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Progress and limitations of dsRNA strategies in the control of viral diseases in aquaculture/Avances y limitaciones en el uso de los dsRNA como estrategias de control y prevencion de enfermedades virales en sistemas acuicolas.

INTRODUCCION

La acuicultura se ha convertido en un dinamico sector productivo en los ultimos anos, y es responsable de satisfacer en gran parte la demanda mundial por alimentacion (Plant & LaPatra, 2011; FAO 2012). En el 2011, la actividad pesquera y la acuicultura produjeron aproximadamente 154 millones de toneladas de peces a nivel mundial, de los cuales 131 millones se destinaron a alimentacion (FAO, 2012). En este escenario, resulta indispensable abordar cualquier problema que pueda amenazar esta actividad. Las enfermedades de los organismos cultivados resulta ser uno de los principales inconvenientes (Plant & LaPatra, 2011). A la fecha, existen varios compuestos antibioticos y antipara-sitarios, que se utilizan para el tratamiento de enfermedades causadas por bacterias y parasitos, sin embargo, tratamientos efectivos contra virus no se encuentran facilmente (Plant & LaPatra, 2011). Distintos tipos de virus amenazan a la acuicultura, entre ellos, en la industria de salmonidos destacan el virus que provoca la anemia infecciosa del salmon (ISAV, del ingles infectious salmon anemia virus) (Nylund et al., 2007), el virus de la necrosis pancreatica infecciosa (IPNV, del ingles infectious pancreatic necrosis virus) (Guy et al., 2006), el virus de la necrosis hemato-poyetica infecciosa (IHNV, del ingles infectious hematopoietic necrosis virus) (Thoulouze et al., 2004), el virus de la septicemia hemorragica (VHSV, del ingles viral hemorrhagic septicemia virus) (Kim et al., 2012), o en la industria del camaron, el virus que genera el sindrome de la mancha blanca (WSSV, del ingles white sport sindrome virus) (Sarathi et al., 2008). Para controlar esta amenaza, en la actualidad se trabaja con ayuda de la biotecnologia y herramientas de ingenieria genetica para desarrollar estrategias y terapias que permitan abordar este problema.

Una de estas tecnologias que concita mayor interes ultimamente, es la del RNA de interferencia (RNAi) (Lima et al., 2013). El RNAi es un mecanismo de silenciamiento post-transcripcional descubierto en la ultima decada, donde el RNA de doble cadena (dsRNA) proveniente de una region codificante o un gen, es introducido a un organismo, resultando en la degradacion especifica de un mRNA complementario al interior de la celula (Provost et al., 2002). Este silenciamiento post-transcripcional se encuentra bien conservado evolutivamente en varios organismos eucariontes, permitiendo proteger a la celula contra virus a traves de un ataque altamente especifico, basado en la generacion de cadenas pequenas de RNAs interferentes de 21 a 28 nucleotidos (Shuey et al., 2002; Almeida & Allshire, 2005; Aagard & Rossi, 2007).

Por otro lado, tambien se ha puesto atencion en el posible efecto inmunomodulador que podrian tener los dsRNA utilizados como adyuvantes en vacunas para inducir la estimulacion del sistema inmune innato (Ruyra et al., 2013; Thim et al., 2014). Los adyuvantes mejoran la respuesta humoral y celular (Ruyra et al., 2013), siendo los dsRNA un candidato para potenciar este proceso. En este contexto, los dsRNA representan una novedosa alternativa enfocada a mejorar la salud de los peces.

En esta revision se abordan los mecanismos de accion del dsRNA y sus posibles aplicaciones como terapia antiviral y/o inmunomodulador en acuicultura, con especial enfasis en las dificultades de suministro que deben ser superadas para asegurar la presencia del dsRNA en la celula del organismo blanco.

dsRNA como sustrato de la via de RNA interferencia

En los organismos eucariontes, la exposicion intracelular a una secuencia de dsRNA desencadena un proceso de silenciamiento post-transcripcional secuenciaespecifico en un mRNA homologo. La ruta del RNAi se inicia con el ingreso de un dsRNA activador de cadena larga al interior de la celula, que rapidamente se corta en pequenos trozos de 21 a 28 pares de bases mediante la accion de la enzima Dicer (ribonucleasa III) que tiene la particularidad de reconocer y cortar el dsRNA en lugares especificos (Provost et al., 2002; Shuey et al., 2002; Aagard & Rossi, 2007). Estos pequenos trozos de dsRNA se denominan RNAi pequenos, o siRNA por su acronimo en ingles small interference RNA. Esta enzima posee un dominio helicasa, sugiriendo la necesidad de que el dsRNA activador deba desenredarse antes del ataque enzimatico (Shuey et al., 2002). Los siRNA son incorporados a un complejo de silenciamiento de RNA llamado RISC. (del acronimo en ingles multi-subunit RNA-induced silencing complex), donde la proteina argonauta (Ago) es uno de los principales componentes (Zamore et al., 2000). Esta hidrolisis del mRNA ocurre entre las regiones homologas del siRNA, permitiendo una selectividad a la hora de hidrolizar (Fig. 1) (Shuey et al., 2002). La eficiencia del proceso de hidrolisis del mRNA no esta aun bien descrita, sin embargo, entre las que se describen como variables son el tamano del siRNA, y la estructura secundaria del mRNA y en consecuencia, la accesibilidad para la operacion del complejo RISC (Aigner, 2006).

Produccion de dsRNA

Para producir dsRNA in vitro, basicamente existen tres estrategias: sintesis quimica, sintesis enzimatica in vitro y vectores de DNA plasmidial. Cada uno de estos metodos posee diversas ventajas y desventajas (La Fauce & Owens, 2012).

Los dsRNAs que se sintetizan en forma quimica son introducidos directamente en el citoplasma de la celula evitando el paso por la enzima Dicer. Debido a su tamano se les denomina siRNAs. Estos siRNAs pueden ser sintetizados en grandes cantidades y se ha probado que son mas eficientes en gatillar una degradacion del mRNA secuencia-especifica. Sus principales desventajas son el alto costo economico y tiempo de sintesis lo que no lo hace factible para producciones a gran escala, mas aun si multiples siRNAs estan involucrados (Duxbury & Whang, 2004).

Los dsRNAs generados enzimaticamente involucran una transcripcion in vitro mediada por la polimerasa del fago T7 (Donze & Picard, 2002). Como producto de la transcripcion se obtienen pequenos RNAs repetidos invertidos que se denominan small hairpin RNAs (shRNAs), que son subsecuentemente cortados por Dicer. Es el metodo mas rapido y mas rentable para la sintesis de siRNA. Sin embargo la pureza y especificidad usando este tipo de sintesis es variable y se puede obtener resultados de una inhibicion no especifica en la expresion genica (Duxbury & Whang, 2004).

El uso de vectores como los plasmidos de DNA que poseen el promotor de la polimerasa III, tambien pueden ser utilizados para generar dsRNAs para silenciamiento genico (Sui et al., 2002). Los dsRNAs son producidos y subsecuentemente procesados por Dicer en siRNAs. El uso de estos plasmidos que generan dsRNAs, permite su expresion estable por al menos 2 meses post-transfeccion y es mas economico al generar multiples secuencias que son obtenidas por la propia maquinaria de RNAi, sin requerir de un procesamiento externo que aumente los costos de produccion. Su principal desventaja es que el exito es dependiente del proceso de transfeccion (Duxbury & Whang, 2004).

Otra de las estrategias utilizadas es generar dsRNAs utilizando sistemas in vivo. En este caso el uso de bacterias recombinantes, resulta una buena opcion como sistemas de produccion, debido a su facil manipulacion, rapido crecimiento en medios de cultivos adecuados y capacidad de contener plasmidos en su interior (Timmons & Fire, 2001; Terpe, 2006; Solis et al., 2009; Posiri et al., 2013). En el caso de Escherichia coli, ademas de estas caracteristicas, se utiliza una cepa que posea una mutacion en el gen que codifica para RNasa III para evitar la hidrolisis enzimatica del material genetico acumulado. La cepa mas utilizada es la E. coli HT115 (DE3), ya que posee caracteristicas idoneas para ocuparlas como maquinas productoras de dsRNA, ademas de expresar una RNA T7 polimerasa que permite expresar RNAs a partir de plasmidos que poseen doble promotor T7 (Fig. 2) (Timmons & Fire, 2001; Sarathi et al., 2008; Posiri et al., 2013). De manera general, luego de la construccion del plasmido recombinante, como el pL3330 (Timmons & Fire, 1998), la bacteria productora se transforma mediante shock termico, electroporacion o mediante el uso de quimicos. Posteriormente, mediante tecnicas de cultivo, E. coli HT115 crece exponencialmente hasta que se induce la expresion de la RNA T7 polimerasa (que se encuentra bajo el control de un promotor inducible) con isopropil-1,1-tio-[beta]-D-galactopiranosido (IPTG) o lactosa, para iniciar la produccion de dsRNA (Fig. 2) (Sarathi et al., 2008; Yin et al., 2009).

Cada uno de los metodos descritos posee una serie de ventajas y desventajas, sin embargo, pensando en una produccion a gran escala como la que se necesitaria en sistemas de cultivo acuicola intensivos, la estrategia que utiliza sistemas in vivo representa la opcion mas facil, rapida y economicamente viable de producir los dsRNA.

RNAi como una estrategia promisoria en el control in vitro de enfermedades virales que afectan a la acuicultura

El RNA interferente es una estrategia que se ha utilizado ampliamente para entender la funcion de los genes y es una metodologia promisoria para desarrollar nuevas estrategias terapeuticas y antivirales (Gavrilov & Saltzman, 2012). Dentro de ellas se ha sugerido el desarrollo de terapias orientadas al tratamiento de enfermedades virales y parasitos en organismos acuaticos (Lima et al., 2013). A la fecha se han obtenido reportes exitosos que han utilizado el RNAi contra el virus del sindrome de la mancha blanca (WSSV) (Sarathi et al., 2008). Esta enfermedad es responsable de perdidas economicas severas en la industria del camaron a nivel mundial, causando 100% de mortalidad en cultivos de camaron entre 3-4 dias (Lightner, 1996). El WSSV posee un gen, VP28, el cual codifica para una de las proteinas estructurales del virus y esta involucrado en la adhesion y penetracion en las celulas de camaron. En los estudios de Sarathi y sus colaboradores (Sarathi et al., 2008), este gen fue utilizado como blanco del dsRNA antiviral sintetizado por bacterias E. coli HT115 (DE3). Experimentos con microscopia de fluorescencia y ELISA mostraron que VP28dsRNA fue capaz de silenciar la expresion del gen VP28, previamente clonado en un plasmido eucarionte y transfectado en la linea celular SISK, una linea celular continua derivada de rinon de lubina.

De igual forma, otros estudios llevados a cabo in vitro (Ruiz et al., 2009; Kim & Kim, 2011; Kim et al., 2012) han sugerido que seria posible controlar otra enfermedad, la septicemia hemorragica viral, combatiendo su agente causal, el virus VHSH mediante el uso de RNAi. Este virus, posee un genoma RNA de simple hebra de polaridad negativa y pertenece a la familia Rhabdoviridae y es el causante de una de las enfermedades virales mas importantes que se produce en una amplia variedad de especies de peces silvestres y de cultivo a nivel mundial. Kim et al. (2012) utilizaron un vector con doble promotor U6 de fugu, el cual genera una produccion continua de dsRNAs largos en celulas EPC, una linea celular de epitelioma derivado de carpa, previamente transfectadas. Los dsRNA que utilizan como blanco el gen G de VHSV, el cual codifica para glicoproteina, suprimen la expresion de este gen. Al impedirse la produccion de glicoproteina se obtienen particulas virales incompletas, y en consecuencia, se inhibe la proliferacion de VHSV en cultivo de EPC. Esta supresion depende exclusivamente de la maquinaria de interferencia, ya que los RNAi no afectan la expresion de genes relacionados con la activacion de la via de interferon, es decir, su accion ocurre por el apagamiento de la expresion genica del gen G y no por efectos secundarios inespecificos del dsRNA. Ademas esta proteccion es secuencia especifica, ya que solo se inhibe la infeccion con VHSV pero no de otros virus como el IHNV en cultivo celular. Este estudio demostro que dsRNA largos median el mecanismo de interferencia en celulas de peces, y podrian ser utilizados para el analisis de la funcion genica en celulas de peces ademas de ser aplicados como estrategia antiviral (Kim et al., 2012).

Los ultimos estudios han mostrado tambien la factibilidad de utilizar dsRNA para inhibir in vitro la replicacion viral del Ciprinido herpes virus-3, CyHV-3 (Gotesman et al., 2013). CyHV-3 es el agente etiologico del herpesvirus, que causa altas mortalidades (tasa de 80-100%) y afecta a la carpa comun y carpa koi (Cyprinus carpio L.) (Hedrick et al., 2000; Ilouze et al., 2006). Esta enfermedad ha sido listada como notificable en Alemania desde 2005 y por la Organizacion Mundial de la Salud Animal desde 2007 (Gotesman et al., 2013). En este estudio, se analizo la posibilidad de activar la via de RNAi utilizando pequenos RNAs interferentes (siRNAs) para probar la inhibicion viral in vitro de CyHV-3 en celulas de cerebro de carpa comun (linea celular common carp brain, CCB). Los siRNAs fueron disenados contra los genes timidina quinasa (tk) y DNA polimerasa (dp), que codifican para transcritos involucrados en la replicacion. La inhibicion de la replicacion viral se midio por qPCR siguiendo la deteccion del gen reportero ORF81. El tratamiento de siRNA contra tk o dp permitio la reduccion en la liberacion de particulas virales desde celulas CCB infectadas in vitro con CyHV-3. El tratamiento mas efectivo se obtuvo al silenciar el gen DP de acuerdo a la medicion de ORF81 por qPCR. Este ensayo preliminar establecio las bases para el uso de RNAi para el control de CyHV-3 (Gotesman et al., 2013). Recientemente, nuestro grupo ha probado con exito la efectividad de esta estrategia contra ISAv (Garcia et al., 2015).

RNAi como terapia antiviral in vivo en peces

Diversos organismos eucariontes presentan variados mecanismos de defensa como una proteccion natural frente a infecciones virales, lo que les permite detectar y combatir a estos patogenos. El dsRNA presente en el genoma del virus, o generado durante la replicacion, es reconocido por el organismo hospedero como un patron inequivoco de la infeccion viral, generando una variada respuesta inmune (Lima et al., 2013). En los ultimos anos se han publicado trabajos que dan cuenta de una efectiva estrategia contra infecciones virales utilizando dsRNA exogenos en distintos organismos; en vegetales frente a tobamovirus y potivirus (Tenllado et al., 2003; Yin et al., 2009), mamiferos desafiados con virus de hepatitis B y C (Aagard & Rossi, 2007), crustaceos infectados con el virus de la cabeza amarilla (Posiri et al., 2013) o con el virus de la mancha blanca (Sarathi et al., 2008, 2010) y peces frente al virus hemorragico de la carpa, virus de la necrosis nerviosa, iridovirus, virus de la septicemia hemorragica viral (Kim et al., 2012), entre otros (Schyth et al., 2007; Lima et al., 2013).

Los problemas por enfermedades virales en peces pueden ser una dificultad en bancos naturales de este recurso, pero pueden tener un devastador efecto en sistemas de acuicultura. Un claro ejemplo de esto es lo ocurrido con la industria del salmon en Chile durante 2008 y 2009 con el brote de virus de la anemia infecciosa del salmon (ISAV) (Mardones et al., 2011). Si bien los estudios de la actividad antiviral del RNAi en peces, principalmente han aportado una abundante evidencia en lineas celulares in vitro (Tabla 1), es necesario realizar mas ensayos de campo con peces sometidos a condiciones reales de cultivo.

Como se detalla anteriormente, en los estudios realizados in vitro, se ha sugerido la existencia de la maquinaria que posibilita el silenciamiento genico mediante RNAi y por tanto, su potencial antiviral. En desafios de Gobiocypris rarus frente a reovirus de carpa hervibora (GCV, grass carp reovirus), se ha observado por RT-PCR cuantitativo en tiempo real que el nivel de transcrito de Dicer incrementa significativamente en el periodo temprano de la infeccion viral y disminuye desde las 24 h post-infeccion (hpi). El mRNA de Dicer vuelve a los niveles de expresion del control a las 48 hpi. Al observar por microscopia electronica de transmision, los viriones fueron dificilmente observados a las 12 hpi, pero se observaron particulas virales desde las 24 hpi. Estos resultados sugieren que la via de RNAi es activada en estados tempranos de la infeccion (Su et al., 2009). Por otro lado, el knockdown de Dicer-1 en Penaeus monodon resulta en mortalidades incrementadas y elevados titulos virales, sugiriendo que el mecanismo de RNAi se encuentra activo (Kitagishi et al., 2011). Los altos niveles de expresion de Dicer en organos linfoides son consistentes con un rol en la respuesta de defensa del camaron. En el caso de Litopenaeus vannamei, se conoce que Dicer-2 esta involucrada en la inmunidad antiviral no especifica y en algun grado soporta la relacion sugerida entre activacion de la inmunidad antiviral y la induccion de RNAi. Se ha propuesto que Dicer-2 podria contribuir a la activacion de la inmunidad antiviral no especifica aumentando la potencia y eficacia del RNAi (Kim et al., 2005). Sin embargo, se requiere mas estudios que permitan identificar los componentes de la via de RNAi en camarones, para entender los mecanismos exactos de la regulacion genica en este proceso (Kitagishi et al., 2011).

Estrategias para suministrar dsRNA y sus limitaciones

La complejidad de suministrar el dsRNA a la celula objetivo, y mantener una cierta concentracion circulando en el organismo, resulta una dificultad para aplicar in vivo esta interesante estrategia antiviral. En mamiferos, los siRNA son relativamente inestables en sangre en su forma nativa y rapidamente son eliminados del organismo mediante degradacion por ribonucleasas, por accion renal o por ingreso no especifico al sistema reticuloendotelial (Shim & Kwon, 2010). Los siRNA son macromoleculas anionicas que no pueden ingresar facilmente a una celula por difusion pasiva, es por ello que se hace relevante el buscar una forma de suministrarlos para permitir la circulacion en el organismo y el ingreso a la celula, para asi protegerlo de una posible hidrolisis enzimatica, para evitar el reconocimiento del sistema inmune y finalmente para aumentar la farmacocinetica del compuesto (Aagard & Rossi, 2007; Shim & Kwon, 2010).

Distintas estrategias se han probado para asegurar el ingreso del dsRNA a la celula. Una estrategia comun es utilizar vehiculos que protejan y faciliten el desplazamiento dentro del organismo, entre ellos los mas utilizados son los liposomas, en particular los cationicos, que debido a su naturaleza anfipatica son permeables en la membrana de fosfolipidos de la celula, posibilitando el ingreso del dsRNA a su interior. Algunos ejemplos son la anisamida o 4-metoxy benzamida y el polietilenglicol (Shim & Kwon, 2010). Otra modalidad de suministro es el uso de polimeros y peptidos, ya que los siRNA se unen facilmente a polimeros cationicos mediante interacciones electrostaticas. La polietilenimina que se obtiene a partir de monomeros de etilenimina es el polimero mas utilizado, sin embargo tiene la desventaja de ser toxico y no biodegradable (Shim & Kwon, 2010). Los polisacaridos cationicos como el quitosano son de bajo costo y muy abundantes, posibilitando la formacion de nanoparticulas con el dsRNA a traves de metodologias muy sencillas (Sarathi et al., 2008; Shim & Kwon, 2010; Plant & LaPatra, 2011). El quitosano se produce a partir de la quitina, polisacarido presente en forma abundante en crustaceos, no es toxico y es biodegradable. Ademas presenta mucoadhesion, lo que se traduce en que las nanoparticulas se adhieren a la membrana mucosa, facilitando el suministro de lo que portan en el tiempo (Plant & LaPatra, 2011). Tambien se utilizan los polipeptidos cationicos, como el atelocolageno, la polilisina y la protamina (Shim & Kwon, 2010) que se acomplejan con los siRNAs a traves de interacciones electrostaticas.

Uno de los cuidados que se debe tener en cuenta, es que el uso de polimeros sinteticos para la entrega de RNAi in vivo es toxico dependiendo de la concentracion al ser administrado en forma sistemica. Esa toxicidad puede ser aminorada por la conjugacion con polimeros hidrofilicos biocompatibles como el polietilenglicol, o removiendo el exceso de polimeros cationicos que no forman complejos. En general, se prefiere utilizar polimeros cationicos naturales (quitosano, protamina) para la entrega de siRNA in vivo (Shim & Kwon, 2010).

Junto con aumentar la estabilidad y permeabilidad, se ha estudiado la mejor forma de suministrar el dsRNA al organismo objetivo. Entre los metodos utilizados como suministro, destacan la inyeccion directa (Posiri et al., 2013), la transfeccion y el consumo de bacterias inactivas libres de RNasa III que sobreexpresan dsRNA, metodo probado exitosamente en nematodos (Caenorhabditis elegans) (Timmons & Fire, 2001) y en camaron (Penaeus monodon) (Sarathi et al., 2008).

Schyth et al. (2007) evaluaron el potencial antiviral de siRNA sintetico inyectado de forma intraperitoneal en trucha arcoiris, desafiada con el virus de la septicemia hemorragica viral. Compararon la efectividad antiviral al inyectarlo en su forma nativa y al inyectar un formulado con un liposoma policationico. El formulado siRNA-liposoma logro una disminucion significativa de la mortalidad, mientras que la inyeccion con siRNA purificado no tuvo ningun efecto sobre la mortalidad de los peces en estudio (Schyth et al., 2007). Esto demuestra la incapacidad del siRNA de llegar al interior de la celula objetivo, mientras que con la ayuda de un liposoma policationico logra entrar y permanecer al interior de la celula con el potencial de silenciar exitosamente los mRNA virales. Se debe considerar que la inyeccion intraperitoneal o intramuscular es un proceso costoso que requiere mucho trabajo, ademas el anestesiar al organismo genera un estres que se puede traducir en una disminucion en su tasa de crecimiento. Pero tal vez el mayor problema es que no se puede inyectar un pez de menos de 20 g de peso, a pesar de que es en ese estado cuando presenta los mayores problemas con enfermedades infecciosas (Plant & LaPatra, 2011).

Sarathi et al. (2008) aplicaron una tecnica distinta, formularon un pellet de alimento recubierto con dsRNA para alimentar camarones adultos (Penaeus monodon) desafiados con el virus de la mancha blanca, una de las principales enfermedades de la industria del camaron. Se formularon dos tipos de pellet, uno de ellos recubierto directamente con la bacteria que sobreexpreso el dsRNA (Fig. 2), inactivada con formaldehido, y el segundo recubierto con nanoparticulas elaboradas de quitosano-dsRNA. Ambos metodos presentaron resultados positivos, con valores de supervivencia mayores al control, sin embargo, fue el pellet con la bacteria inactivada el que presento mejores resultados de supervivencia (Sarathi et al., 2008). Este metodo de suministro de dsRNA en alimento presenta ventajas interesantes; al no separar ni purificar el dsRNA de la celula productora, lo convierte en un metodo mas economico. Ademas, el incorporarlo en el alimento en pellet, posibilita su aplicacion en sistemas abiertos de cultivo como en balsas jaulas y otros sistemas masivos de cultivo.

Por otro lado, se debe considerar que la inmunoestimulacion preventiva se ha transformado en la principal herramienta profilactica para el control de enfermedades en acuicultura, lo que hace que el correcto delivery de las moleculas de dsRNA que producen la inmunoestimulacion sea tambien un desafio. Los sistemas de nano- y micro-encapsulacion son herramientas prometedoras para obtener vacunas eficientes contra enfermedades de peces. En este contexto, el uso de nanocarriers basados en liposomas ha sido pobremente explorado en los peces, aunque han sido exitosamente utilizados en otras especies. Ruyra et al. (2013) reportaron el uso de transportadores liposomales con una alta eficiencia de encapsulacion y baja toxicidad, tanto en modelos in vitro como in vivo (embriones y larvas de pez cebra). Ellos mostraron que un coctel liposomal de LPS-dsRNA es capaz de entrar en contacto con hepatocitos de pez cebra y macrofagos de trucha, siendo preferen-cialmente internalizado por endocitosis. Adicional-mente mostraron que el LPSdsRNA liposomal induce una respuesta antiviral y proinflamatoria especifica en ambos tipos de celulas. Este diseno de sistemas de entrega conteniendo inmunoestimulantes que estimulen potentemente las vias inmunes innatas presentes en casi todos los peces, representa una estrategia completa-mente nueva y prometedora en el control y la prevencion de la salud en sistemas acuicolas (Ruyra et al., 2013).

dsRNA y sus efectos inmunomoduladores

En la actualidad no existen medidas terapeuticas eficaces para combatir las enfermedades virales de los peces de interes. A la fecha, las vacunas se consideran entre los metodos mas efectivos que hay contra las enfermedades en acuicultura. La mayoria de estas hoy en dia utilizan adyuvantes, los cuales mejoran la respuesta humoral y celular (Ruyra et al., 2013), siendo los dsRNA un candidato para potenciar este proceso. En este contexto, una gran cantidad de estudios han sido dirigidos a conocer el mecanismo de accion de los IFNs en peces. Los interferones (IFNs) son citoquinas que inducen un estado antiviral en las celulas y juegan un papel fundamental en la defensa frente a infecciones virales en vertebrados. A la fecha se han descrito tres tipos de IFN en vertebrados. Aquellos del tipo I y III inician su senalizacion a traves de distintos complejos receptores unidos a membrana y todos ellos utilizan la misma via Jak/STAT para inducir un amplio rango de genes antivirales (Randall & Goodbourn, 2008). En mamiferos, el IFN de tipo I comprende predominantemente IFN-[alpha] e IFN-[beta], los cuales se relacionan con la actividad antiviral que involucra al sistema inmune innato; mientras que el IFN tipo II, que comprende IFN-[gamma], esta asociado mayormente a una accion sobre el sistema inmune adaptativo durante la infeccion viral (Sun et al., 2011).

Los IFNs de tipo I, IFN [alpha]/[beta] en mamiferos, son inducidos en las celulas en respuesta a los productos intermediarios dsRNA de la replicacion viral, generando asi la primera barrera para frenar la replicacion del virus (Goodbourn et al., 2000; Lima et al., 2013). Cuando IFNs de tipo I llegan al torrente circulatorio se unen al receptor de IFN [alpha]/[beta] presente en las celulas y desencadenan a traves de la via de senalizacion JAK-STAT la transcripcion de cientos de genes, algunos de los cuales codifican proteinas antivirales. Tal es el caso de la proteina quinasa R dependiente de dsRNA (PKR), la 2',5'-oligoadenilato sintetasa (OAS), la adenosina deaminasa especifica de RNA (ADAR) y la proteina Mx (Boudinot et al., 2001). Ademas del dsRNA viral, la transcripcion de IFN tipo I puede ser inducida por otros acidos nucleicos virales (ssRNA viral) y poly I: C (acido poli-inosinico:policitidilico, dsRNA sintetico), que son reconocidos por los Toll Like Receptors (TLRs) (Tabeta et al., 2004). Los poly I:C son agonistas de los TLR, imitan las propiedades inmunoestimuladoras del dsRNA viral y se ha demostrado que poseen potencial para ser utilizados como adyuvantes de vacunas en experimentos previos (Thim et al., 2012). Estos poly I:C producen inmunoestimulacion a traves de la via de TLR3, localizado en las membranas endosomales y las vias de RIG-1 y MDA5, localizados en el citosol (Fig. 3). TLR3 esta virtualmente presente en todos los peces y en particular, los teleosteos pueden responder a los dsRNA a traves de las vias de TLR3, RiG-1 y MDA5 (Ruyra et al., 2013).

Aunque se sabe poco sobre el sistema de senal del IFN en peces, la identificacion de varios factores reguladores de IFN, receptores de IFN, TLRs, diferentes miembros de la via JAK-STAT y proteinas inducidas por el IFN tipo I, sugiere que este mecanismo esta muy bien conservado en peces y mamiferos. Se ha demostrado la actividad de moleculas tipo IFN frente a infecciones viricas en el suero de trucha arcoiris (De Kinkelin et al., 1982). Graham & Secombes (1990) mostraron que los leucocitos de trucha arcoiris estimulados con mitogeno T-celular y en presencia de otras celulas, secretan una linfoquina con actividad MAF (factor de actividad de macrofagos), y mas tarde observaron que a su vez presentaba actividad IFN (Graham & Secombes, 1990). Por otro lado, Congleton & Sun (1996) demostraron que tras la estimulacion in vitro con un rabdovirus, los leucocitos de rinon de salmonidos, eran capaces de producir linfoquinas con actividad IFN.

Recientemente se han realizado esfuerzos para lograr la descripcion de la respuesta antiviral, en particular, el rol del IFN en peces. Se ha sugerido que el IFN tipo I de pez cebra es homologo al cluster genico de IFN tipo III de mamiferos, aunque esta hipotesis no ha sido probada y se encuentra en discusion (Zou et al., 2007). Mas recientemente se ha sugerido en peces no salmonidos, que IFN tipo I no es homologo a ninguno de los tipos de IFN presente en mamiferos (Hamming et al., 2011). En cuanto a peces salmonidos, se ha descubierto a nivel genomico un cluster genico que contiene 11 genes agrupados en subtipos IFNa1-3, IFNb1-4 e IFNc1-5 (Sun et al., 2009), los cuales de acuerdo a su via de senalizacion podrian ser ortologos a IFN-[alpha] e IFN-[beta] en humanos (Sun et al., 2009; Chang et al., 2014).

En cuanto a su funcionalidad, practicamente no existen datos que soporten que los genes de IFN descubiertos en peces, posean efectos antivirales diferentes a los efectos clasicos que se han descrito en mamiferos. Estudios recientes que han probado la actividad in vivo de los distintos subtipos de IFN tipo I en salmon del Atlantico (IFNa, IFNb or IFNc), han mostrado que los tres inducen la expresion de genes antivirales (Chang et al., 2014). IFNa e IFNc muestran una actividad antiviral similar, mientras que IFNb es menos activo (Svingerud et al., 2012; Collet, 2014). IFNa es producido en la mayoria de las celulas e induce Mx, ISG15 y actividad antiviral contra IPNV. Por su parte, IFNc induce ademas la expresion de receptores para virus RNA (RIG-I, TLR3 y TLR7) y fuertemente, la expresion de Mx (Collet, 2014). Las proteinas Mx son una familia de GTPasas inducidas por interferon, que poseen una potente actividad antiviral, contra varios virus RNA en mamiferos y pollos, aunque los efectos antivirales de Mx en peces no se conocen mayormente. Sin embargo, en salmon del Atlantico se ha mostrado que existe una fuerte correlacion entre la inhibicion de IPNV y la expresion de la proteina Mx, en celulas de salmon estimuladas con IFN (Larsen et al., 2004). Estos resultados sugieren que la administracion de IFNc podria representar un nuevo metodo de proteccion del salmon atlantico contra las infecciones virales (Chang et al., 2014).

En el caso del IFN de tipo II, IFN-[gamma], este es mas similar entre peces y mamiferos, aunque hay algunas es especies de peces que poseen un segundo tipo de IFN-[gamma] llamado [gamma]rel (Sun et al., 2011). En cuanto a las propiedades antivirales de IFNy en peces, se sabe muy poco, aunque se sabe que induce el gen GBP (guanylate binding protein) en trucha (Sun et al., 2011). Las GBPs pertenecen a la familia de las GTPasas inducidas en respuesta a IFN. De forma similar a lo que ocurre con Mx, las GBPs poseen una potente actividad antiviral contra un amplio rango de virus RNA en mamiferos, tales como el virus de la estomatitis vesicular y el virus influenza, entre otros (Nordmann et al., 2012).

En cuanto a la respuesta inhibitoria no especifica causada por el interferon (inducido por dsRNA) en la celula, inicialmente complico la aplicacion de RNAi en vertebrados, sin embargo, se ha encontrado que esto ocurre solo cuando las concentraciones de RNAi aplicados son muy elevadas, o el largo del dsRNA exogeno es mayor a los 30 pares de bases (Schyth et al., 2007; Lima et al., 2013). Considerando los efectos positivos que pueden tener los dsRNA al estimular una potente via de inmunidad innata, es necesario progresar en los procesos que permitan implementar con mayor enfasis el concepto de inmunoestimulacion preventiva, abriendo un enfoque completamente nuevo en la optimizacion de la salud de los peces.

Perspectivas futuras

La estrategia antiviral y/o de estimulacion del sistema inmune innato utilizando dsRNA se proyecta como una alternativa real en sistemas de acuicultura que son afectados por infecciones virales. La efectividad del proceso y la secuencia-especificidad de la accion del RNAi, se muestran como sus principales ventajas. Sin embargo, la necesidad de que el dsRNA se encuentre presente al interior de la celula objetivo se convierte en la principal amenaza para este novedoso metodo antiviral. En consecuencia, se hace necesario investigar en tecnologias de suministro que aseguren el ingreso del dsRNA al organismo y luego a la celula objetivo. Al mismo tiempo se requiere identificar formulados que sean estables para resistir almacenaje y uso industrial a gran escala.

CONCLUSIONES

El uso de los dsRNA presenta un interesante potencial para la estimulacion del sistema inmune innato y para el control de enfermedades infecciosas causadas por virus en sistemas de acuicultura. Algunos estudios han mostrado los efectos inmunomoduladores que podrian tener los dsRNA utilizados en vacunas para inducir la estimulacion del sistema inmune innato. De igual forma, algunos estudios han demostrado efectividad sobre virus que causan importantes problemas en el cultivo de crustaceos y peces, entre ellos, el virus de la mancha blanca, virus hemorragico de la carpa y el virus de la septicemia hemorragica. Para obtener mejores resultados, es necesario profundizar en el estudio del metodo y formulacion para suministrar eficientemente el dsRNA o los RNAi, considerando variables como la estabilidad, toxicidad, ausencia de efectos no especificos, costo, y la factibilidad de usarlo en sistemas masivos de cultivo.

DOI: 10.3856/vol43-issue3-fulltext-1

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a Erick Guinez y Sebastian Ramirez por su apoyo en el diseno y construccion de figuras. Katherine Garcia y Jaime Romero agradecen el aporte de Fondecyt Proyecto Postdoctorado 3120081 y Fondef D10I1056, respectivamente.

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Received: 29 September 2014; Accepted: 14 January 2015

Ljubomir Papic (1), Katherine Garcia (2) & Jaime Romero (2)

(1) Doctorado en Acuicultura, Programa Cooperativo Universidad de Chile Universidad Catolica del Norte, Pontificia Universidad Catolica de Valparaiso, Chile

(2) Instituto de Nutricion y Tecnologia de los Alimentos (INTA), Universidad de Chile Avda. El Libano 5524, Santiago, Chile

Corresponding autor: Jaime Romero (jromero@inta.cl)

Corresponding editor: Patricio Arana

Caption: Figura 1. Modelo simplificado del sistema de silenciamiento genico con RNAi a partir de un dsRNA que ingresa a la celula, resultando en la hidrolisis del mRNA objetivo. El dsRNA se muestra al inicio como circulos pequenos de color azul entrelazados, simulando una doble hebra. Este dsRNA es reconocido por Dicer, la cual procesa esta molecula generando pequenos RNAs de doble cadena (small inteference RNA duplex o siRNA duplex). Posteriormente, estos siRNA duplex son reconocidos por el complejo RISC (multi-subunit RNA-induced silencing complex) activado, compuesto por varias proteinas (Ago2, Dicer 2, PACT, TRBP), el cual denatura la doble cadena del siRNA y degrada una de las hebras, dejando la otra unida al complejo (ver en figura accion de RISC). Si la hebra que queda unida a RISC es complementaria a un RNA mensajero (mRNA, circulos pequenos rojos que simulan una hebra simple), se produce la hibridacion de ambas hebras por complementariedad de bases y, en consecuencia el complejo RISC procede a la degradacion del mRNA, generando un silenciamiento especifico de la expresion del gen.

Caption: Figura 2. Esquema general de la produccion del dsRNA en la bacteria E. coli HT115. La expresion de la RNA polimerasa T7 (triangulos rojos), codificada en el cromosoma de E. coli HT115 bajo el control del operon lac, es inducida por la adicion de IPTG o lactosa (circulo verde ubicado al exterior de la bacteria que es representada como el ovalo azul). La RNA polimerasa reconoce ambos promotores T7 presentes en el plasmido L3330 (circulo verde), que estan orientados en forma inversa, y procede a la sintesis de los RNA de doble cadena (pequenas hebras representadas por circulos azules entrelazados que simulan una doble cadena), los cuales mediaran el proceso de interferencia.

Caption: Figura 3. Activacion de la via de interferon a traves de dsRNA, mediada por TLR3 (izquierda) o RIG-I/MDA5 (derecha). TLR3 reconoce los dsRNA en el lumen del endosoma (ovalo celeste), luego de lo cual dimeriza, se une a CD14 y activa una cascada de senales que lleva a su vez, a la activacion de factores de transcripcion. Los factores de transcripcion activados se traslocan del citoplasma al nucleo, donde se unen a los promotores de sus genes blanco (IFNs, TNF, AIP3, CXCL10, CCL5, SElE, IFIT1-IFIT2) e inducen su transcripcion. Por su parte, las helicasas RIG-1 y MDA5 (ovalo verde) localizadas en el citosol, reconocen el dsRNA y utilizan la proteina mitocondrial unida a membrana (IPS1, ovalo morado) como adaptador especifico para activar una cascada de senales que activa a su vez, factores de transcripcion que llevan a la induccion de la expresion de genes similares a los que se activan por la via del TLR-3 (IFNs, TNF, AIP3, CXCL10, CCL5, SElE, IFIT1-IFIT2).
Tabla 1. Algunos estudios de aplicacion de RNAi como terapia
antiviral en acuicultura.

Celula u          Gen objetivo         Metodo de           Virus
organismo                             suministro

Embriones de           GFP          Micro-inyeccion         --
  trucha
  arcoiris
Celulas            Proteina de       Transfeccion       Iridovirus
  musculares          capside                           tiger frog
  de                                                       virus
  Pimephales
  promelas
Embriones de    Nucleoproteina-N     Transfeccion       Rabdovirus.
  salmon                                                Septicemia
  chinnook                                              hemorragica
                                                           viral
Celulas de        L-polimerasa       Transfeccion       Rabdovirus.
  epitelioma                                            Septicemia
  de carpa                                              hemorragica
                                                           viral
Celulas de        Glicoproteina      Transfeccion       Rabdovirus.
  epitelioma                                            Septicemia
  de carpa                                              hemorragica
                                                           viral
Celulas de        Glicoproteina      Transfeccion       Rabdovirus.
  epitelioma                                            Septicemia
  de carpa                                              hemorragica
                                                           viral

Celulas de        Glicoproteina      Transfeccion       Rabdovirus.
  epitelioma                                            Septicemia
  EPC y                                                 hemorragica
  celulas                                                  viral
  CHSE-214
Juveniles de      Glicoproteina        Inyeccion        Rabdovirus.
  trucha                            intraperitoneal     Septicemia
  arcoiris                                              hemorragica
                                                           viral
Trucha            Glicoproteina        Inyeccion        Rabdovirus.
  arcoiris                          intraperitoneal     Septicemia
                                                        hemorragica
                                                           viral
Embriones          Proteina de       Transfeccion     Iridovirus del
  de turbot           capside                         besugo (red sea
                                                          bream)
                                                      Rabdovirus del
                                                          hirame
Celulas de         Proteina de       Transfeccion     Iridovirus del
  Haemulon           capside                            Oplegnathus
  plumierii                                              fasciatus
Celulas de       RNA polimerasa      Transfeccion        Reovirus
  rinon de         dep. RNA y                         hemorragico de
  carpa            proteina de                          carpa (GCR)
                     capside
Celulas de        RNA dep. RNA       Transfeccion        Reovirus
  rinon de         polimerasa                         hemorragico de
  carpa (CIK)    (RdRp) Proteina                        carpa (GCR)
                   de capside
                      (OCP)
Celulas de         Proteina de       Transfeccion      Virus de rana
  ovarios de      envoltura 53R                        grylio (RVG)
  carpa

Celula u        Resultado principal
organismo

Embriones de    siRNAs suprimen efectivamente la
  trucha          expresion transiente de GFP
  arcoiris        localizado episomalmente, en un
                  estado de desarrollo temprano y en
                  embriones de truchas transgenicas
Celulas         Silenciamiento especifico del gen
  musculares      reportero lacZ en celulas FHM por
  de              expresion de shRNAs desde
  Pimephales      plasmidos o por siRNAs
  promelas        transfectados. Silenciamiento de
                  proteina mayor de capside e
                  inhibicion de la replicacion viral
                  en celulas HeLa con siRNAs
                  especificos
Embriones de    27-25 mer dsiRNAs. Reducen el
  salmon          nivel de expresion genica viral
  chinnook        y la replicacion viral en forma
                  especifica en cultivo celular in
                  vitro
Celulas de      Varias secuencias siRNA.
  epitelioma      Interferencia no especifica
  de carpa        para la infeccion con el virus
                  VHSV. Interferencia similar
                  para la infeccion con un
                  rabdovirus heterologo
Celulas de      Transfeccion con tres siRNAs
  epitelioma      diferentes especificos contra
  de carpa        el gen de la glicoproteina viral,
                  inhibe eficientemente la
                  multiplicacion viral en cultivos
                  celulares infectados
Celulas de      Vector produce shRNAs.
  epitelioma      Apagamiento de la expresion del
  de carpa        mRNA del gen G en forma
                  secuencia especifica en cultivos
                  de celulas EPC. Supresion de la
                  replicacion viral especifica
                  dependiente de RNAi
Celulas de      dsRNAs largos contra el gen G de
  epitelioma      VHSV suprimen efectivamente la
  EPC y           expresion de su gen blanco,
  celulas         mientras que los dsRNAs controles
  CHSE-214        no tienen efecto
Juveniles de    Disminucion de la mortalidad de
  trucha          los peces desafiados con el virus.
  arcoiris        La proteccion no dependio de los
                  siRNA, mas bien fue dependiente
                  de respuesta interferon
Trucha          Los siRNAs reducen la mortalidad
  arcoiris        en desafios con VHSH. Al ser
                  modificados, los siRNAs reducen
                  la proteccion antiviral.
                  Activacion de sistema IFN.
Embriones       Los miR entregados como pre-
  de turbot       miRNA en celulas transfectadas,
                  inhiben la replicacion viral cuando
                  las celulas fueron infectadas con
                  el virus correspondiente. Sin
                  embargo, el efecto inhibitorio no
                  fue especifico y se observo
                  tambien en celulas transfectadas
                  con un plasmido control.
                  Activacion de la via IFN
Celulas de      Celulas transfectadas que producen
  Haemulon        RNAi contra la proteina de capside
  plumierii       viral, exhiben mas resistencia al
                  desafio con el virus que las
                  celulas control
Celulas de      Los mRNAs del virus GCR fueron
  rinon de        reducidos significativamente
  carpa           (sobre un 80%) en celulas CIK
                  transfectadas con siRNAs e
                  infectadas con GCR
Celulas de      El efecto citopatico inducido por
  rinon de        GCRV en celulas transfectadas fue
  carpa (CIK)     retrasado y su intensidad reducida
                  significativamente. El analisis
                  cuantitativo por RT-PCR en
                  tiempo real mostro que la
                  expresion de los genes virales
                  RdRp y OCP fueron reducidos en
                  89% y 73% respectivamente
Celulas de      miRNA silencio la expresion de la
  ovarios de      proteina de envoltura viral y el
  carpa           ensamblaje de los viriones fue
                  deficiente

Celula u        Referencia
organismo

Embriones de    Bonanuntanasarn
  trucha          et al. (2003)
  arcoiris
Celulas         Xie et al. (2005)
  musculares
  de
  Pimephales
  promelas
Embriones de    Bohle et al. (2011)
  salmon
  chinnook
Celulas de      Ruiz et al. (2009)
  epitelioma
  de carpa
Celulas de      Schyth et al.(2006)
  epitelioma
  de carpa
Celulas de      Kim & Kim (2011)
  epitelioma
  de carpa
Celulas de      Kim et al. (2012)
  epitelioma
  EPC y
  celulas
  CHSE-214
Juveniles de    Schyth et al. (2007)
  trucha
  arcoiris
Trucha          Schyth et al. (2012)
  arcoiris
Embriones       Dang et al. (2008)
  de turbot
Celulas de      Zenke et al. (2010)
  Haemulon
  plumierii
Celulas de      Li et al. (2009)
  rinon de
  carpa
Celulas de      Ma et al. (2011)
  rinon de
  carpa (CIK)
Celulas de      Kim et al. (2010)
  ovarios de
  carpa
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Author:Papic, Ljubomir; Garcia, Katherine; Romero, Jaime
Publication:Latin American Journal of Aquatic Research
Date:Jul 1, 2015
Words:8772
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