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Prueba de sensibilidad antimicrobiana de cepas de Salmonella grupo D (moviles e inmoviles) aisladas de ponedoras comerciales en Colombia.

ANTIMICROBIAL SUSCEPTIBILITY TEST OF ISOLATES OF Salmonella GROUP D (MOBILE AND NON MOBILE) FROM COMMERCIAL LAYING HENS IN COLOMBIA

INTRODUCCION

Las infecciones por Salmonella spp. en aves son producidas por dos tipos de microorganismos; las causadas por especies de Salmonellas moviles dentro de las cuales esta Salmonella enteritidis que ocasiona las denominadas enfermedades paratifoideas, y las causadas por Salmonellas inmoviles en donde se encuentran Salmonella gallinarum causante de la tifoidea aviar, la cual afecta principalmente a aves adultas, y Salmonella pullorum que produce la pullorosis y afecta por lo general a aves jovenes; aunque la motilidad en Salmonella pullorum es todavia controversial (1, 2, 3, 4). Ambas enfermedades son de gran importancia en la industria avicola debido a las altas tasas de morbilidad y mortalidad que generan. En cuanto a las cepas moviles hay que tener en cuenta las implicaciones que poseen en salud publica.

Los productos como amoxacilinas, tetraciclinas y fluoroquinolonas podrian ser efectivos para el tratamiento, aunque ninguno de estos farmacos son capaces de eliminar la infeccion por completo (5). El aumento en los niveles de resistencia frente a los antimicrobianos utilizados comunmente es relativo, y muchas veces estos tratamientos pueden fallar debido a que la cepa infectante se vuel ve resistente a estos, lo que conlleva a la persistencia de la enfermedad (6).

El desarrollo de cepas resistentes frente a los antimicrobianos comunmente usados es un tema de preocupacion no solo en medicina veterinaria sino en salud publica. En muchos paises se ha encontrado una alta proporcion de cepas de Salmonella spp., resistentes a multiples medicamentos y la principal causa de esta resistencia es el uso excesivo e indiscriminado de estos (7)

La resistencia bacteriana es la capacidad de un microorganismo para desarrollar mecanismos de defensa contra la accion de los antibioticos (8), esta puede ser innata o adquirida (9, 10). La resistencia adquirida puede generarse por alteraciones que sufre el microorganismo debido a mutaciones cromosomicas o por mecanismos de transferencia de genes. Se han identificado varios elementos que participan en la transferencia de genes de resistencia, de los cuales los mas conocidos son transposones, bacteriofagos, plasmidos, integrones y cassettes geneticos de resistencia. Estos tres ultimos implicados en la resistencia de Salmonella spp. (11, 12, 13).

Con respecto a los mecanismos de resistencia que posee Salmonella spp. se conocen los siguientes:

* Produccion de enzimas que inactivan los antibioticos siendo las betalactamasas las mas importantes; a este mecanismo se le atribuye gran parte de la resistencia de Salmonella spp. frente a penicilinas, cefalosporinas, ampicilinas, ceftiofur y ceftriaxona (14, 15). Gran parte de la resistencia a aminoglucosidos en Salmonella spp. se asocia a la modificacion de enzimas que incluyen a los aminoglucosidos fosfotransferasas, aminoglucosidos acetiltransferasas y adeniltransferasas, los cuales funcionan mediante la fosforilacion, acetilacion y adenilacion de sus aminoglucosidos (16).

* Modificaciones bacterianas que impiden la llegada del antibiotico al punto diana; esto generalmente se da por medio de mutaciones, para el caso de las quinolonas estas mutaciones se dan en los genes que codifican para las topoisomerasas bacterianas, estas son el sitio de accion de estos farmacos (8, 10, 17, 18).

* La expulsion de antibioticos como tetraciclina y cloramfenicol mediante bombas de flujo (10).

Existe gran variedad de tecnicas de laboratorio que permiten evaluar la sensibilidad de bacterias in vitro; dentro de estas se encuentran las pruebas de difusion por discos y las pruebas de dilucion en caldo y en agar, esta ultima es la mas utilizada debido a que se encuentra normalizada y esta recomendada por el Comite Nacional para la Normatizacion de Laboratorios Clinicos (NCCLS, por su sigla en ingles). Dentro de estas pruebas se encuentra el metodo de Kirby-Bauer, el cual ha sido descrito de manera mas completa, y se han desarrollado tablas de interpretacion respaldadas por datos clinicos y de laboratorio; este metodo consiste en el uso de una cantidad determinada del antimicrobiano en un disco de papel (sensidisco) aplicado sobre la superficie del agar en el que se ha sembrado el microorganismo, de esta forma se genera un gradiente de concentracion del antimicrobiano. La sensibilidad del microorganismo esta indicada por el tamano de la zona de inhibicion del crecimiento alrededor del sensidisco (19, 20, 21).

El objetivo del presente trabajo fue estudiar la susceptibilidad de 20 cepas de Salmonella grupo D (moviles e inmoviles) aisladas en ponedoras comerciales en Colombia, que presentaron cuadros de elevada mortalidad y disminucion en la produccion, frente a 18 productos, con el fin de evaluar la respuesta de estas cepas frente a antimicrobianos tanto de uso comun como restringido en avicultura (cloramfenicol).

MATERIALES Y METODOS

Cepas utilizadas

Para este trabajo se utilizaron 20 cepas de Salmonella spp. aisladas de ponedoras comerciales, las cuales fueron tipificadas y clasificadas como grupo D, utilizando antisueros polivalentes para Salmonella (Poly A-I y Vi) (B.D Difco[R]) y antisuero Salmonella factor 9 para grupo D (B.D Difco[R]). Se realizaron pruebas de motilidad con los agares Sulfuro Indol Motilidad (SIM) y Medio para Prueba de Motilidad (Motility Test Medium), el resultado fue 13 aislamientos de cepas inmoviles y 7 de cepas moviles; a las 13 inmoviles se les realizo tipificacion molecular mediante PCR especifico con lo que se obtuvieron 11 cepas de Salmonella gallinarum y 2 cepas de Salmonella pullorum.

Prueba de sensibilidad

Se preparo el agar Mueller-Hinton, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (OXOID[R]), y se vertio en cajas de Petri de 150 mm dejando un espesor de 15 milimetros (aproximadamente 20 a 25 mililitros). Posteriormente, se sometio a prueba de esterilidad la cual consiste en la incubacion por 24 horas a 37 [grados]C. Una vez transcurrido este tiempo se verifico que no hubiera crecimiento de colonias en el medio, lo que significaba que se podia utilizar para la prueba.

Se realizo una suspension de la bacteria en solucion salina al 0,85% (tubo 0,5 de la escala de Mac-Farland), lo cual es equivalente a inocular 1,5 X [10.sup.8] Unidades Formadoras de Colonias (UFC)/ml, y se procedio a la siembra en el medio Mueller-Hinton. Se seleccionaron los sensidiscos teniendo en cuenta que se trataba de enterobacterias gram negativas (22); se introdujeron 7 discos, 6 en la periferia y 1 en el centro, y fueron incubados durante 24 horas a 37 [grados]C. Luego del periodo de incubacion se midieron los halos con una regla de medicion comun. Los resultados se interpretaron como sensible, sensibilidad media o resistente de acuerdo con el diametro del halo de inhibicion tomado en mm y usando como referencia la tabla del NCCLS (tabla 1).

RESULTADOS

Para el analisis de datos los resultados se expresaron en medidas de tendencia central como frecuencia y promedio, representados en figuras y tablas.

De las 20 cepas de Salmonella grupo D analizadas, se pudo determinar una resistencia total frente a estreptomicina con 20 cepas resistentes (100%), tetraciclina con 18 (90%), florfenicol con 13 (65%), y una menor resistencia a productos como fosfomicina mas tilosina en donde no se presentaron cepas resistentes, mientras la combinacion fosfomicina mas fructuosa obtuvo 2 cepas resistentes (10%) y fosfomicina sola mostro una cepa resistente (5%) (tabla 2, figura 1).

La sensibilidad en ambas cepas fue elevada para fosfomicina mas fructuosa con un 92,3% para cepas inmoviles y 85,7% para cepas moviles. En el caso del cloramfenicol se observo una cepa movil resistente y una cepa inmovil con sensi bilidad media, que alcanza el 92,3% de sensibilidad.

Para la estreptomicina todas las cepas obtuvieron el mismo porcentaje de resistencia (100%). La resistencia vario en los casos de tetraciclinas pues fue mayor en cepas inmoviles (92,3%) comparada con la resistencia de las cepas moviles (85,7%), la cual obtuvo una cepa con sensibilidad media frente a este farmaco. Las cepas inmoviles mostraron un mayor grado de resistencia frente a florfenicol con 76,9%, amikacina 38,5%, doxiciclina 38,5% y fosfomicina con el 7,7%, frente a las cepas moviles que mostraron para estos antibioticos un 42,9, 14,3, 28,6 y 0% de resistencia respectivamente. Las cepas moviles obtuvieron mayor resistencia para cefalexina, ampicilina y ciprofloxacina, las tres con el 57,1%; kanamicina y enrofloxacina, ambas con 42,9%, comparadas con las cepas inmoviles que obtuvieron para cefalexina y kanamicina 30,8%; enrofloxacina y norfloxacina 23,1%, y ampicilina y cipro floxacina con 15,4% de resistencia (tabla 3, figura 2).

[FIGURA 1 OMITIR]

Comparando el comportamiento de las cepas de Salmonella gallinarum y Salmonella pullorum frente a estos antimicrobianos (tabla 4, figura 3) se pudo establecer que las cepas de S. pullorum tuvieron mayor porcentaje de resistencia frente a productos como amikacina y fosfomicina. Para todos los antimicrobianos, las cepas de Salmonella gallinarum mostraron mas sensibilidad y tuvieron un comportamiento similar frente a trimetoprim sulfa, fosfomicina mas fructosa 1,6 difosfato y cloranfenicol, a diferencia de una cepa S. gallinarum que tuvo una sensibilidad media frente a este ultimo medicamento. En cuanto a estreptomicina, ambas cepas fueron resistentes.

[FIGURA 2 OMITIR]

[FIGURA 3 OMITIR]

CONCLUSIONES

De acuerdo con los datos obtenidos en los analisis realizados a 20 cepas de Salmonella grupo D (moviles e inmoviles) aisladas en ponedoras comerciales, se pudo observar un comportamiento de resistencia muy variado que va desde el 0% para productos combinados como fosfomicina mas tilosina y trimetoprim sulfa, hasta el 95% y 100% para productos de uso comun, como estreptomicina y tetraciclinas. Los porcentajes de sensibilidad que presentaron los productos combinados se pueden deber a que aun se registra poco uso de estos. Por el contrario, los elevados niveles de resistencia que se evidenciaron para otros medicamentos podrian explicarse por el continuo uso de los mismos, lo que genera una presion de seleccion sobre las cepas de Salmonellas grupo D aisladas.

El cloramfenicol ha sido prohibido por la OIE en animales de abasto. Por tal motivo, se esperaria un porcentaje de sensibilidad del 100%, pero el valor obtenido fue de 85%, por tal motivo es recomendable tomar medidas estrictas de control para el uso de estos productos.

Comparando cepas moviles con inmoviles se pudo observar que ambas obtuvieron una respuesta similar para tetraciclina y estreptomicina, con un porcentaje de resistencia por encima del 90%, esto puede deberse al continuo uso de estos medicamentos para tratar dos tipos de enfermedades en aves (pulorosis y tifoidea aviar, producidas por las cepas inmoviles y enfermedades paratifoideas producidas por cepas moviles).

Tanto Salmonella pullorum como Salmonella gallinarum mostraron resistencia similar a estreptomicina y tetraclinas; por el contrario, frente a amikacina, la biovariedad gallinarum fue mas sensible, por tal motivo seria necesario realizar un estudio en donde se evalue un numero mayor de cepas de Salmonella pullorum, con el fin de poder determinar con mayor precision su comportamiento frente a estos antimicrobianos.

El genero Salmonella son microorganismos que se puede transmitir directamente de la gallina, ya sea por su presencia en los foliculos ovaricos o por contaminacion en la cascara mediante materia fecal. Es importante resaltar que la presencia de esta bacteria altera la calidad e inocuidad del huevo, no solo por contaminacion directa, sino por los residuos de antimicrobianos utilizados indiscriminadamente.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Laboratorio de Microbiologia de la Universidad Nacional de Colombia por facilitar las instalaciones para el desarrollo del experimento. Al Laboratorio de Patologia Aviar, y a todo su personal, por su colaboracion y por contribuir al desarrollo del proyecto.

REFERENCIAS

(1.) Holt P, Chaubal L. Detection of motility and putative synthesis of flagellar proteins in Salmonella pullorum cultures. J Clin Microbiol 1997; 35 (4): 1016-20.

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(3.) Chadfield S, Christensen JP, Madsen M, Sonne HJ, Bisgaard M. Application of molecular methods for identification of strains classified as Salmonella enterica serovar 6, 7 by conventional serotyping. Avian Pathol 2002; 31:271-6.

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(6.) Varma JK, Greene KD, Ovitt J, Barrett TJ, Medalla F, Angulo FJ. Hospitalization and antimicrobial resistance in Salmonella outbreaks, 1984-2002; 2005. Disponible en: www.cdc.gov/eid. 11, 6, 943-946.

(7.) World Health Organization (WHO), Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), Organizacion Mundial de Sanidad Animal (OIE). Joint FAO/OIE/ WHO Expert Workshop on Non-human Antimicrobial Usage and Antimicrobial Resistance: Scientific assessment; 2003 December 1-5; Ginebra, Suiza.

(8.) Jauregui L, Zulaica H, Rojo L, Moreno F. Factores de riesgo para la adquisicion de bacterias multirresistentes. Anales Medicos. An Med Asoc Med Hosp ABC 1996; 41(4):161 4.

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(10.) Page C, Curtis M, Sutter M, Walkerm J, Hoffman B. Farmacologia integrada infecciones bacterianas. Mecanismos de accion. Farmacologia Integrada. Madrid: Elsevier; 1998. pp. 422-43.

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(19.) Malbran C. Metodos estandarizados para la determinacion de la sensibilidad antimicrobiana en bacterias aisladas de animales: test de difusion por discos y test de dilucion. Buenos Aires: Ministerio de Salud, Subsecretaria de Investigacion y Tecnologia, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, Departamento Bacteriologia, Servicio Antimicrobianos; 2001 (Documento M31-A NC CLS-Junio 1999).

(20.) Comite Nacional para la Normatizacion de Laboratorios Clinicos (NCCLS). Performance standards for antimicrobial disk susceptibility test: approved standard 2007; Seventh edition m2-a7; 20, 1.

(21.) Comite Nacional para la Normatizacion de Laboratorios Clinicos (NCCLS). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; eleventh informational supplement 2001; m100-s11, 21, 1.

(22.) Famiglietti A, Quinteros M, Vazquez M, Marin M, Incola F, Radice M et al. Consenso sobre las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos en enterobacteriaceae. Rev Argent Microbiol 2005; 37:57-66.

J. Mantilla [1], M. Pulido [2], J. Jaime [3]

Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia, Posgrado en Salud y Produccion Animal, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogota

Articulo recibido: 26 de enero de 2010; aprobado: 24 de mayo de 2010

[1.] jmmantillap@unal.edu.co

[2.] mpulidola@unal.edu.co

[3.] jjaimec@unal.edu.co
TABLA 1. Lectura e interpretacion de las zonas de inhibicion

Antimicrobiano      Resistente    Sensibilidad media    Sensible
                     (halo mm)         (halo mm)        (halo mm)

Amikacina               12               13-14             15
Amoxacilina             16               17-20             21
Ampicilina              12               13-15             16
Cefalexina              13               14-17             18
Ciprofloxacina          12               13-17             16
Cloramfenicol           12               13-16             17
Doxiciclina             10               11-15             16
Enrofloxacina           14               15-18             19
Estreptomicina          12               13-16             17
Florfenicol             12               13-17             18
Fosfomicina             15               16-20             21
Fosfomicina mas
  fructosa 1,6
  difosfato             13               14-16             17
Fosfomicina mas
  fructosa 1,6
  difosfato             16               17-20             21
y Tilosina
Gentamicina             12               13-15             16
Kanamicina              15               16-20             21
Norfloxacina            14               15-16             17
Tetraciclina            14               15-17             18
Trimetoprim sulfa       18               19-22             23

Fuente: Normas CLSI-NCCLS, 2005.

TABLA 2. Resultados de la prueba de sensibilidad antimicrobiana
(difusion en agar) de 20 aislamientos de Salmonella grupo D en
ponedoras comerciales

Antimicrobiano       Resistencia      %     Sensibilidad      %
                      (No. cepas)                Media

Amikacina                 6           30          5           25
Amoxacilina               9           45          8           40
Ampicilina                6           0           10          50
Cefalexina                8           40          0           0
Ciprofloxacina            6           30          8           40
Cloramfenicol             1           5           2           10
Doxiciclina               7           35          9           45
Enrofloxacina             6           30          6           30
Florfenicol               13          65          3           15
Fosfomicina               1           5           6           30
Fosfomicina mas
  fructosa 1,6
  difosfato               2           10          0           0
Fosfomicina mas
  fructosa 1,6
  difosfato
  y Tilosina              0           0           0           0
Gentamicina               4           20          6           30
Kanamicina                6           30          7           35
Norfloxacina              4           20          15          75
Estreptomicina            20         100          0           0
Tetraciclina              18          90          1           5
Trimetoprim sulfa         0           0           3           15

Antimicrobiano       Sensibilidad     %
                      (No. cepas)

Amikacina                 9           45
Amoxacilina               3           15
Ampicilina                4           20
Cefalexina                12          60
Ciprofloxacina            6           30
Cloramfenicol             17          85
Doxiciclina               4           20
Enrofloxacina             8           40
Florfenicol               4           20
Fosfomicina               13          65
Fosfomicina mas
  fructosa 1,6
  difosfato               18          90
Fosfomicina mas
  fructosa 1,6
  difosfato
  y Tilosina              20         100
Gentamicina               10          50
Kanamicina                7           35
Norfloxacina              1           5
Estreptomicina            0           0
Tetraciclina              1           5
Trimetoprim sulfa         17          85

TABLA 3. Resultados de la prueba de sensibilidad antimicrobiana
(difusion en agar) de cepas de Salmonella grupo D (13 inmoviles y
7 moviles)

                                      Inmoviles

Antimicrobiano   Resistencia                      Sensibilidad
                  No. cepas      %     SM     %      No. cepas      %

Amikacina             5       38,5    3    23,1        5        38,5
Amoxacilina           6       46,2    5    38,5        2        15,4
Ampicilina            2       15,4    7    53,8        4        30,8
Cefalexina            4       30,8    0     0,0        9        69,2
Ciprofloxacina        2       15,4    7    53,8        4        30,8
Cloramfenicol         0         0     1     7,7        12       92,3
Doxiciclina           5       38,5    5    38,5        3        23,1
Enrofloxacina         3       23,1    6    46,2        4        30,8
Streptomicina        13        100    0     0,0        0         0,0
Florfenicol          10       76,9    1     7,7        2        15,4
Fosfomicina           1        7,7    5    38,5        7        53,8
Fosfomicina
  mas fructosa
  1,6 difosfato       1        7,7    0     0,0        12       92,3
Fosfomicina mas
  fructosa 1,6
  difosfato y
  Tilosina            0         0     0     0,0        13        100
Gentamicina           2       15,4    5    38,5        6        46,2
Kanamicina            4       30,8    3    23,1        6        46,2
Norfloxacina          3       23,1    9    69,2        1         7,7
Tetraciclina         12       92,3    1     7,7        0         0,0
Trimetoprim
  sulfa               0         0     2    15,4        11       84,6

                                        Moviles

Antimicrobiano   Resistencia                      Sensibilidad
                  No. cepas      %     SM     %      No. cepas      %

Amikacina             1       14,3    2    28,6        4        57,1
Amoxacilina           3       42,9    3    42,9        1        14,3
Ampicilina            4       57,1    3    42,9        0         0,0
Cefalexina            4       57,1    0     0,0        3        42,9
Ciprofloxacina        4       57,1    1    14,3        2        28,6
Cloramfenicol         1       14,3    1    14,3        5        71,4
Doxiciclina           2       28,6    4    57,1        1        14,3
Enrofloxacina         3       42,9    0     0,0        4        57,1
Streptomicina         7        100    0     0,0        0         0,0
Florfenicol           3       42,9    2    28,6        2        28,6
Fosfomicina           0         0     1    14,3        6        85,7
Fosfomicina
  mas fructosa
  1,6 difosfato       1       14,3    0     0,0        6        85,7
Fosfomicina mas
  fructosa 1,6
  difosfato y
  Tilosina            0         0     0     0,0        7         100
Gentamicina           2       28,6    1    14,3        4        57,1
Kanamicina            3       42,9    3    42,9        1        14,3
Norfloxacina          1       14,3    6    85,7        0         0,0
Tetraciclina          6       85,7    0     0,0        1        14,3
Trimetoprim
  sulfa               0         0     1    14,3        6        85,7

SM: sensibilidad media

TABLA 4. Resultados de la prueba de sensibilidad antimicrobiana
(difusion en agar) de 11 cepas de Salmonella gallinarum y 2 de
Salmonella pullorum

                               Salmonella gallinarum

                 Resistencia                       Sensibilidad
Antimicrobiano     No. cepas      %     SM     %      No. cepas     %

Amikacina             3        27,3    3    27,3        5        45,5
Amoxacilina           6        54,5    3    27,3        2        18,2
Ampicilina            1         9,1    7    63,6        3        27,3
Cefalexina            4        36,4    0     0,0        7        63,6
Ciprofloxacina        1         9,1    6    54,5        4        36,4
Cloramfenicol         0         0,0    1     9,1        10       90,9
Doxiciclina           5        45,5    3    27,3        3        27,3
Enrofloxacina         3        27,3    4    36,4        4        36,4
Estreptomicina        11        100    0     0,0        0         0,0
Florfenicol           8        72,7    1     9,1        2        18,2
Fosfomicina           1         9,1    4    36,4        6        54,5
Fosfomicina
  mas fructosa
  1,6 difosfato       0         0,0    0     0,0        11        100
Fosfomicina
  mas fructosa
  1,6 difosfato
  y Tilosina          0         0,0    0     0,0        11        100
Gentamicina           2        18,2    5    45,5        4        36,4
Kanamicina            3        27,3    3    27,3        5        45,5
Norfloxacina          1         9,1    9    81,8        1         9,1
Tetraciclina          10       90,9    1     9,1        0         0,0
Trimetoprim sulfa     0         0,0    2    18,2        9        81,8

                                Salmonella pullorum

                 Resistencia                       Sensibilidad
Antimicrobiano     No. cepas      %     SM     %      No. cepas      %

Amikacina             2         100    0     0,0        0         0,0
Amoxacilina           0         0,0    2     100        0         0,0
Ampicilina            1         50     0     0,0        1         50
Cefalexina            0         0,0    0     0,0        2         100
Ciprofloxacina        1         50     1     50         0         0,0
Cloramfenicol         0         0,0    0     0,0        2         100
Doxiciclina           0         0,0    2     100        0         0,0
Enrofloxacina         0         0,0    2     100        0         0,0
Estreptomicina        2         100    0     0,0        0         0,0
Florfenicol           2         100    0     0,0        0         0,0
Fosfomicina           0         0,0    1     50         1         50
Fosfomicina
  mas fructosa
  1,6 difosfato       1         50     0     0,0        1         50
Fosfomicina
  mas fructosa
  1,6 difosfato
  y Tilosina          0         0,0    0     0,0        2         100
Gentamicina           0         0,0    0     0,0        2         100
Kanamicina                      0,0    1     50         1         50
Norfloxacina          2         100    0     0,0        0         0,0
Tetraciclina          2         100    0     0,0        0         0,0
Trimetoprim sulfa     0         0,0    0     0,0        2         100

SM: sensibilidad media
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Title Annotation:Investigacion
Author:Mantilla, J.; Pulido, M.; Jaime, J.
Publication:Revista Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia
Article Type:Report
Date:Sep 1, 2010
Words:3841
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