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Produccion de [beta]-glucosidasas por cultivos de bacterias termofilas indigenas del altiplano boliviano.

[beta]-glucoside production by thermophilic bacteria indigenous the bolivian altiplano culture Introduccion

Las [beta]-glucosidasas ([beta]-D-glucosido glucohidrolasa, EC 3.2.1.21) son enzimas hidroliticas que actuan sobre los enlaces glucosidicos [beta] (1-4) de oligosacaridos, originando como producto final monomeros de glucosa. La afinidad de esta enzima disminuye al aumentar el grado de polimerizacion de los oligosacaridos, siendo inactivos sobre los polimeros. Las [beta]-glucosidasas tambien disponen de actividad transferasa o transglucosidasas por lo que pueden generar productos de mayor tamano que los oligosacaridos iniciales, lo cual determina su utilizacion en la biosintesis de los mismos. Tambien participan en la hidrolisis de compuestos glicosilados por lo que se utiliza en las industrias de zumos de frutas y derivados, siendo la mas importante la industria vinera (hidrolisis de terpenoles glicosilados) potenciando el aroma (Palmeri et al., 2007). Otra aplicacion es la produccion de etanol a partir de residuos agricolas (Sue et al., 2006). Las grandes posibilidades de aplicacion de esta enzima promueven la investigacion, el mejoramiento en la produccion de las mismas y la contribucion a la disminucion de la contaminacion.

Esta enzima generalmente es sintetizada por variedades de bacterias aerobias como Phanerochaete chrysosporium (Li et al., 1998), Streptomyces sp. y hongos como Aspergillus oryzae (Riou et al., 1998), Achatina aulica, Periconia sp., Botryodiplodia theobromae. En los ultimos anos se realizaron esfuerzos por buscar nuevas alternativas de fuentes de esta enzima que tengan estabilidad extrema y es asi que se han descrito bacterias cuyo metabolismo es anaerobio termofilo como: Clostridium thermocellum (Grabnitz et al., 1989), Thermoanaerobacter brockii (Breves et al., 1997), Thermophilic ethanologenesis (Taylor et al., 2009).

La inmovilizacion bacteriana en perlas de alginato de calcio ha sido un metodo bastante desarrollado o utilizado con la finalidad de favorecer la produccion de ciertas enzimas tales como [beta]-galactosidasa (Bressel et al., 2008), glucosa oxidasa, catalasa (Blandino et al., 2003) y otros metabolitos como el acido lactico (Yoo et al., 1996). Por tanto, la inmovilizacion de bacterias podria significar un incremento en la produccion de enzimas.

Es por ello que esta investigacion se centro en incrementar la produccion enzimatica extracelular de las [beta]-glucosidasas de bacterias anaerobias termofilas. El incremento de la produccion esta basado en la optimizacion de las condiciones fisicas y quimicas del cultivo, en sistemas inmovilizados y libres, para su posterior caracterizacion de la localizacion celular y estabilidad fisico-quimica.

Materiales y metodos

Microorganismos y condiciones de cultivo

Se utilizaron tres cultivos de bacterias termofilas anaerobias procedentes de lodo de aguas termales de la region altiplanica de Bolivia (tabla 1) obtenidos mediante tecnicas de Roller-tubes (aislado 2B del consorcio 2B), de cultivo bifasico (aislado FT3 del consorcio FT3), y por encapsulacion en alginato de calcio (aislado P5 del consorcio FT3) (Rios et al., 2007).

Los aislados bacterianos FT3, 2B, P5 fueron cultivados en el medio base mineral 11 que tiene la siguiente composicion por litro: 10 mL de solucion A (N[H.sub.4]Cl 200 g/L, NaCl 10 g/L, Mg[Cl.sub.2]*6[H.sub.2]O 10 g/L, Ca[Cl.sub.2]*2[H.sub.2]O 5 g/L); 2ml de solucion B ([K.sub.2]HP[O.sub.4]*3[H.sub.2]O 200 g/L); 1 mL de solucion C (Fe[Cl.sub.2]*4[H.sub.2]O 1,5 g/L, HCl 25% 6,5 mL, [H.sub.3]B[O.sub.3] 60 mg/L, Ca[Cl.sub.2]*6[H.sub.2]O 120 mg/L, Mn[Cl.sub.2]*4[H.sub.2]O 100 mg/L, [Na.sub.2]Mo[O.sub.4]*2[H.sub.2]O 25 mg/L, Ni[Cl.sub.2]*6[H.sub.2]O 25 mg/L, Zn[Cl.sub.2] 70 mg/L, Cu[Cl.sub.2]*2[H.sub.2]O 15 mg/L); 1 mL de solucion D ([Na.sub.2]Se[O.sub.3] 3 mg/L, NaOH 0,5 g/L); 30 mL de solucion E (NaHC[O.sub.3] 8.,5 g/100 mL); 0,1 mL de solucion F (Biotina 1 mg/L, PABA 5 mg/L, Vit. [B.sub.12] 5 mg/L, Tiamina 10 mg/L); 0,2 mL de solucion reductora G ([Na.sub.2]S*9[H.sub.2]O 2%), y como fuente de carbono xilano 0,2% p/v (salvo otra fuente de carbono utilizada). El pH del medio fue 7,2 [+ o -] 0,2 (salvo otra modificacion hecha en el trabajo).

Se establecio un sistema de anaerobiosis en los medios de cultivos a traves de la gasificacion con nitrogeno de los viales que contenian el medio de cultivo segun la tecnica de Hungate para cultivo de anaerobios (Miller y Wolin, 1974). Los cultivos fueron incubados a una temperatura de 60[grados]C por 7 dias. A diferentes tiempos del cultivo se tomaron muestras con el fin de evaluar la evolucion de la actividad enzimatica y el crecimiento bacteriano. En este ultimo caso, la cuantificacion se realizo por medicion de la densidad optica a 560 nm en un espectrofotometro.

Inmovilizacion en perlas de alginato

La inmovilizacion en polimeros de alginato de calcio se realizo de acuerdo con la metodologia propuesta por Casablanca et al. (2009).

Las bacterias inmovilizadas en polimeros de alginato fueron trasvasadas a un medio de cultivo en condiciones anaerobias dentro de una camara de anaerobiosis. Todo material y reactivo utilizado para este fin fue esterilizado por vapor a presion, excepto el alginato de sodio que fue irradiado con luz ultravioleta por 30 min.

Optimizacion del medio de cultivo

Para la optimizacion del medio de cultivo se realizaron variaciones de las fuentes de nitrogeno, carbono y pH.

Optimizacion de la fuente de nitrogeno. Se realizo un diseno factorial 4x2, con cuatro fuentes de nitrogeno (NaN[O.sub.3], extracto de levadura, N[H.sub.4]Cl y urea) y dos sistemas de cultivos: celulas libres e inmovilizadas. La concentracion de la fuente de nitrogeno se baso en el medio mineral 11, se realizo una variacion del compuesto nitrogenado de la solucion A, la cual fue utilizada como referencia de concentracion para el calculo de la cantidad de nitrogeno de los demas compuestos, de acuerdo con lo descrito por Casablanca et al. (2009).

Influencia del pH. Se realizo bajo el siguiente diseno factorial 6x2, con seis pH 10, 9, 8, 7, 6, 5 y dos sistemas de cultivos, celulas libres e inmovilizadas.

Optimizacion de la fuente carbono. Se realizo un diseno factorial de 5x2, con cinco fuentes de carbono y dos sistemas de cultivos, celulas libres e inmovilizadas. Las fuentes de carbono fueron xilano e hidrolizados de paja de quinoa, cascarilla de arroz, paja de trigo y paja de soja. Las materias crudas fueron pretratadas por metodos quimicos (hidrolisis alcalina, hidrolisis acida y por pretratamiento con amonio) y uno fisico (hidrolisis termica) de acuerdo con lo descrito por Casablanca et al. (2009). En todos los casos, la concentracion de los hidrolizados para utilizar en el medio de cultivo se estimo a partir de la valoracion de la demanda quimica de oxigeno (DQO), tomandose como valor de referencia el valor de DQO obtenido para el xilano 2% p/v, fuente de carbono del medio mineral 11 (Casablanca et al., 2009).

Actividad [beta]-glucosidasa

Cuantificacion de la actividad

La cuantificacion de la actividad [beta]-glucosidasa se realizo por determinacion de la cantidad de p-nitrofenol (pNP) liberado desde el p-nitrofenol-glucosido (pNPG) usado como sustrato. La reaccion se llevo a cabo adicionando 40 [micron]L de la fuente enzimatica (sobrenadante del cultivo, suspension de bacterias sonicadas) en 0,46 mL de pNP-glucosido (2,8 mM) y 0,5 mL de buffer citrato (50 mM, pH 5), para un volumen final de 1 mL. La mezcla se incubo a 80[grados]C durante 30 min. Una vez finalizado el tiempo y enfriada a temperatura ambiente se realizo la lectura. El pNP liberado fue medido espectrofotometricamente a 405 nm. El coeficiente de extincion molar utilizado para el pNP fue de 0,0002 [micron]M [cm.sup.-1]. La unidad de actividad enzimatica [U] se definio como la cantidad de enzima capaz de liberar 1 [micron]mol de pNP por minuto bajo las condiciones ensayadas. Todas las mediciones fueron realizadas por triplicado.

Localizacion celular

La localizacion celular de la enzima se realizo por medicion de actividades tanto intra como extracelulares de la enzima. La cuantificacion de la actividad intracelular de la enzima se baso en la lisis de la bacteria mediante un metodo fisico (sonicacion). La amplitud de sonicacion empleada fue de 20% durante 5 min.

Se cultivo el aislado bacteriano FT3 en medio mineral 11, en un cultivo batch con fuente de nitrogeno y fuente de carbono que fueron seleccionadas de la optimizacion del medio de cultivo, del cual se realizo una cinetica enzimatica tanto intracelular como extracelular total de la enzima. A diferentes tiempos del cultivo se tomaron 2 mL de muestras con el fin de realizar un seguimiento de la actividad enzimatica, las cuales fueron repartidas a 1 mL en distintos tubos. La primera muestra se centrifugo a 10.000 rpm teniendo dos fases de la cual se tomo el sobrenadante (enzimas extracelulares); la segunda muestra fue el pelet del centrifugado resuspendido en solucion fisiologica en la misma cantidad que el sobrenadante para luego sonicarlo a 5 min y 20% de amplitud, siendo esa muestra centrifugada a las mismas revoluciones (liberacion de la enzima) rescatando el sobrenadante (enzimas intracelulares) y, por ultimo, la tercera muestra se sonico en las mismas condiciones para luego centrifugarla y obtener el sobrenadante (enzimas totales). En todos los casos, se realizo la medicion de la actividad [beta]-Glucosidasa.

Caracterizacion de la estabilidad de la enzima

La caracterizacion de la estabilidad de la enzima a temperatura y pH del medio de reaccion se realizo en los extractos enzimaticos obtenidos del aislado bacteriano FT3 por metodos ya descritos anteriormente.

La influencia de la temperatura en la actividad enzimatica se determino en un rango de 30[grados]C a 90[grados]C por medicion del producto de la reaccion. El efecto de la temperatura sobre la actividad enzimatica se estudio incubando 40 [micron]L extracto enzimatico con 460 [micron]L de sustrato pNPG (2.8 mM) y 500 [micron]L buffer citrato (50 mM, pH 5); la mezcla homogenea se incubo a distintas temperaturas 30, 40, 50, 60, 70, 80 y 90[grados]C por un espacio de 30 min.

El efecto del pH en la actividad enzimatica se estudio a 80[grados]C, realizando variaciones del pH del medio de reaccion desde 3 hasta 10 consecutivamente; la influencia del pH en la estabilidad de la enzima fue estudiada por la exposicion del extracto enzimatico a distintos valores de pH como son: 3 (buffer citrato de sodio 0,05 M), 4, 5 (buffer acetato de sodio 0,05 M), 6, 7, 8 (buffer fosfato de sodio 0,05 M), 9 (buffer cloruro de amonio 0,05 M) y 10 (buffer carbonato de sodio 0,05 M) todos en una cantidad de 500 [micron]L con 460 [micron]L de sustrato pNPG (2,8 mM) y 40 [micron]L de extracto enzimatico, para un volumen final de 1 mL. Todas las mezclas homogeneas fueron sometidas a 80[grados]C durante 30 min; una vez finalizado el tiempo y enfriada a temperatura ambiente se realizo la lectura.

Resultados

Los aislados bacterianos FT3, 2B y P5 procedentes de muestras de lodos de aguas termales del altiplano Boliviano fueron sometidos a una seleccion con base en dos criterios: el crecimiento en medio solido y la capacidad hidrolitica o actividad [beta]-glucosidasa. La cepa FT3 mostro capacidad de crecer en medio solido (formacion de colonias) y una actividad hidrolitica de aproximadamente 0,35 [+ o -] 0,03 [UI/mL], siendo esta actividad superior a los aislados bacterianos 2B y P5 que mostraron actividades de 0,23 [+ o -] 0,08 y 0,29 [+ o -] 0,05 [UI/ mL] respectivamente.

El aislado FT3, fue inmovilizado y cultivado en medio mineral 11 con xilano como fuente de carbono y realizando la variacion de la fuente de nitrogeno (N[H.sub.4]Cl) por compuestos de distinta naturaleza como son: extracto de levadura, urea y nitrato de sodio; las actividades [beta]-glucosidasas presentadas son 0,52[+ o -]0,07; 0,40[+ o -]0,04; 0,29[+ o -]0,1 [UI/mL] respectivamente (figura 1), mostrando una actividad superior con el extracto de levadura por lo que es seleccionado para los siguientes experimentos.

[FIGURA 1 OMITIR]

Asi tambien se evidencio la biomasa del aislado FT3 en las perlas de alginato de calcio, por el cambio de coloracion de las perlas que pasaron de incoloras a blanquecinas (figura 2). Dentro de un determinado tiempo las perlas de alginato que contenian a las bacterias llegaron a sobresaturarse y tendieron a salirse; la cantidad de bacterias en las perlas se evidencio por el tamano del color de la misma, asi tambien la sobresaturacion, siendo las perlas aproximadamente de un solo tamano.

Las [beta]-glucosidasas en sistemas de cultivos libres no presentaron actividades superiores a los cultivos de bacterias inmovilizadas (tabla 2), pero los resultados tambien indican que el extracto de levadura en ambos casos indujo a la produccion de [beta]-glucosidasas.

El crecimiento bacteriano de celulas inmovilizadas depende de la estabilidad de las perlas en el medio de cultivo, por lo que se realizo una optimizacion de la influencia del pH en la produccion enzimatica y estabilidad de la perla. A pH alcalino las perlas de alginato no fueron estables llegando a desintegrarse en el lapso de 2 dias, siendo las actividades enzimaticas de 0,58 [+ o -]0,1; 0,50[+ o -]0,12 y 0,40[+ o -]0,08 [UI/mL] a pH de 10, 9 y 8 respectivamente (figura 3).

[FIGURA 2 OMITIR]

Las bacterias inmovilizadas en perlas fueron consistentes y estables cuando se trabajo a pH acidos. Las actividades enzimaticas del aislado FT3 fueron de 0,46 [+ o -] 0,1 y 0,81 [+ o -] 0,05 [UI/mL] a pH 6 y 5 respectivamente. Teniendo una optima actividad a pH 5. En los sistemas de cultivos de celulas libres las actividades enzimaticas se vieron afectadas presumiblemente porque existe un contacto directo del medio de cultivo con las bacterias, siendo las enzimas inestables a pH extremos.

El aislado FT3 mostro una actividad hidrolitica sobre los residuos agricolas (hidrolizados) utilizados como fuente de carbono. Presentando una actividad aproximada de 1,34 [+ o -] 0,03 [UI/mL] con hidrolizado de paja de quinoa y 1,27 [+ o -] 0,07 [UI/mL] con hidrolizados de paja de trigo (Bernadette et al., 2003); estas actividades fueron superiores en comparacion con las otras fuentes carbonadas del hidrolizado de cascarilla de arroz con una actividad de 0,63 [+ o -] 0,09 [UI/mL] y 0,40 [+ o -] 0,1[UI/mL] con hidrolizado de paja de soja (figura 4). Siendo estas actividades la suma de la optimizacion de la fuente de nitrogeno y carbono.

[FIGURA 3 OMITIR]

[FIGURA 4 OMITIR]

En cuanto a la localizacion celular de la enzima se obtuvo que es extracelular (figura 5) mostrando una actividad superior con respecto a la actividad [beta]-glucosidasa intracelular.

La actividad optima para la liberacion de la glucosa del pNPG es a 80[grados]C (Ying et al., 2007), disminuyendo la actividad a temperaturas mas elevadas (figura 6). Se obtuvo una mayor actividad a pH 7. Se han reportado datos similares (Parry et al., 2001).

[FIGURA 5 OMITIR]

[FIGURA 6 OMITIR]

Discusion

Nuestros resultados muestran que el aislado bacteriano termofilo FT3 es productor de la enzima [beta]-glucosidasa con una actividad de 0,35 [UI/mL], una actividad muy similar a la reportada por Piromyces sp (Bernadette et al., 2003).

La inmovilizacion realizada incrementa la produccion extracelular de las [beta]-glucosidasas siendo estas excretadas al medio de cultivo. Distintos estudios indican que la inmovilizacion es una barrera de proteccion que evita el contacto directo con el medio de cultivo, siendo una forma para que las bacterias produzcan enzimas extracelulares (Ivanova et al., 2000), la porosidad de la perla tambien es un factor predisponente (Ingar et al., 2005).

Cuando se sometio al aislado bacteriano FT3 a un cambio de fuente de nitrogeno utilizando extracto de levadura, el nivel de actividad enzimatica se incremento a un 50% de la actividad inicial.

Aunque cultivos en batch en extracto de levadura mostraron un incremento notable del nivel de actividad [beta]-glucosidasa, el cambio de fuente de carbono dio un incremento de hasta tres veces.

Para experimentos posteriores sera necesario definir con mayor precision las condiciones optimas de la inmovilizacion, hablando tanto de la porosidad como del tamano de cada perla para la produccion de enzimas extracelulares.

Agradecimientos

El presente trabajo se realizo gracias al apoyo economico de ASDI/Sarec--Suecia, en el desarrollo del Proyecto Biodiversidad Microbiana del lago Poopo y rio Desaguadero.

Recibido: marzo 25 de 2010 Aprobado: mayo 25 de 2011

Referencias bibliograficas

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Esther Casablanca Alarcon *, Neida Rios Manriquez *, Enrique Terrazas Siles *, Ma. Teresa Alvarez Aliaga *

* Area de Biotecnologia, Instituto de Investigaciones Farmaco-Bioquimicas, Facultad de Ciencias Farmaceuticas y Bioquimicas, Universidad Mayor de San Andres, La Paz, Bolivia. materesa_alvarez@yahoo.com
Tabla 1. Origen de las cepas bacterianas

Cepa   Origen      Localizacion
                   geografica

FT3    Chaqui      S 19[grados]37.46,0"
       Potosi      W 65[grados]34,302"

2B     Aguas       S 17[grados]53.483"
       termales    W 67[grados]02,668"
       Capachos

P5     Chaqui      S 19[grados]37.46,0"
       Potosi      W 65[grados]34,302"

Tabla 2. Comparacion entre sistemas de cultivos

           Cel. Inmovilizadas

           Actv.          Desv.
                          Estandar

NH4Cl      0,35 [UI/mL]   0,02
Ext. Lev   0,52 [UI/mL]   0,07
NaNO3      0,29 [UI/mL]   0,1
Urea       0,4 [UI/mL]    0,04

           Cel. Libres

           Actv.          Desv.
                          Estandar

NH4Cl      0,34 [UI/mL]   0,01
Ext. Lev   0,38 [UI/mL]   0,02
NaNO3      0,30 [UI/mL]   0,08
Urea       0,32 [UI/mL]   0,01
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Title Annotation:ARTICULO DE INVESTIGACION
Author:Casablanca Alarcon, Esther; Rios Manriquez, Neida; Terrazas Siles, Enrique; Alvarez Aliaga, Ma. Tere
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Jul 1, 2011
Words:3784
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