perdomo, & Rolando (2006). El extracto liofilizado se suspendio en 5 mL de buffer Tris 0.1 M-NaCl 0.15 M, pH 7.5, a una concentracion final de 2,6 mg/mL. Se tomo una alicuota de 650 [micron]L para analisis por espectrofotometria (BioRad, SamartSpec[TM] Plus. 200 nm-400 nm). Consecutivamente se adiciono 500 [micron]L de ribonucleasa A 0.5 mg/mL, 50 [micron]L de desoxirribonucleasa 1 0.05 mg/mL, 100 [micron]L de cloruro de magnesio 4 mM y se incubo a 60[grados]C durante 3 h. Posteriormente se adiciono 100 [micron]L de proteinasa K 0.05 mg/mL, 100 [micron]L de cloruro de calcio 1 mM incubando a 37[grados]C por 18 horas, se realizo dialisis y se liofilizo como se explico anteriormente. Luego de cada proceso de digestion enzimatica se tomo una alicuota para analizar su perfil espectrofotometrico.

Cromatografia de exclusion por tamano. El liofilizado fue reconstituido a una concentracion final de 5 mg/ mL en 1 mL de buffer Tris 0.05 M HCl, 1.5 % p/v deoxicolato de sodio, EDTA 1 mM pH 9.5 y se adiciono a una columna para cromatografia de exclusion por tamano (GE Healthcare HiPrep[TM] 16/60 Sephacryl[TM] S-200 HR) previamente equilibrada con 200 mL del buffer mencionado. Se colectaron fracciones de 2.5 mL (Fraction Collector Bio-Rad Model 2110) a una velocidad de flujo de 0.5 mL/min y se analizaron a 220 nm, 260 nm y 280 nm por espectrofotometria. Las fracciones de interes se determinaron en los picos o regiones con absorbancias mas altas; posteriormente se realizo una precipitacion con cloruro de sodio a una concentracion final de 0.15 M, se agrego un volumen de etanol al 95 % cuatro veces mayor que el volumen de la fraccion, a continuacion se almacenaron las fracciones a -20[grados]C durante 24 horas y luego se realizo la dialisis y se liofilizo. Se determino la masa del liofilizado y se reconstituyo en agua USP a una concentracion de 1 mg/mL, para su posterior caracterizacion.

Caracterizacion de lipopolisacaridos de bacterias periodonto-patogenas. Los extractos purificados fueron caracterizados bioquimicamente por electroforesis SDS-PAGE, el test colorimetrico Purpald, y el test cromogenico de LAL.

Electroforesis SDS PAGE. Se preparo el gel de separacion al 12 % y el gel de concentracion al 4% (Mini-PROTEAN[R] Tetra Cell. BioRad, USA). Se sembro 5 [micron]g de lipopolisacarido de Porphyromonas gingivalis W83 y Eikenella corrodens ATCC 23834 en buffer Laemmli. Tambien se sembraron como controles lipopolisacaridos comerciales de: Porphyromonas gingivalis ATTC 33277 (InvivoGen cat.#tlrl-3pelps), Rhodobacter sphaeroides DSM 158 (InvivoGen cat.#tlrl-rslps), Escherichia coli 0111:B4 (InvivoGen cat.#tlrl-3pelps), Escherichia coli 0127:B8 (Sigma cat.#L3129), Salmonella typhimurium ATCC 7823 (Sigma cat.#L7261). El gel de concentracion se corrio 45 minutos a 0.02 A; el gel de separacion se corrio 1 h:30 min a 0.03 A. El proceso de tincion se realizo segun lo reportado por Tsai, Frasch, (1982).

Identificacion de LPS en los extractos purificados por el ensayo Purpald. El ensayo de Purpald para la identificacion de LPS en los extractos purificados de P. gingivales W83 y E. corrodens 23834 fue realizado segun lo reportado por Lee & Tsai, (1999). Inicialmente se prepararon diluciones de KDO (acido 2-ceto-3-desoxioctulosonico) de concentracion 0.8 mM, 0.4 mM, 0.2 mM, 0.1 mM, 0.05 mM y 0.025 mM. Para lipopolisacaridos comerciales se prepararon concentraciones de 0,5 de: Salmonella tiphymurium ATCC 7823 (Sigma), P. gingivalis ATTC 33277 (Invivogen), Rhodobacter sphaeroides DSM 158 (Invivogen) E. coli 0111:B4 (Invivogen); y para E. coli 0127:B8 (Sigma) fue de 0.23 mg/mL. Con respecto a los LPS purificados de P. gingivalis W83 y de E. corrodens 23834 se prepararon a una concentracion de 0.01 mg/mL. El blanco utilizado fue agua USP. Los datos fueron reportados en unidades de concentracion milimolar (mM), teniendo en cuenta la transformacion de datos de absorbancia con la curva de concentracion conocida de KDO, lo que permitio la identificacion del LPS y la cuantificacion de KDO presente en las muestras analizadas.

Determinacion de la capacidad endotoxica de los extractos purificados por LAL cromogenico. La prueba LAL (Lisado de amebocitos de Limulus) es una prueba sensible y especifica para la identificacion de endotoxinas. Para la cuantificacion se utilizo un kit LAL cromogenico con diazoacoplamiento (Pyrochrome, Cape Cod, USA) con una sensibilidad de 0,005 U.E/ mL, segun las recomendaciones del fabricante. Se sembraron en una microplaca de 96 pozos (certificada libre de pirogenos, Dynex) las siguientes muestras: blanco (agua libre de pirogenos), curva de control de endotoxina estandar (CSE) de concentraciones 5 U.E/ mL, hasta 0,078 U.E/mL, dilucion 1:2 y las muestras de LPS a diferentes concentraciones. Se adiciono 50 [micron]L de reactivo LAL pyrochrome suspendido en 3,2 mL de buffer Glucashield (inhibidor de beta glucanos) y se incubo a 37[grados]C durante 25 minutos. Las absorbancias fueron registradas en un lector espectrofotometrico de microplacas a longitudes de onda de 570 nm. Cada una de las muestras fue valorada por duplicado y los datos fueron reportados como unidades de endotoxina por mililitro (U.E/mL) a partir de la transformacion de datos de absorbancia de la curva de concentracion conocida del CSE.

Resultados y discusion

Los cultivos de P. gingivalis W83 y E. corrodens ATCC 23834 se confirmaron por morfologia de las colonias con ayuda del microscopio estereoscopico a 4,5 aumentos y con pruebas bioquimicas previamente mencionadas las cuales resultaron concordantes con las bacterias evaluadas. La morfologia del cultivo de E. corrodens es caracteristica de colonias tipo 2 (Figura 1A). Las colonias son circulares con un margen irregular y un diametro menor a 3mm. La colonia contiene un perimetro rugoso, opaca no reflejada y un centro umbonado humedo que parece hundirse dentro del agar, como ha sido reportado por Chen, Wilson, (1990).

Las colonias de P. gingivalis en agar Brucella suplementado se observan despues de la incubacion como colonias oscuras que pueden ir desde un marron claro hasta negro despues de mas de 7 dias de incubacion, son convexas con forma de domo brillantes (Figura 1B).

Purificacion de lipopolisacaridos. A partir de un peso humedo de bacteria completa para P. gingivalis y E. corrodens se obtuvo un rendimiento porcentual del 0,7% p/p y 0,02 % p/p, respectivamente (tabla 1). Esto indica que el proceso de extraccion y purificacion de LPS para P. gingivalis fue mas eficiente.

El proceso de purificacion se realizo con tratamiento enzimatico por nucleasas y proteasas. Posteriormente los extractos crudos eran purificados por cromatografia de exclusion molecular con una matriz de Sephacryl S-200 HR y una fase movil de buffer de deoxicolato de sodio. El perfil cromatografico a diferentes longitudes de onda (220, 260 y 280 nm) para los extractos de P. gingivalis y E. corrodens se observan en la figura 2. Para el extracto de E. corrodens se observa un solo pico a un volumen de elucion entre 50-70 mL aproximadamente (figura 2A). De igual manera se observa para el extracto de P. gingivalis pero a diferente volumen de elucion (80-120 mL, figura 2B). El cromatograma de P. gingivalis indica que el tratamiento enzimatico fue mucho mas efectivo en reducir contaminacion por acidos nucleicos y proteinas que para el de E. corrodens. Las lecturas de absorbancia a 220 nm se hacen para LPS debido a que el deoxicolato absorbe a la misma longitud de onda (200 nm).

El efecto del tratamiento enzimatico para los extractos de P. gingivalis se siguio por barrido espectrofotometrico 200-400 nm como fue reportado por Perdomo, Rolando, (2006), figura 3. Se observa como el tratamiento enzimatico para degradar RNA, DNA y proteinas permite la depuracion del extracto (figuras 3A-3D). Se identifican 2 picos de maxima absorcion: el primero a los 223 nm, cercano al espectro de absorcion de LPS y el segundo cercano a los 260 nm, lo que sugiere una contaminacion por presencia de acidos nucleicos (figuras 3C y 3D). Luego de la cromatografia de exclusion molecular, esta contaminacion se reduce observando-se un solo pico (figura 4). Estos resultados concuerdan con lo reportado por otros investigadores, quienes observaron que el principal contaminante luego de la extraccion con fenol son los acidos nucleicos y en menor proporcion por proteinas (Perdomo y Rolando 2006; Yi y Hackett, 2000). Ademas la cromatografia de exclusion molecular con Sephacryl S 200 HR junto con el deoxicolato como fase movil, permiten aun mas la elucion de impurezas que se asocian comunmente a LPS en membranas, como ha sido previamente reportado (Gualtero y cols., 2008; Shands and Chun, 1980; Wu et al., 1987).

[FIGURA 1 OMITIR]

Luego de la cromatografia las fracciones de interes fueron recolectadas y sometidas a eliminacion del deoxicolato por precipitacion con NaCl y Etanol. El extracto de E. corrodens precipito adecuadamente mientras que el de P. gingivalis no, por lo que se debio realizar una evaporacion, seguida de dialisis y liofilizacion. El precipitado del extracto de E. corrodens fue suspendido en agua LWR, dializado y liofilizado. Se obtuvieron 0,8 mg de E. corrodens y 7,6 mg de P. gingivalis (tabla 1). Estos resultados indican que el proceso de purificacion fue mas eficiente para P. gingivalis que para E. corrodens. Probablemente la precipitacion con NaCl no es eficiente para volver insoluble la muestra en la solucion. Con respecto a la precipitacion de P. gingivalis, se realizaron ademas pruebas con acetato de sodio (1M) como agente caotropico, sin embargo tampoco indujo precipitacion (datos no mostrados). Los rendimientos obtenidos en la purificacion de LPS con el metodo de extraccion con fenol son esperados que esten por debajo del 2% p/p, y aunque nuestros resultados estan por debajo de este valor estos puede deberse a que la bacteria completa fue pesada humeda y no liofilizada. Actualmente nuevos enfoques estan siendo implementados para mejorar el rendimiento de purificacion de LPS a un 3%, sin embargo siguen siendo bajos (Rybka et al., 2008).

[FIGURA 2 OMITIR]

Los liofilizados fueron reconstituidos en agua LWR a una concentracion de 1mg/mL y analizados por barrido espectrofotometrico (figura 4). Se registro los picos maximos de absorcion a los 201 nm y 210 nm para P. gingivalis y E. corrodens, respectivamente que corresponde a la longitud de onda a la que absorben los LPS (Figura 4A y 4B). En ambos extractos no se registran picos a 260 y 280 nm, lo que sugiere que los extractos no contienen acidos nucleicos y proteinas de consideracion.

Caracterizacion de lipopolisacaridos a partir de extractos purificados. Los extractos purificados fueron sometidos a un proceso de caracterizacion bioquimica mediante electroforesis SDS PAGE, Purpald y test LAL.

El perfil electroforetico permite definir el quimiotipo del LPS (figura 5). Los LPS de tipo liso se presentan en forma de bandas sucesivas en escalera y aquellos que son de tipo semi-rugoso o rugoso pueden presentar bandas de menor peso o la ausencia completa del perfil en escalera (Tsai, Frasch, 1982; Wang et al., 2010).

Los lipopolisacaridos comerciales de E. coli y S. typhimurium presentan un perfil caracteristico de LPS-S (liso), con bandas desde 66 a 14 kDa (carril 2-4, figura 5). El extracto purificado de E. corrodens presenta un perfil caracteristico de LPS-S (carril 8). Por otro lado en el perfil del LPS comercial de R. sphaeroides hay ausencia de un patron en escalera, pero si se observa una banda de bajo peso molecular por debajo de los 21 kDa. Este perfil es caracteristico de LPS-R (rugosos), donde hay ausencia del antigeno O en la region polisacarido del LPS (Hitchcock & Brown, 1983). Un perfil similar tambien fue observado en el extracto purificado de P. gingivalis W83, con bandas tenues de bajo peso molecular (carril 7), lo que indica la presencia de LPS-SR (semi-rugoso).

Estos resultados son similares a los reportados previamente por Progulske y Holt, (1984) para LPS de E. corrodens de la cepa 23834. En ese estudio la extraccion la hicieron a partir de bacteria completa con fenol-agua caliente y la purificacion fue realizada por tratamiento enzimatico con nucleasas y proteasas sin un procedimiento de separacion de impurezas como la cromatografia o centrifugacion. La caracterizacion del quimiotipo del LPS fue hecha por SDS-PAGE identificando la presencia de LPS-S en los purificados. A diferencia del estudio de Progulske & Holt, con la metodologia implementada en este estudio se logro obtener LPS de elevada pureza libre de contaminantes como acidos nucleicos y proteinas. En lo revisado en la literatura hasta el momento no existen estudios similares que determinen las propiedades bioquimicas y endotoxicas del LPS de E. corrodens.

Igualmente, no se han encontrado hasta el momento reportes en la literatura que describan las propiedades bioquimicas y endotoxicas de LPS de P. gingivalis W83. En un estudio realizado por Sismey-Durrant, Hopps, (1991), utilizo LPS de W83 para estimular fibroblastos in vitro. Sin embargo en ese estudio no se realizo una metodologia que permitiera obtener LPS de elevada pureza asi como tampoco se hizo la respectiva caracterizacion del purificado. El uso de metodos de extraccion y purificacion de LPS son un aspecto clave en la generacion de extractos libres de impurezas que permitan su posterior uso en estudios en modelos celulares o in vivo (Hirschfeld et al., 2000; Posch et al., 2013)

La caracterizacion bioquimica del quimiotipo de LPS de P. gingivalis a partir de las cepas W83 y 33277 sugieren que estas cepas presentan diferencias en los procesos de biosintesis de polisacaridos presentes en la region del antigeno O de los LPS, como ha sido reportado para la cepa W50 de P. gingivalis, observandose dos tipos de LPS, LPS-O y LPS-A con diferencian en la region polisacarida (Rangarajan et al., 2008). Debido a la importancia de estas moleculas como factores de virulencia, variaciones estructurales del LPS pueden estar relacionadas con procesos de evasion o atenuacion del sistema inmune del hospedero (Matsuura M, 2013).

[FIGURA 3 OMITIR]

Para verificar la presencia de proteinas en los extractos purificados, se realizo una electroforesis SDS-PAGE y posteriormente tenido con PageBlue (ThermoScientific, USA), que utiliza Comassie G-250 para la tincion de proteinas (figura 6).

En las diferentes muestras, a excepcion de la muestra del carril 8 (LPS P. gingivalis W83), se observa una banda con un peso aproximado de 45 kDa (figura 6). Se observa con diferente intensidad en LPS comerciales que han sido purificados por diferentes metodos, segun lo reportado en sus insertos (ver numero de catalogo en metodologia), carriles 3-6. Incluso se observa esta banda en el LPS de E. coli 0111-B4 de InvivoGen[R] (cat.#tlrl-3pelps), el cual es ultrapurificado con fenoltrietilamina-deoxicolato (carril 3). Tambien se observan otra banda en el LPS comercial de S. typhimurium entre los 31 a 21 kDa (carril 4). Por el contrario, esta banda se observa en menor intensidad en los extractos purificados de E. corrodens (carril 10), P. gingivalis W83 (carril 7), y P. gingivalis 33277 (carril 9), obtenidos en este y previos estudios (Gualtero y cols., 2008). Estos resultados sugieren que los LPS obtenidos con la metodologia !molementada en este estudio permite la obtencion de lipopolisacaridos con pureza igual o superior a los obtenidos comercialmente.

[FIGURA 4 OMITIR]

[FIGURA 5 OMITIR]

La presencia de proteinas o lipopeptidos formando complejos con LPS purificados ha sido reconocida y reportada en varios estudios (Hirschfeld et al., 2000; Manthey, Vogel, 1994; Reddi et al., 1995). Sin embargo, el uso de fenol en el proceso de re-purificacion es el que mas elimina este tipo de contaminacion mezclado con otros reactivos como la trietilamina (Hirschfeld et al., 2000; Yi, Hackett, 2000; Wang et al., 2010). Tambien se han propuesto otros protocolos que no utilizan fenol para la re-purificacion de LPS, eliminando los complejos proteinas-LPS asociados utilizando solventes no inflamables (Lin et al., 2005; Tirsoaga et al., 2007). Nosotros utilizamos liofilizado del extracto purificado de P. gingivalis W83 reconstituido en buffer LaemmLi 2X y desnaturalizado por medio de ebullicion posteriormente, observando una disminucion en la senal a la altura de 45 kDa (figura 6, carril 8). Probablemente el complejo LPS-proteina en la muestra fue disociada por la accion denaturante del buffer (LaemmLi, 1970).

Para cuantificar la concentracion de proteina o peptidos presentes en los LPS comerciales y los extractos purificados de E. corrodens 23834 y P. gingivalis W83, se realizo una determinacion por el metodo del acido bicinconinico (Smith et al., 1985), utilizando un kit comercial con una curva estandar de albumina desde 2000 [micron]g/mL a 25 [micron]g/mL (Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit. USA). Las muestras fueron diluidas en agua libre de endotoxinas o con buffer DOC a una concentracion de 400 [micron]g/mL. Por esta metodologia no se logro identificar y cuantificar proteina en ninguna de las muestras (datos no mostrados). Teniendo en cuenta estos resultados contradictorios no podemos asegurar la presencia de contaminacion por peptidos o proteinas en las muestras de LPS comerciales y los extractos purificados. Se requiere de mas experimentacion que nos permita aclarar la naturaleza de las moleculas detectadas con una masa de 45 kDa por electroforesis SDS-PAGE.

Identificacion de LPS en los extractos purificados por el Ensayo Purpald. Los LPS presentan en el nucleo de la region polisacarida, KDO y heptosas caracteristicos en este tipo de glicocongujados (Lee and Tsai, 1999). Mediante el ensayo Purpald se realizo la identificacion de LPS en los extractos purificados de E. corrodens y P. gingivalis (tabla 2). Se observa en los diferentes LPS (comerciales o purificados) que no hay una correspondencia en cuanto a la concentracion de la muestra y la concentracion relativa de LPS en relacion al KDO. Estas diferencias se deben a variaciones en el numero de glicoles vecinales sin sustituir (UTVG) presentes en el KDO y heptosas al interior de cada uno de los LPS analizados (Lee and Tsai, 1999).

De esta manera se identifica la presencia de LPS en los extractos purificados de E. corrodens 23834 y P. gingivalis W83, observandose una mayor concentracion de KDO en P. gingivalis que en E. corrodens, a pesar que fueron colocados a una misma concentracion del extracto en solucion.

[FIGURA 6 OMITIR]

Hasta el momento no se ha determinado a nivel molecular y estructural la region nuclear del LPS para P. gingivalis W83 y E. corrodens 23834. Sin embargo, se ha identificado por espectrometria de masas acoplada a cromatografia de gases (GC-MS), la presencia de KDO en LPS de P. gingivalis y en algunas cepas como W50, la ausencia de heptosas en la region nuclear, con LPS que presentan un quimiotipo liso (Kumada et al., 1993; Paramonov et al., 2009; Rangarajan et al.,). La presencia de KDO y heptosas presentes en LPS de E. corrodens 23834 fue identificada en baja concentracion en estudios previos por el metodo acido tiobarbiturico y de Wright (Progulske and Holt, 1984). Esos resultados concuerdan con los obtenidos en este estudio con el ensayo Purpald.

Por ultimo se determino la capacidad endotoxica de los lipopolisacaridos purificados de E. corrodens y P. gingivalis por la tecnica cromogenica del lisado de amebocitos de Limulus (LAL; Pyrocrome., Cape Code. USA). Esta tecnica es la mas sensible y especifica para la cuantificacion de endotoxinas (Ide et al., 2004; Lindsay et al., 1989; Pussinen et al., 2007). Se observa que los LPS purificados de P. gingivalis W83 y E. corrodens 23834 tienen una mayor actividad endotoxica a bajas concentraciones, similar a las observadas por el LPS de E. coli (tabla 3). Mientras que, el LPS de P. gingivalis 33277 a elevadas concentraciones no presenta buena reactividad con este test. Sin embargo, debera aumentarse el tamano de muestras de la prueba para confirmar estos resultados estadisticamente.

En el caso del LPS de S. typhimurium la actividad no fue determinada debido a que la reaccion estaba por encima del limite superior de la curva del control estandar de endotoxina, lo que sugiere una mayor potencia endotoxica para este LPS. Aunque se ha reportado que la actividad endotoxica para algunos LPS no es reflejada en el ensayo LAL (Dehus et al., 2006), estos resultados sugieren que los LPS purificados a partir de E. corrodens y P. gingivalis son endotoxinas y presentan actividad biologica.

Conclusiones

La metodologia implementada en este estudio, utilizando diferentes tecnicas previamente reportadas para la extraccion, purificacion y caracterizacion de LPS, permitio la obtencion de LPS de elevada pureza a partir de cultivos de bacteria completa de P. gingivalis W83 y E. corrodens 23834. La caracterizacion bioquimica de los extractos purificados determino la presencia de LPS-S para la cepa 23834 de E. corrodens y de LPS-SR para la cepa W83 de P. gingivalis. Ambos LPS purificados fueron positivos para KDO y presentaron actividad endotoxica.

Recibido: abril 12 de 2013

Aprobado: abril 15 de 2014

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado para la purificacion de LPS de E. corrodens 23834 por la Fundacion para la promocion de la Investigacion y la Tecnologia del Banco de la Republica (proyecto 2,706). Ademas fue financiado para la purificacion de LPS de P. gingivalis W83 por el Departamento Administrativo de Ciencia Tecnologia e Innovacion COLCIENCIAS (proyecto: 130851928960). Queremos tambien agradecer a la Division de Investigaciones de la Universidad El Bosque por la financiacion y gestion administrativa para la ejecucion de estos proyectos.

A la memoria del profesor Gerardo Perez del laboratorio de Bioquimica, Departamento de Quimica de la Universidad Nacional de Colombia, por sus asesorias en la purificacion por cromatografia del extracto de E. corrodens.

Conflicto de interes

Los autores expresamos que no existe ningun conflicto de interes en la publicacion de este estudio.

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Diego Fernando Gualtero Escobar, Candidato a Doctor en Biotecnologia. Facultad de ciencias, Universidad Nacional de Colombia. Magister en Bioquimica. Lic. Biologia y Quimica. Autor de correspondencia: gualterodiego@unbosque.edu.co

Jeimy Paola Porras Gaviria, Lic. Quimica. porrasyeimi@unbosque.edu.co

Sebastian Bernau Gutierrez, Candidato a Magister en Ciencias Basicas Biomedicas, Facultad de ciencias, Universidad El Bosque. Biologo. gutierrezsebastian@unbosque. edu.co

Diana Marcela Buitrago Ramirez, PhD. Ciencias Farmaceuticas. Bacteriologa. buitragodianam@unbosque.edu.co

Diana Marcela Castillo Perdomo, Candidato a Doctor en Biotecnologia, Facultad de ciencias, Universidad Nacional de Colombia. Magister en Microbiologia. Bacteriologa. castillodiana@unbosque.edu.co

Gloria Ines Lafaurie Villamil, Directora Instituto UIBO. Magister en Epidemiologia. Periodoncista. Odontologa. investigaciones.odontologia@unbosque.edu.co

Unidad de Investigacion Basica Oral (UIBO)-Laboratorio de biotecnologia-Division de Investigaciones-Facultad de Odontologia-Universidad El Bosque. Av. Cra 9 No. 131A-02. Edificio de rectoria 2 piso
Tabla 1. Rendimientos del proceso de extraccion y purificacion de LPS.

Bacteria                      Cantidad bacteria     Extracto
                                 humeda (mg)      crudo mg (%)

P. gingivalis W83                   1100          12,9 (1,17%)
E. corrodens 23834 ([cruz])         3553          89,5 (2,5%)

Bacteria                      Extracto luego del      Extracto
                                 tratamiento       purificado (mg)
                              enzimatico mg (%)

P. gingivalis W83                  5 (0,45)           7.6 (0.7)
E. corrodens 23834 ([cruz])       3,9 (0,11)         0,8 (0,02)

([cruz]) Estos rendimientos fueron obtenidos a partir de la
metodologia reportada previamente (Gualtero y cois., 2008)

Tabla 2. Identificacion de LPS en extractos purificados de
P. gingivalis W83 y E. corrodens 23834 por el ensayo Purpald.

Muestra                Concentracion    Concentracion     Correlacion
                       de la muestra   relativa (mM) *    ([R.sup.2])
                          (mg/mL)                        concentracion
                                                            KDO vs
                                                          Absorbancia

LPS Salmonella              0.5             0,407            0,998
  typhimurium ATCC
  7823
LPS Porphyromonas           0.5             0,054
  gingivalis ATTC
  33277 InvivoGen
LPS Rhodobacter             0.5             0,050
  sphaeroides DSM
  158 InvivoGen
LPS Escherichia             0.5             0,012
  coli 0111:B4
InvivoGen
LPS Escherichia coli       0.23             0,025
  0127:B8 Sigma
Extracto purificado        0.01             0,553
  Porphyromonas
  gingivalis W83
Extracto purificado        0.01             0,066
  E. corrodens
  23834

* Los valores de concentracion milimolar relativa para cada
lipopolisacarido fueron calculados a partir de una curva de
calibracion de KDO de concentracion conocida.

Tabla 3. Actividad endotoxica de purificados de LPS por LAL
cromogenico (Pyrochrome[R])

Muestra               concentracion   Concentracion    Correlacion
                                       relativa de    curva LPS CSE
                                       Endotoxina     vs Absorbancia
                                        (U.E/mL)

LPS E. corrodens        50 ng/mL          0,18        [R.sup.2] = 0997
  23834
LPS P. gingivalis       10 ng/mL          0,175
  W83
LPS P. gingivalis       0,5 Mg/mL         0.26
  33277
LPS E. coli (Sigma)     50 ng/mL          0,16
LPS S. typhimurium      50 ng/mL           N.D
  (Sigma)

Lote kit: PP1182. Sensibilidad 0,005 U.E/mL
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Author:Gualtero Escobar, Diego Fernando; Porras Gaviria, Jeimy Paola; Bernau Gutierrez, Sebastian; Buitrago
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Jul 1, 2014
Words:7509
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