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Produccion de IFN-[gamma] en cultivos de linfocitos humanos por efecto de los extractos metanolicos de cuatro ecotipos de Lepidium peruvianum, Chacon (Brassicaceae).

[gamma]-IFN production in human lymphocytes cultures for effect of the methanolic extracts from four ecotypes of Lepidium peruvianum, Chacon (Brassicaceae)

Resumen

Se estudio la actividad inmunoduladora sobre cultivos de linfocitos T humanos de sangre periferica. Se evaluo la produccion de IFN-[gamma] inducida por los extractos metanolicos (EM) de los ecotipos blanco, negro, rojo y morado de Lepidium peruvianum (conocida tambien como Lepidium meyenii Walp.) maca. Luego de cultivar los linfocitos con los respectivos EM de maca durante 14 horas solo el EM del ecotipo morado indujo la produccion significativa de IFN- [gamma] cuantificada mediante Elispot. El extracto metanolico del ecotipo morado de maca posee propiedades inmunoestimuladoras importantes, desencadenando la activacion de linfocitos T humanos.

Palabras Clave: Lepidium peruvianum, Lepidium meyenii, ecotipos de maca, maca, inmunomodulacion por maca, Interferon-[gamma].

Abstract

The immunomodulatory activity was studied in function of the production of [gamma] IFN induced by the methanolic extracts (ME) of the white, black, red and purple ecotypes of Lepidium peruvianum, Chacon (at present Lepidium meyenii Walp.) maca, on cultures of human T lymphocytes obtained of periferic blood. After cultivating the lymphocytes with the respective ME of maca during 14 hours, only the ME of the purple ecotype induced the significant production of IFN-[gamma] by Elispot quantified. The methanolic extract of the purple ecotype of maca possesses important immunostimulatory properties triggering the activation of the human T lymphocytes.

Key words: Lepidium peruvianum, Lepidium meyenii, maca ecotypes, maca, immunomodulation for maca, [gamma]-Interferon.

Introduccion

Lepidium peruvianum Chacon, (tambien conocida como Lepidium meyenii Walp.) maca, es una Brassicacea oriunda de los Andes peruanos que crece desde los 3800 hasta los 4500 m de altitud. Su domesticacion y uso en la alimentacion data de la epoca preinca con la cultura Pumpush en la meseta del Bombon, departamento de Junin (Peru) (Chacon, 1997).

El interferon gamma (IFN-?) es una citoquina importante que ejerce efectos inmunomoduladores sobre celulas como macrofagos, linfocitos T y B y celulas NK. Esta citoquina activa macrofagos, potencia la actividad bactericida y tumoricida de las celulas del sistema inmune, fortalece y mantiene la expresion del complejo mayor de histocompatibilidad en los macrofagos y otras celulas inmunes y por tanto potencia la actividad de los linfocitos T (Stites y Terr, 1994).

Una forma de medir la actividad inmunomoduladora de determinados extractos vegetales sobre la respuesta celular de linfocitos in vitro es mediante la deteccion de la produccion de citoquinas, deteccion que puede realizarse usando el inmunoensayo de Elispot. La tecnica de ELISPOT es una micro tecnica enzimaticacolorimetrica altamente especifica y sensible que permite estudiar caracteristicas especificas de la inmunidad celular, por ejemplo: Respuestas de linfocitos T helper CD4+ y citotoxicos CD8+. Para este proposito, los linfocitos extraidos de sangre periferica son estimulados con los extractos vegetales y luego son analizados para detectar produccion de interferon-[gamma] (IFN-[gamma]. Si los linfocitos fueran activados en la muestra, se estimularia la secrecion de IFN? [gamma] y las celulas serian identificadas usando un sustrato de color (Zuniga et al., 2006). Esta informacion es de suma importancia para el tratamiento medico y permitira que las aplicaciones en la industrializacion farmaceutica de la maca tengan sustento cientifico.

Otros investigadores tambien han encontrado plantas nativas con propiedades inmunomoduladoras importantes. El 2005 en la Universidad de Ciencia y Tecnologia de Hong Kong, Chan et al., encontraron que la formula herbal de CKBM compuesta de cinco hierbas medicinales chinas (Panax ginseng, Schisandra chinensis, Fructus crataegi, Ziziphus jujube and Glycine max) suplementado con Saccharomyces cerevisiae procesada, fue capaz de iniciar la secrecion de IL6, IL10,TNF-[alfa]e IFN-[gamma] por celulas mononucleares de sangre periferica in vitro (Chan et al., 2005). Una planta medicinal con propiedades similares es el Aramu (Petiveria alliacea) cuyo extracto acuoso demostro poseer efecto inmunomodulador aumentando la produccion de IFN-[gamma] en ratones tratados (Queiroz et al., 2000).

En el 2004, un grupo taiwanes encontro que el extracto etanolico de Panax ginseng incrementaba la expresion de IL-2, IFN? [gamma], IL4 e IL-10 por celulas de bazo de ratones (Larsen et al., 2004). Otro ejemplo de este diseno experimental es el efectuado por un grupo chino que descubrio que el extracto etanolico acuoso de Coriolus versicolor (Yunzhi) indujo una alta produccion de IFN-[gamma] e IL-8 a las 24 hrs. de incubacion de linfocitos de bazo (Ho et al., 2004).

Material y metodos

Raices de Lepidium peruvianum de los ecotipos rojo, blanco, negro y morado fueron obtenidas del valle de Pampas, provincia de Tayacaja, departamento de Huancavelica-Peru. Las raices se cortaron y deshidrataron, se procesaron hasta pulverizarlas. El polvo de maca se macero en metanol QP. (1:2) durante 10 dias. El extracto metanolico (libre del solvente) se llevo a una concentracion de 800 [micron]g/ml empleando medio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) esteril como diluyente y se almaceno a 4 [grados]C hasta su utilizacion. Todo el procedimiento se realizo en el Laboratorio de Inmunologia de la Facultad de Ciencias Biologicas (UNMSM).

Los linfocitos humanos fueron obtenidos a partir de sangre periferica humana de individuos sanos, empleando EDTA como anticoagulante. La sangre se diluyo en buffer fosfato salino (PBS) (1:1), los linfocitos se separaron del resto de celulas sanguineas empleando Ficoll-Hypaque (2 partes de la sangre diluida y 1 de FH). Se procedio a centrifugar por 30 minutos a 1500 rpm. Posteriormente se extrajo el anillo de celulas (linfocitos y monocitos). Las celulas se lavaron tres veces con PBS (10 minutos a 1500 rpm). Se elimino el sobrenadante y se resuspendieron en PBS. Se procedio al recuento en hemocitometro y se resuspendieron en una concentracion de 1x 106 celulas/ml en el medio de cultivo celular RPMI 1640 (Sigma) enriquecido con 10% suero bovino fetal (SBF) decomplementado, 1% estreptomicina, penicilina y 1% de Solucion HEPES. Las celulas se cultivaron a 37[grados]C y 5% C[0.sub.2] distribuyendo pocillos para el EM de cada ecotipo (800 [micron]g/ml).

La prueba de Elispot se desarrollo de la siguiente manera: Primer dia: Se estimulo la placa de Elispot con anti INF-[gamma] humano en dilucion 1:2000 con PBS esteril (Mabtech) de 12 a 14 horas a 4[grados]C.

Segundo dia: Se bloqueo la placa con el primer anticuerpo, lavando 6 veces con PBS y 1% SBF decomplementado, luego se descarto el medio de bloqueado y seco el excedente. Se coloco 30 [micron]l de medio RPMI 1640 enriquecido como en el procedimiento anterior. En distintos pocillos de la placa se coloco 20 [micron]l del extracto metanolico a una concentracion de 800 [micron]g/ml de los 4 ecotipos de L. peruvianum (rojo, negro, blanco y morado) por separado; la prueba se hizo por triplicado. Adicionalmente, para cada ecotipo se utilizo 3 pocillos con controles negativos sin extracto de maca (solo medio RPMI) y 1 pocillo de control positivo con 10 [micron]l de una solucion de 40 [micron]g/ ml de Fitohemaglutinina (PHA). A toda la placa se le anadio 100 [micron]l de celulas y se incubo toda la noche a 37[grados]C y 5% C[0.sub.2].

Tercer dia: Se descartaron las celulas. Se lavo la placa 6 veces con PBS 1X. Posteriormente se coloco el segundo anticuerpo Anti IFN-[gamma] humano biotinilado (Mabtech) (1:2000 en PBS) y se incubo por 60 minutos. Luego se lavo 6 veces con PBS 1X. Se anadio el tercer anticuerpo con estreptavidina (Mabtech) (1:2000 en PBS) y se incubo en oscuridad por 60 minutos. Se anadio la solucion de sustrato BCIP y NBT (Biorad) diluida en Tris 1X pH 9,5 (1:100) se incubo por 15-30 minutos hasta que se observo la aparicion de puntos azules llamados "spots" especialmente en el control positivo. Finalmente, se detuvo la reaccion descartando el sustrato colocando por 15 minutos 100 [micron]l de PBS con 1% Tween 20. Transcurrido este tiempo se lavo 6 veces con agua corriente y se dejo secar. Los "spots" se contaron con ayuda de un estereoscopio o lupa. Los pocillos positivos fueron aquellos que son mayores o iguales al punto de corte.

El punto de corte se encontro con la siguiente formula:

Punto de corte = 3 x Promedio de controles negativos

Resultados

El punto de corte obtenido con la formula anterior fue de 12, por tanto todos los valores mayores o iguales a 12 spots se consideran positivos para la prueba de Elispot. Para el ecotipo rojo se observo un promedio de 2 spots observados por pocillo, lo cual resulto menor que el valor de punto de corte y por tanto negativo. Para el ecotipo negro de maca se hizo una lectura de 1 spot por pocillo, lo cual tambien fue negativo. Para el ecotipo blanco se observo un promedio de 2 spots por pocillo. Para el ecotipo morado de maca se obtuvo una lectura de mas de 100 spots en promedio por pocillo, mayor al punto de corte y por tanto una respuesta fuertemente positiva para la produccion de IFN-[gamma] por los linfocitos expuestos a este extracto. El control positivo PHA dio una lectura mayor de 200 spots por pocillo y los controles negativos de 4 spots en promedio por pocillo. Estos datos tambien fueron expresados en frecuencias de spots por pocillo (Fig. 1) y se observan en las diferencias marcadas entre la ausencia completa de respuestas significativas de los ecotipos negro, blanco y rojo, respecto a la alta respuesta de INF-[gamma]secretado por las celulas expuestas al ecotipo morado de maca (Tabla 1).

[FIGURA 1 OMITIR]

Discusion

Se han realizado estudios que han demostrado los efectos inmunomoduladores de la maca (Alzamora, 2003), los cuales se deben a la presencia y accion de sus metabolitos secundarios: alcaloides, glucosinolatos, glucotropaeolin y mmetoxiglucotropaelino, macaridina, alcamidas e isocianatos (Piacente et al., 2002; Zhao et al., 2005).

El presente trabajo es el primer reporte que muestra que el ecotipo morado de maca estimula la produccion de IFN-[gamma] por linfocitos T humanos, lo cual podria indicar que dicho ecotipo tiene un constituyente quimico distinto a los ecotipos rojo, blanco y negro evaluados, consecuentemente modula la inmunidad celular en forma distinta. Aunque aun no se ha identificado cual de estos constituyentes quimicos es el responsable de la activacion de los linfocitos T en el ecotipo morado, la actividad inmunomoduladora de la maca para el ecotipo amarillo esta relacionada con los alcaloides (Alzamora, 2003).

Todavia queda pendiente descubrir cuales son las cascadas y las moleculas de senalizacion que estan involucradas en este proceso. Con estos resultados podria abrirse toda una gama de aplicaciones terapeuticas en la medicina alternativa. Entre otras aplicaciones, el incremento de IFN-[gamma] por el ecotipo morado podria emplearse en el tratamiento del Alzheimer ya que esta citoquina juega un rol crucial en la produccion de los peptidos [beta]-amiloides (Blasko et al., 1999; Valentova y Ulrichova, 2003).

Se concluye que el ecotipo morado de Lepidium peruvianum, maca, induce la produccion de IFN-[gamma] in vitro y por tanto posee accion activadora sobre linfocitos T humanos, propiedades que no evidencian los otros ecotipos evaluados (blanco, rojo y negro). Asimismo, los extractos de ecotipos blanco, negro, y rojo podrian ejercer acciones inmunosupresoras que requieren ser demostradas.

Agradecimientos

Los autores agradecen el financiamiento otorgado por el Consejo Superior de Investigaciones-UNMSM, Proyecto N*051001061.

Literatura citada

Alzamora, L. 2000-2003. Estudio del efecto antitumoral e inmunomodulador del extracto alcaloidal de raices de Lepidium peruvianum G. Chacon "maca" (Brassicaceae), en ratones. Tesis para optar el Grado Academico de Doctor en Ciencias Biologicas. Unidad de postgrado de la Facultad de Ciencias Biologicas. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. 191 pp.

Blasko I, Marx F, Steiner E, Hartmann T, Grubeck-Loebenstein B. 1999. TNF-[gamma] plus IFN-[gamma] induce the production of Alzheimer a-amyloid peptides and decrease the secretion of APPs. FASEB J 13: 63-68.

Chacon, G. 1997. La Importancia de Lepidium peruvianum Chacon sp nov. maca en la Alimentacion del ser Humano y Animal 2000 anos antes y despues de Cristo y en el siglo XXI. Servicios Graficos Romero. Primera Edicion. Pp. 8, 22, 62-71.

Chan A., E. Yip, L. Yung, H. Pang, S. Luk, S. Pang y Y. Wong 2005. Immuno-regulatory Effects of CKBM on the Activities of Mitogen-Activated Protein Kinases and the Release of Cytokines in THP-1 Monocytic Cells. Biol. Pharm. Bull. 28(9): 1645-1650.

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Larsen M., C. Moser, N. Hoiby, Z. Song y A. Kharazmi. 2004. Ginseng modulates the immune response by induction of interleukin-12 production. APMIS. 112(6):369-73.

Piacente S, V. Carbone, A. Plaza, A. Zampelli y C. Pizza. 2002. Investigation of the tuber constituents of maca (Lepidium meyenii Walp.). J Agric Food Chem. 50(20):5621-5.

Queiroz M., M. Quadros y L. Santos. 2000. Cytokine profile and natural killer cell activity in Listeria monocytogenes infected mice treated orally with Petiveria alliacea extract. Immunopharmacol Immunotoxicol. 22(3): 501-18.

Stites D. y A. Terr. 1994. Inmunologia Humana y Basica. 1ra Edicion. Manual Moderno. Pp. 145-149

Valentova K. y J. Ulrichova. 2003. Smallanthus sonchifolius and Lepidium meyenii - prospective Andean crops for the prevention of chronic diseases. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 147(2):119-30.

Zhao J, I. Muhammad, D.C. Dunbar, J. Mustafa y I.A. Khan. 2005. New alkamides from maca (Lepidium meyenii). J Agric Food Chem. 53(3): 690-3.

Zuniga, R., A. Lucchetti, P. Galvan, S. Sanchez, J. Peinado, N. Frahm, C. Linde, H. Hewitt, W. H. Hildebrand, D. Montefiori, T. Allen, M. Altfeld, B. D. Walker, J. Sanchez, C. Brander. 2006. Relative Dominance of Gag p24 - Specific Cytotoxic T Lymphocytes is Associated with Human Inmunodeficiency Virus Control. Journal of Virology 80 (6): 3122-3125.

Libertad Alzamora (1), Patricia Galvan (1), Evelyn Alvarez (1), Dina Torres (1), Erasmo Colona (1), Madeley Aliaga (1) y Alvaro Marcelo (2)

(1) Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Facultad de Ciencias Biologicas, Instituto de Investigaciones de Ciencias Biologicas Antonio Raimondi, Laboratorio de Inmunologia.

Email Libertad Alzamora: lalzamorag@unmsm.edu.pe

(2) Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Facultad de Medicina, Centro de Investigacion de Bioquimica y Nutricion.

Nota del Editor: El nombre Lepidium peruvianum Chacon debe ser considerado sinonimo de Lepidium meyenii Walp. (ver Germplasm Resources Information Network , United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, en http://www.ars-grin.gov/cgi-bin/npgs/html/taxon.pl?21767, acceso 08/02/07) preferencias del autor obligan a mantener L. peruvianum Chacon en el texto.
Tabla 1. Se muestran los resultados en promedio de spots
obtenidos en la prueba de Elispot, realizada para diferentes
ecotipos de Lepidium peruvianum, Chacon; donde se evaluo
el efecto de 4 extractos metanolicos de los ecotipos rojo,
negro, blanco y morado de maca sobre la activacion de
linfocitos humanos, se emplearon 1x106 celulas por pocillo,
los cultivos se incubaron 14 horas a 37 [grados]C y 5% C[O.sub.2]. El
control positivo fue fitohemaglutinina y el control negativo
medio RPMI 1640. El numero de spots obtenidos para el
ecotipo morado indica que activo el cultivo de linfocitos lo
cual es evidenciable por la secrecion de IFN[gamma]. Medio RPMI
1640: Roswell Park Memorial Institute

                       Promedio
Ecotipos             Spots/pocillo
(800 [micron]g/ml)       n = 3

Rojo                       2
Negro                      1
Blanco                     2
Morado                   > 100
Controles
Fitohemaglutinina        > 200
(40 [micron]g/ml)
Negativo (RPMI)            4
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Author:Alzamora, Libertad; Galvan, Patricia; Alvarez, Evelyn; Torres, Dina; Colona, Erasmo; Aliaga, Madeley
Publication:Revista peruana de biologia
Date:Jul 1, 2007
Words:2743
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