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Produccion de embriones de bufalo por fertilizacion in vitro luego de la maduracion de los ovocitos durante el transporte prolongado.

Resumen

El bufalo (Bubalus bubalis) es una especie con excelente adaptacion a sectores inundables. El mejoramiento genetico a traves de superovulacion y transferencia embrionaria ha tenido escasos resultados debido a dificultades en la deteccion de celo, pobre respuesta ovarica y limitada recuperacion de embriones post-lavaje. La tecnica de fertilizacion in vitro de embriones (FIV) es una biotecnologia de gran impacto en el progreso genetico. El objetivo del presente trabajo fue estudiar los eventos tempranos de la FIV, analizando la tasa de maduracion y desarrollo embrionario post-fertilizacion de ovocitos madurados in vitro (IVM) durante el transporte. Ovocitos bovinos y bubalinos fueron obtenidos por puncion folicular de ovarios post-mortem e IVM durante el transporte por un periodo de 18 h. Se realizo la FIV con toros de fertilidad comprobada, con una concentracion en microgotas de inseminacion de 3-4 x [10.sup.6] espermatozoides motiles/ml por un periodo de 6 horas. Los embriones fueron cultivados en medio oviductal sintetico SOFaa en incubadora gaseada y ambiente humidificado a 38,5[grados]C durante 9 dias. Se evaluaron las tasas de IVM, clivaje (dia 2 post-fertilizacion) y blastocisto (dias 7 a 9). Los resultados fueron analizados estadisticamente utilizando Fischer's Exact Test (p<0,05). No se observaron diferencias significativas en la tasa de maduracion de ovocitos bubalinos de buena calidad respecto al control sin transporte (72 vs 88%), pero se registro una reduccion significativa en la maduracion de los ovocitos bubalinos de mala calidad (35%). Asimismo, se lograron producir los primeros embriones bubalinos luego de FIV, aunque las tasas de clivaje (34 vs 70 y 78%) y blastocisto (3 vs 27 y 31%) fueron significativamente menores en bufalos que en bovinos con y sin transporte, respectivamente. Los datos del presente trabajo constituirian el primer informe de FIV en bufalos y produccion in vitro de embriones luego de IVM de ovocitos durante el transporte.

Palabras clave: bufalo, embriones, fertilizacion in vitro, transporte.

Abstract

The water buffalo (Bubalus bubalis) is a species with excellent adaptation to flood-prone environments. Genetic improvement using the multiple ovulation and embryo transfer approach has been met with poor results in the buffalo, mainly due to difficulties in heat detection, erratic ovarian response to treatments and low embryo recovery post-flush. In vitro fertilization (IVF) is a powerful reproductive biotechnology that may provide a tool for genetic improvement in this species. The objective of this experiment was to study early embryonic events after IVF in the buffalo, analyzing in vitro maturation and IVF of oocytes matured during ground transportation. Bovine and bubaline oocytes were collected by follicular aspiration of post-mortem ovaries and in vitro matured for 18 h during ground transportation. In vitro fertilization was conducted, semen form bulls of proven fertility was processed and adjusted to a final concentration of 3-4 x [10.sup.6] motile spermatozoa/ml in the insemination drops, oocytes were co-incubated for a period of 6 h. Embryos were then cultured in synthetic oviductal fluid (SOFaa) medium in an incubator and humidified atmosphere at 38.5[grados]C for 9 days. Oocyte maturation, cleavage and blastocyst rates were evaluated on days 0, 2 and 7 to 9, respectively and results were statistically analyzed using Fischer's Exact Test (p<0.05). No significant difference was observed in the maturation rate of bubaline oocytes of good quality vs the non-transported control (72 vs 88%); however, the maturation rate of bubaline oocytes of bad quality was significantly lower (35%) than the rest of the groups. Data of present experiment are the first report of buffalo embryos produced by IVF from oocytes matured during transportation, although the cleavage (34 vs 70 and 78%) and blastocyst (3 vs 27 and 31%) rates were significantly lower for the buffalo than for the transported and non-transported domestic cattle, respectively.

Key words: buffalo, embryos, in vitro fertilization, transport.

Buffalo embryos produced by in vitro fertilization from oocytes matured during long-term transport.

INTRODUCCION

El bufalo domestico, una especie introducida desde continente asiatico, es tradicionalmente agrupado dentro de la sub-familia Bovidae, genero Bubalus, especie bubalis. Argentina cuenta en la actualidad con la cuarta poblacion bubalina del continente, aproximadamente 100.000 animales (11) y produce tres de las razas de mayor importancia economica en el mundo: Mediterranea, Murrah y Jafarabadi.

Nuestro pais posee varias regiones sub-explotadas desde el punto de vista ganadero debido a la falta de adaptacion del ganado vacuno a sectores bajos e inundables. Por su gran capacidad de conversion de pastos naturales en carne y por la perfecta coincidencia de las curvas de requerimiento con las curvas de oferta forrajera del subtropico humedo, el bufalo representa una herramienta valiosa para la presente y futura expansion ganadera de zonas marginales como el litoral del pais y la cuenca del rio Salado.

El mejoramiento genetico en bufalos mediante la transferencia de embriones in vivo ha tenido escaso exito, principalmente debido a las dificultades en la deteccion de celo (3), pobre respuesta ovarica y limitada recuperacion de embriones post-lavaje. Por la maximizacion en la eficiencia de la utilizacion del germoplasma y su efecto sobre el intervalo generacional, la produccion de embriones por fertilizacion in vitro (FIV) es una herramienta productiva de gran impacto en el progreso genetico (15).

Una de las mayores limitantes en la implementacion de la FIV en cualquier especie es el transporte de la celula reproductiva de la hembra, el ovocito, hasta instalaciones con equipamiento y tecnicos capacitados para la realizacion de la fertilizacion in vitro. Adicionalmente, la eficiencia de la produccion in vitro de embriones transferibles requiere que, para especies nuevas o no tradicionales, sea necesario el desarrollo de la metodologia y evaluacion de protocolos de fertilizacion in vitro con material derivado de frigorifico (ovocitos de genetica y origen desconocido) previo a su implementacion comercial.

El objetivo del trabajo fue estudiar los eventos tempranos de la fertilizacion in vitro en el bufalo, en particular la tasa de maduracion in vitro (IVM) y la viabilidad de ovocitos bubalinos madurados in vitro durante el transporte terrestre durante 18 horas, asi como su potencial de desarrollo luego de la fertilizacion in vitro.

MATERIAL Y METODOS

Fueron recuperados ovocitos de bufalas y vacas por puncion folicular de ovarios post-mortem (frigorifico). Los ovarios fueron transportados inmediatamente al laboratorio en PBS (P-4417, Sigma, St. Louis, MO, USA) suplementado con gentamicina (50 mg/L) a 30[grados]C en contenedores isotermicos. Una vez en el laboratorio (<1 hora de transito), los ovarios fueron lavados en PBS + gentamicina y los complejos cumulus-ovocito (COCs) fueron recuperados por puncion folicular.

Los foliculos visibles en la superficie del ovario fueron aspirados con jeringa de 5 mi con aguja 21 g. El aislamiento de los COCs fue realizado bajo lupa estereoscopica a 40X. Una vez aislados los ovocitos fueron clasificados por calidad de acuerdo a la categorizacion IETS (International Embryo Transfer Society) en grado 1 (excelentes, 3 o mas capas de cumulus compacto), grado 2 (buenos, 2-3 capas de cumulus), grado 3 (regulares, corona radiata unicamente) o grado 4 (malos, denudados, picnoticos o atresicos).

Una vez clasificados, los ovocitos fueron lavados y colocados en tubos Eppendorf con medio de transporte para maduracion in vitro consistente de TCM-199 (Invitrogen 11150-059), 5 ug/ml pFSH (Follitropin, Bioniche), 50 g/mL de gentamicina (Sigma), 25 mM hepes (Sigma) y 10% suero fetal bovino (Gibco), siendo trasladados por via terrestre en una transportadora de embriones (Minitube, Alemania) de temperatura controlada (37[grados]C) durante 18 horas.

Una vez recibidos, los ovocitos fueron evaluados en base a presencia y grado de expansion de las celulas del cumulus y se procedio al pelado mecanico del cumulus por pipeteado (pipeta de Pasteur de borosilicato estirada), en TCM suplementado con 1 mg/ml de hialuronidasa (Sigma).

El estado de maduracion fue evaluado por la presencia del primer cuerpo polar a las 18 horas de IVM. Adicionalmente, algunos ovocitos fueron aleatoriamente seleccionados para evaluacion de maduracion nuclear y configuracion de cromatina, por tincion con bisbenzimida (Hoechst 33342) y visualizacion en microscopio invertido Nikon Ti-Ucon optica Hoffman (40X) y fluorescencia (filtro UV). La visualizacion y rotacion de ovocitos fue asistida por micromanipuladores y microinyectores Narishige.

El estado de maduracion nuclear y configuracion de cromatina de los ovocitos tenidos fue clasificado en GV (vesicula germinal), GVBD (vesicula germinal en transicion), MI (metafase I) y Mil (metafase II). El resto de los ovocitos fue sometido a protocolo de fertilizacion in vitro de acuerdo con el metodo publicado por Brackett y Oliphant (2), con modificaciones. El semen de un toro bubalino de fertilidad comprobada y buenos parametros andrologicos post-descongelacion fue colocado a 37[grados]C durante 1 minuto en bano de agua, diluido en medio de fertilizacion con heparina y cafeina; la fraccion rica en espermatozoides con motilidad individual progresiva fue aislada a traves de metodo swim-up.

Los espermatozoides fueron lavados 2 veces por centrifugacion (6 min a 200 rpm) en medio Brackett-Oliphant (BO) (2) suplementado con 7,75 mM de lactato de calcio y 20% de suero fetal bovino. El pellet fue resuspendido en medio BO e incubado a 38[grados]C y 5% C[O.sub.2] en aire durante 1 hora. Los ovocitos fueron lavados en medio BO-3% BSA y coincubados en microgotas de suspension de espermatozoides (concentracion 3-4 x [10.sup.6] espermatozoides/ml) durante un periodo de 6 horas (15 ovocitos/gota de 70 [micron]l).

Luego del periodo de coincubacion, los ovocitos fueron lavados dos veces en medio de cultivo embrionario SOFaa y cultivados en incubadora con 5% C[O.sub.2] en aire de ambiente humidificado a 38,5[grados]C durante 9 dias. Los resultados fueron analizados estadisticamente utilizando Fischer's Exact Test, con un valor a del 5%.

[FIGURA 1 OMITIR]

RESULTADOS

Los resultados de la evaluacion de la maduracion in vitro durante el transporte y la calidad respecto a la presencia de cumulus expandido y su tasa de maduracion nuclear se presentan en la Tabla 1 y las Figuras 1 y 2. Si bien el numero de replicas (2) del estudio fue limitado, los resultados de maduracion in vitro del control (vaca), indican que fue viable realizar la maduracion in vitro durante el transporte sin afectar significativamente la calidad y la maduracion nuclear de los ovocitos de ambas especies. Ademas, los resultados indican una alta proporcion de lisado y una significativa disminucion de la viabilidad y maduracion nuclear del ovocito bubalino de menor calidad (grados 3 y 4).

Los resultados preliminares de fertilizacion in vitro en el bufalo se presentan en la Tabla 2 y Figura 3. No se observaron efectos significativos de la maduracion in vitro durante el transporte de los ovocitos bovinos (p>0,05).

DISCUSION

Una de las mayores limitantes en la implementacion de la fertilizacion in vitro en cualquier especie es el transporte de la celula reproductiva de la hembra u ovocito hasta instalaciones con equipamiento y tecnicos capacitados para la realizacion de la fertilizacion in vitro. A diferencia de los programas de transferencia embrionaria, que pueden ser implementados con exito dentro del mismo establecimiento, la fertilizacion in vitro requiere de tecnicos capacitados y equipamiento de mayor complejidad. Ello determina que la fertilizacion in vitro deba realizarse en laboratorios especializados, frecuentemente distantes de los establecimientos donde se encuentran las donantes.

[FIGURA 2 OMITIR]

[FIGURA 3 OMITIR]

La maduracion in vitro de ovocitos inmaduros (vesicula germinal) durante el transporte ha sido ampliamente estudiada en el bovino domestico (1,10). Varios reportes dan cuenta que la calidad del ovocito es el factor de mayor peso en la tasa de produccion de embriones por fertilizacion in vitro, particularmente la proporcion de embriones que alcanzan el estadio de blastocisto y la susceptibilidad de los mismos a la criopreservacion (12).

Si bien existen relaciones entre las condiciones de cultivo in vitro y la calidad y cantidad de embriones logrados, hay un marcado efecto del origen y calidad del ovocito (13). Otros investigadores reportaron que los ovocitos madurados in vivo (maduracion intrafolicular) poseen significativamente mayores probabilidades de alcanzar el estadio de blastocisto post-fertilizacion in vitro que aquellos embriones derivados de ovocitos madurados in vitro (6-8,14).

Los resultados del presente estudio indican que es posible realizar la maduracion in vitro del ovocito bubalino durante el transporte terrestre sin comprometer la dinamica de maduracion nuclear ni la proporcion de ovocitos que alcanzan el estadio de metafase-II (preovulatorio).

Es interesante destacar que la calidad inicial del ovocito bubalino (grados 1-2 vs grados 3-4) tuvo un efecto significativo sobre la proporcion de ovocitos madurados, a diferencia del bovino, en el cual se observo una tendencia a la disminucion de tasa de maduracion nuclear, la cual no alcanzo niveles significativos. Estos resultados preliminares indicarian una mayor susceptibilidad del ovocito bubalino durante la maduracion in vitro, razon por la cual podria ser necesario ser mas estricto en la seleccion de la calidad de los ovocitos para su maduracion y fertilizacion in vitro.

Diversos autores han reportado un desarrollo embrionario mas veloz en la especie bubalina comparado con el del bovino domestico. Se ha observado que la zona pelucida desaparece luego de la eclosion del embrion, dificultando la recuperacion de embriones luego del lavaje uterino dado que el blastocele se encuentra frecuentemente colapsado (4,5). Este evento, que ha sido reportado entre los dias 8,5 a 10 post-estro para el bovino, se ha observado anticipadamente en el bubalino, para el cual se ha reportado la eclosion in vivo entre los dias 6,5 a 7 post-estro. Es posible que esta diferencia en la fisiologia embrionaria determine dificultades tanto en la recuperacion de los embriones como en la sincronizacion con las receptoras.

En coincidencia con lo reportado por otros grupos, el desarrollo embrionario in vitro de los embriones bubalinos registrado en el presente trabajo tambien exhibio diferencias respecto a los embriones bovinos, alcanzandose el estadio de morula entre los dias 3 a 4 de cultivo in vitro (vs dias 5 a 6 para el embrion bovino). En coincidencia con reportes de otros investigadores, el clivaje y produccion de blastocistos de los embriones bubalinos de este estudio preliminar resultaron significativamente menores (p<0,05) que aquellos observados para el bovino domestico (5,9).

Los datos obtenidos en el presente trabajo constituirian el primer informe de fertilizacion in vitro en el bufalo y produccion in vitro de embriones luego de la maduracion in vitro de ovocitos durante el transporte. Se impone la realizacion de nuevos ensayos para la evaluacion de estrategias capaces de mejorar la calidad y competencia de los ovocitos transportados, asi como metodos para aumentar las tasas de clivaje y blastocistos del embrion bubalino.

Agradecimientos. Este trabajo fue posible gracias a financiacion de la Facultad de Ciencias Agrarias UCA y la Facultad de Ciencias Veterinarias UNNE.

Recibido: 19 septiembre 2013 / Aceptado: 22 octubre 2013

REFERENCIAS

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(3.) Crudeli GA, Pellerano GS, Olazarri MJ, Konrad JL, Patino EM, Cedres JF. 2008. Efecto de diferentes variables sobre la prenez en bufalas sometidas a sincronizacion del celo e inseminacion artificial a tiempo fijo. Rev Vet 19: 14-17.

(4.) Di Francesco S, Novoa MV, Vecchio D, Neglia G, Boccia L, Campanile G, Zicarelli L, Gasparrini B. 2012. Ovum pick-up and in vitro embryo production (OPUIVEP) in Mediterranean Italian buffalo performed in different seasons. Theriogenology 77: 148-154.

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Konrad, J.L. [1,3]; Scian, R. [2]; Garrido, M.J. [1]; Taminelli, G. [2]; Sansinena, M. [2, 3]

[1] Catedra de Teriogenologia, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Nordeste, Sargento Cabral 2139, Corrientes (3400), Argentina. Tel/Fax 0379-4425723. [2] Lab. Reprod. Anim. Fac. Cs. Agr., Univ. Catolica Arg. [3] CONICET. E-mail: konradjl@hotmail.com.
Tabla 1. Morfologia y maduracion nuclear de ovocitos de bufala
y vaca luego de 18 horas de maduracion in vitro (IVM) durante el
transporte.

tratamiento                     n    LI   SL   CC     M/SL

vaca control (sin transporte)   49   0    49   49   43 (88)
vaca (grado 1-2)                50   0    50   50   43 (86)
vaca (grado 3-4)                52   9    43   33   27 (63)
bufala (grado 1-2)              18   3    15   15   11 (72)
bufala (grado 3-4)              21   10   11   5    4 (35) *

tratamiento                               T

                                GV   GVBD   MI   MII

vaca control (sin transporte)   6     0     0    43
vaca (grado 1-2)                6     1     0    43
vaca (grado 3-4)                8     3     5    27
bufala (grado 1-2)              3     1     0    11
bufala (grado 3-4)              4     1     2     4

n: cantidad, LI: Usados, SL: sin lisar, CC: con cumulus, M/SL: numero
de ovocitos maduros/numero de ovocitos sin lisar, con oolema intacto,
T: tincion bisbenzimide (Hoechst 33342, 5 [miron]g/ml) y evaluacion
por fluorescencia (UV), GV (vesicula germinal), GVBD (vesicula
germinal en transicion), MI (metafase I) y MII (metafase II).

* diferencia significativa entre valores de una misma columna
(p<0,05).

Tabla 2. Resultados preliminares de fertilizacion in vitro y
produccion in vitro de embriones bovinos y bubalinos luego de la
maduracion in vitro del ovocito durante el transporte de 18 horas.

                                 dia 2                dias 7-9

                                      No. (%)
                           No. (%)     8-16     No. (%)    No. (%)
tratamiento          n     divados    celulas   morula   blastocisto

vaca control (sin    45    35 (78)    12 (27)   2 (4)      14 (31)
transporte)

vaca (transporte     50    35 (70)    11 (22)   4 (8)      13 (27)
18 h)

bufala (transporte   29   10 (34) *   6 (20)    3 (10)     1 (3) *
18 h)

dia: dias en cultivo in vitro. * Diferencia significativa entre
valores de una misma columna, (p<0,05).
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Author:Konrad, J.L.; Scian, R.; Garrido, M.J.; Taminelli, G.; Sansinena, M.
Publication:Revista Veterinaria
Date:Jul 1, 2013
Words:3446
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