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Primera incursion en la obtencion de curieles libre de patogenos especificos en Cuba.

First foray into the production of specific pathogen-free guinea pigs in Cuba

Introduccion

El primer animal mantenido en condiciones Libres de Germenes (GF) fue el curiel, obtenido por Nuttall y Thierfelder (1895, 1896 y 1897) empleando el metodo de histerectomia aseptica. Los animales sobrevivieron durante 13 dias aproximadamente en una campana de cristal preparada para tales efectos (Wagner y Foster 1976).

Esta especie al nacimiento presenta un buen desarrollo corporal, sus ojos y el canal auditivo estan abiertos, el cuerpo cubierto de pelos, a las pocas horas corretea por las jaulas y es capaz de ingerir los alimentos que se les suministran a sus padres. Puede alimentarse con dietas semisolidas y solidas, no necesitando de formulas de leche artificial, estas caracteristicas hicieron posible que el curiel llegara al reino de la Gnotobiologia como la primera especie (Wagner y Foster 1976).

El uso de animales convencionales muchas veces causan costosas perdidas economicas y consumen tiempo en la repeticion de los experimentos al portar organismos patogenos potenciales, los cuales causan manifestaciones clinicas de enfermedad cuando son sujetos a procedimientos de investigacion (Festing 2010).

El interes de producir animales libre de patogenos especfficos (SPF) en la decada de 1980 se hizo una necesidad aparejada al desarrollo cientifico tecnico de las investigaciones biomedicas que ya daba sus primeros pasos en la produccion de vacunas y productos biotecnologicos, aportando resultados confiables y reproducibles al pais. Entonces se funda el Centro Nacional para la Produccion de Animales de Laboratorio (CENPALAB), encargado de investigar, producir y comercializar todo lo referente a esta ciencia. Como tal participa en el desarrollo de la biotecnologia en los subprogramas de bioplaguicidas, en el impulso y aplicacion de los anticuerpos monoclonales de uso humano (Martinez 2008).

En 1984 se iniciaron las primeras investigaciones en condiciones gnotobioticas. Las primeras especies en las que se incursiono en orden cronologico fueron: curieles, ratones, ratas, conejos y aves mantenidas en aisladores flexibles y rigidos, ademas en macroaisladores con escafandra que fueron de produccion nacional (Molinete et al., 1988; Francis et al., 2001; Forte et al., 2001).

El presente trabajo tiene como objetivo describir las tecnicas gnotobioticas empleadas por primera vez en Cuba para la obtencion de curieles libre de patogenos especificos a traves de cesarea aseptica, mantenidos en aisladores y alimentados con dieta artificial esteril.

Materiales y metodos

Procedencia, etica y bienestar animal

Los curieles de la linea Dunkin Hartley no consanguinea utilizados en esta investigacion procedieron del CENPALAB. Los animales se alojaron y alimentaron en las instalaciones de ensayo pertenecientes a la Direccion de Animales Gnotobioticos segun lo establecido en la Guia de Buenas Practicas para el Cuidado, Uso y Reproduccion de los Animales de Laboratorio y los Procedimientos Operacionales de Trabajo. A su vez el protocolo de investigacion fue inspeccionado y aprobado por el Comite Institucional de Cuidado y Uso de los Animales de Experimentacion de dicha institucion teniendo en consideracion la proteccion del bienestar animal, el control del estres, el dolor y el punto final humanitario.

Tecnica de histerectomia y mantenimiento de los neonatos obtenidos por cesarea

Veintiseis madres prenadas fueron histerectomizadas al determinar por palpacion la separacion aproximada de 16 mm o mas de los huesos del pubis necesaria para la expulsion (Phillips et al., 1959).

A las parturientas se les infiltro clorhidrato de lidocaina al 0,7 % desde la base del esternon hasta el borde anterior del pubis y a ambos lados de la linea media, donde se realizo una incision amplia para exteriorizar el utero, ligando este por delante del cuello uterino y por los extremos de los dos cuernos y una vez extirpado el utero, fue sumergido en una solucion al 2 % de yodo activo por 10 segundos y se paso al interior del aislador a traves de la trampa germicida que contenia Cloramina T al 4 % a una temperatura de 37[grados]C. Los neonatos fueron liberados de las membranas fetales procediendose a cortar el cordon umbilical dejando un remanente de un centimetro aproximadamente. Los animales secados y reanimados se colocaron en cajas frente a lamparas infrarrojas a una temperatura que oscilaba entre 25 y 27[grados]C dentro del aislador, evitando la humedad de sus lechos. Desde que se ligaron los extremos del organo gravido hasta que los animales se reanimaron, el tiempo no excedio de los 2,5 minutos (Phillips et al., 1959; Landy et al., 1960). Las hembras histerectomizadas no sobrevivieron, la eutanasia fue practicada inmediatamente despues de extraido el utero gravido administrandole C[O.sub.2] a una concentracion 70 % por via inhalatoria.

Alojamiento, limpieza y esterilizacion de los aisladores

Los aisladores utilizados fueron fabricados por la Calhene (Francia), modelo LCI-RI-3, con folia flexible compuesta por cloruro de polivinilo (PVC) de tamano estandar (volumen interior de 0.73 [m.sup.3]) de presion positiva y esterilizados por acido peracetico al 2 % conteniendo 0,1 % de detergente con alkyl aryl sulfonato como principio activo.

Los aisladores contaban con filtros de alta eficiencia, mangas con guantes de neopreno y dos sistemas de transferencia rapida con doble puerta para ser utilizados como aislador de transporte y/o transferencia. El aislador de cria presentaba un sistema de transferencia de doble puerta y otra puerta cerrada con una capota de PVC (figura 1).

Dietas, regimen de alimentacion y esterilizacion de las dietas

La dieta aplicada responde a una formula modificada (tabla 1) a partir de la L-477 en forma de papilla y por la C-484 solida granulada (tablas 2 y 3) (Phillips et al., 1959; Dieters et al., 1976). La suplementacion de Vitamina C y B1 asi como el regimen de alimentacion fueron transferidos de las experiencias de otros trabajos (tabla 4) y la cantidad de agua por 100 gramos de dieta seca vario acorde a la edad del animal (Phillips et al., 1959; Dieters et al., 1976).

El alimento (L-477 modificada) semisolido en forma de papilla se le ofrecio a los animales a partir de las dos horas de nacidos, dos veces al dia, a razon de 10 g/ animal/dia, fortificado con suplemento vitaminico en placas petri. En el momento de elaborar la papilla se adiciono 1 ml de suplemento vitaminico/animal. Al tercer dia se fue eliminando el contenido de agua de la papilla y al septimo dia se les coloco en la jaula una pequena cantidad de dieta solida granulada (C-484). A partir de los 10 dias, la dieta semisolida se limito a una vez por dia, reduciendose gradualmente a expensas de un aumento en el consumo de la dieta granulada, y a los 21 dias solo consumieron alimento solido, agua a voluntad y el suplemento vitaminico a razon de 1 ml/ animal/dia. En ocasiones fue necesario ensenar a los animales a consumir la papilla de forma tal que reconocieran el alimento ofrecido.

Se prepararon tres formulaciones de suplemento vitaminico de acuerdo a las variaciones en los requerimientos de la especie durante los primeros 21 dias de vida (tabla 4).

[FIGURA 1 OMITIR]

La dieta comenzo a esterilizarse por autoclave (Sakura, Japon) utilizando vacio a una temperatura de 121[grados]C/20 minutos, solamente los primeros 80 dias del experimento. La suplementacion con forraje o heno se experimento con la primera generacion a los 6 meses de edad, esta se sometio a vapor humedo a igual temperatura pero por 30 minutos. La segunda generacion lo recibio desde el nacimiento.

Las bolsas de alimento (C-484) se empacaron hermeticamente con tres sacos de polietileno y se irradiaron con [sup.60]Co a una dosis de 1,5Mrad. El agua fue esterilizada por vapor humedo a 121[grados]C/1h. La gasa, el encamado, las cajas de policarbonato con piso de rejilla, el equipamiento quirurgico y los utensilios de cristal se pasaron a traves de un cilindro metalico al aislador, despues de ser sometidos a una temperatura de 121 [grados]C/30 minutos en la autoclave.

Implantacion de la microbiota gastrointestinal

La microbiota gastrointestinal se le administro por via oral a los neonatos obtenidos por cesarea aseptica directamente en el estomago, usando una canula rigida a las 24 y 48 horas del nacimiento. El ampula contenia 0,5ml de una dilucion en agua destilada de 10-6/g de contenido de la porcion final del ileon, ciego y principio del colon de curieles Dunkin-Hartley convencionalizados, monitoreados contra patogenos especificos.

Control microbiologico, necropsia y procesamiento histologico

Se monitoreo la esterilidad de los aisladores, el alimento, el agua, la placenta de cada animal reanimado, muestras de heces fecales frescas y los fomites. Se utilizo caldo Tioglicolato, caldo Triptona Soya y caldo Saboraud incubandose aerobicamente a temperatura de 55, 37 y 25[grados]C respectivamente. La necropsia de los animales recientemente muertos o moribundos se realizo en condiciones asepticas y se controlaron microbiologicamente sus heces, fragmentos de intestino, traquea, pulmones y algun otro organo con lesiones. Los segmentos del tracto gastrointestinal y los pulmones fueron fijados en formol neutro al 10 % y despues embebidos en parafina, cortados a 4p y tenidos por hematoxilina y eosina. Los ciegos fueron pesados llenos empleando una balanza (Sartorius, Japon).

Los animales fueron muestreados para patogenos especificos como, Salmonella sp., Pasteurellas sp., Streptococcus del grupo A y C, Bordetella bronchiseptica, Toxoplasma gondii, Virus Sendai, y parasitos internos y externos de acuerdo a lo planteado por Riera (2008) con el proposito de establecer las categorias microbiologicas de salud en los animales de laboratorio clasificadas en Libres de Germenes Patogenos Especificos (SPF) y convencionales.

Resultados

Se realizaron 26 histerectomias, cinco de ellas fueron extraidas del aislador por contener en el utero mas de tres crias que no respiraron espontaneamente, obteniendose 51 neonatos. La mortalidad mas alta se registro entre los primeros 10 dias de edad (58,8 %). Se lograron 12 animales adultos: nueve hembras y tres machos; de las hembras solo seis se reprodujeron aproximadamente a los nueve meses de edad.

De los 30 animales muertos durante los 10 primeros dias de vida, el 83,3 % de ellos oscilaban entre los 45 y 65 g de peso al nacimiento, 6 animales murieron en las primeras 24 horas de vida con los pesos mas bajos y el resto entre los 2 y 10 dias de edad. Estos animales se mostraron anorexicos, somnolientos, con pelo hirsuto y sucio, mientras se mantenian lo mas cerca posible de la fuente de calor, desarrollaron un proceso disneico progresivo y muerte dentro de las 24 horas siguientes. Se detectaron trastornos nerviosos (convulsiones, torticolis, movimientos desordenados de la cabeza y vueltas en circulo) a los cuales no sobrevivieron.

Los animales obtenidos por cesarea manifestaron en alguna oportunidad, enteritis leve con cambios poco sustanciales en la textura de sus heces, enteritis severas con deshidratacion, perdidas de peso, hasta diarreas con estrias sanguinolentas. Las necropsias mostraron neumonias causadas por bronco aspiracion y neumonias donde se aislo Staphylococcus aureus no hemolitico, asi como enteritis, colitis y tiflitis con aparicion de francos procesos diarreicos sin aislamiento.

A medida que se introducia la dieta solida, C-484, se detectaron distensiones cecales que conllevaron a la aparicion de prolapsos rectales, asi como cuatro obstrucciones intestinales y una de ellas concomitan do con queratoconjuntivitis. Esta patologia ocular no pudo ser enmarcada en ningun periodo especifico y fueron diagnosticados ocho casos. Al analizar las secreciones oculares se aislaron Pseudomonas sp. y Staphylococcus aureus no hemolitico.

En algunos curieles jovenes adultos se observo deformaciones de las extremidades posteriores o anteriores, torticolis, pelaje no uniforme, bajo peso corporal, trastornos gastrointestinales con heces blandas hasta francas diarreas con prolapso rectal. De estos, los que no murieron, fueron apareados. Los que murieron, padecieron deshidratacion y perdida de peso extrema a consecuencia de una disminucion del consumo de alimento y una ingestion exagerada de agua que conllevo a la distension cecal con paredes muy finas, que mostraron acortamiento de las vellosidades, degeneracion del epitelio de absorcion e infiltrado inflamatorio escaso a predominio de neutrofilos, junto a un contenido muy liquido de coloracion normal. Cuando comenzamos a irradiar las dietas el aspecto fisico de los animales fue mejorando sustancialmente y el periodo de vida se fue alargando. Ademas se redujo el tamano cecal en machos de 45 % a 13 % y en hembras de 31 % a 15 % con relacion al peso corporal.

Tres animales sufrieron fracturas completas de los huesos de una o dos de sus extremidades al accidentarse con el piso de rejilla de la caja.

Con los 12 animales obtenidos por cesarea aseptica se conformaron dentro del aislador de cria dos grupos de cuatro hembras por un macho, seis se gestaron, dos abortaron y otra murio a causa de parto distocico. De la primera gestacion nacieron cinco crias, todas hembras. Las hembras que abortaron lograron seis crias en el segundo parto, tres hembras y tres machos. Es decir, nacieron por parto natural en condiciones controladas un total de 11 animales, ocho hembras y tres machos.

Los 11 animales nacidos por parto natural y lactados por sus madres tuvieron un comportamiento muy superior a los animales obtenidos por histerectomia. La ganancia en peso y la talla alcanzada fue superada, el pelaje fue uniforme, limpio, brilloso y no practicaron la tricofagia. No se observaron deformidades de las extremidades, procesos disneicos, digestivos ni nerviosos.

En los controles microbiologicos se aislaron intermitentemente Staphylococcus aureus no hemolitico, Bacilos esporulantes y Pseudomonas sp. y no se reportaron hongos ni parasitos.

Se lograron curieles obtenidos por cesarea aseptica, mantenidos en aisladores con dietas esteriles, capaces de reproducirse por primera vez en el pais, libres de patogenos especificos: Salmonella sp., Pasteurellas sp., Streptococcus del grupo A y C, Bordetella bronchiseptica, Toxoplasma gondii, Virus Sendai, y parasitos internos y externos.

Discusion

Indudablemente el periodo mas peligroso de la vida es el neonatal. En ninguna otra ocasion se enfrentara el individuo a desafios mas impresionantes que la transicion de la existencia intrauterina dependiente, a la vida post natal independiente. Si este transito ocurre utilizando el metodo de la cesarea, el individuo estara expuesto a un estres superior y a mayores riesgos (Shofield y Cotran 2007). El periodo desde la aplicacion de la anestesia hasta la reanimacion de los curieles (neonatos) se considero un punto critico si se compara con la prolongada sobrevivencia en las ratas segun Francis et al. (2001) y los conejos citado por Forte et al. (2001) despues de la dislocacion cervical de las madres histerectomizadas, por eso se le presto mucho interes al tiempo que no excediera de 2,5 minutos, desde la ligadura del utero gravido hasta su reanimacion (Landy et al., 1960).

La alta letalidad en los diez primeros dias de vida pudo deberse a la incorrecta seleccion de animales, considerados prematuros por otros autores, que arrojaron indices superiores de sobrevivencia al emplear neonatos de 70 g o mas (Dieters et al., 1976).

Los microorganismos oportunistas aislados, los relacionamos con defectos en la implantacion de la microbiota gastrointestinal. Otras investigaciones demostraron que el desbalance de la microbiota cecal en curieles obtenidos por histerectomia y mantenidos en barrera causo alta mortalidad, infecciones por microorganismos oportunistas, prevaleciendo los trastornos entericos con cambios histologicos semejantes a los descritos en nuestros resultados, ademas de neumonias, otitis media y reduccion del peso corporal e indicaron que los problemas pudieron deberse a una pobre o inadecuada composicion de la microbiota intestinal, constituida mayormente en los curieles por organismos bacteroidaceae y peptocococeae (Yanabe et al., 2001). Estudios en conejos indicaron que la inoculacion de una microbiota completa autoctona es un metodo apropiado para convertir un animal GF a su estado normal. La microbiota completa autoctona ayuda al establecimiento de la resistencia de especies patogenas y patogenas oportunistas, ademas manifesto ser esencial para la salud y la sobrevivencia de los animales obtenidos por histerectomia (Yanabe et al., 1999).

Los desajustes dieteticos conjuntamente con una mala implantacion de la microbiota gastrointestinal influyeron en la salud de los curieles obtenidos por cesarea y aunque no fue demostrado, la microbiota implantada se multiplico, los microorganismos ocuparon su nicho correspondiente y el heno o hierba esteril los proveyo de algun factor fundamental del crecimiento y de un sustrato adecuado para la proliferacion bacteriana, inferido por la mejoria de su apariencia clinica.

Otros autores dieron a conocer los desajustes en la dieta sobre la composicion de la microbiota y plantearon que la utilizacion competitiva de escasos nu trientes por los microorganismos autoctonos y sus hospederos pueden repercutir sobre los procesos fisiologicos y bioquimicos del animal, llegando a complicar la estimacion cuantitativa de los requerimientos dieteticos (Gordon y Pesti 1971). Estas valoraciones nos ayudaron a comprender el comportamiento superior de los animales amamantados por sus madres.

La dieta es un factor fundamental y de gran importancia para la investigacion gnotobiotica. No solo el cambio cualitativo de las dietas influye sobre el fisiologismo animal, simplemente el modo de esterilizacion y la forma de presentacion inducen a grandes variaciones fisiologicas (Rote y Blaut 2013). Nosotros comprobamos la influencia de estos cambios cuando se comenzo a irradiar las dietas y con la aparicion de trastornos gastrointestinales a medida que se sustituia la dieta de forma escalonada de semisolida a solida peletizada. Desde el punto de vista de la estabilidad de los nutrientes, Coates (1984) demostro que la irradiacion es el metodo de preferencia para la esterilizacion de las dietas por ser menos destructivos sus efectos sobre las proteinas y aminoacidos en dosis tan altas como la de 10Mrad.

Muchos son los factores que influyen en el establecimiento de la microbiota gastrointestinal (Wagner 2008; Fava y Danese 2011). Se llegara a la "Normalizacion" si se reunen una gran variedad de microorganismos y factores como la composicion de la dieta, la reduccion del tamano cecal y la estructura histologica del sistema gastrointestinal en los animales gnotobioticos (Tlaskalova-Hogenova et al., 2011). Y, el establecimiento de la microbiota gastrointestinal sera semejante al del animal convencional segun Gordon y Pesty (1971), solo cuando sean coleccionadas grandes cantidades de microorganismos de heces y de contenido intestinal de un animal convencional sano, sin la intervencion de medios de cultivos.

Conclusiones

La metodologia aplicada permitio obtener curieles criados en aisladores, derivados por histerectomia aseptica y alimentados con dietas esteriles, con un comportamiento estable y superior en la segunda generacion que mostro ser fertil, resultado de la interaccion entre los factores hospederos-microbiota-dieta. La especializacion del personal y la experiencia acumulada nos prepararon para incursionar en otras especies como ratas, ratones, aves, conejos, ovinos y perros. Los animales asociados con una microbiota gastrointestinal autoctona fueron libres para todos los patogenos muestreados.

Recibido: agosto 5 de 2013

Aprobado: abril 25 de 2014

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Barbara O Gonzalez Navarro, PhD. Centro Nacional para la Produccion de Animales de Laboratorio. CENPALAB. Calle 3ra No. 40759 entre 6ta y Carretera Tirabeque, Reparto La Union, Boyeros, La Habana. Cuba. barbara.gonzalez@cenpalab.inf.cu

Candida Forte Miranda, MSc. CENPALAB. candida.forte@cenpalab.inf.cu

Ramon Alonso Rojas, MV. CENPALAB. Fallecido

Antonio Alfonso Montero, MV. CENPALAB. antonio.alfonso@cenpalab.inf.cu

Liliana Francis Turner, PhD. Universidad de Tolima, Ibague, Tolima, Colombia. lily_colcuba@gmail.com

Maria Elena Arteaga Pere, MSc. CENPALAB. melena@cenpalab.inf.cu

Layna Riera Ojeda, PhD. CENPALAB. layna.riera@cenpalab.inf.cu
Tabla 1. Formula de la papilla L-477 modificada.

Ingredientes            Cantidad (g)

Formula peletizada          100
Avena molida                100
Glucosa D (+) anhidra        10
Levadura Torula              15
Cloruro de Sodio             5
Agua                        1000

Tabla 2. Formula peletizada C-484.

Materias primas                     % de
                                  Inclusion

Trigo                                30
Maiz                                 13
Avena                                10
Soya                                 18
Alfalfa deshidratada                18,65
Aceite de girasol                    2,0
Harina de pescado                    2,0
CaC[O.sub.3]                         1,1
CaHP[O.sub.4]                        0,4
Mg[([C.sub.2][H.sub.3]              0,95
  [O.sub.2]).sub.24][H.sub.2]O
C[H.sub.3]COOK                       0,9
Pre-mezcla minero-vitaminica         3,0

Tabla 3. Valor nutricional
de la formula C-484.

Parametros             %
bromatologicos

Materia seca          90
Humedad               10
Proteina bruta       18,10
Fibra bruta          8,29
Grasa bruta          3,19
Energia           2,40 Kcal/g
  metabolizable
Ca                    1,0
P                    0,48

Tabla 4. Suplementos vitaminicos.

Ingredientes                1ra Semana   2da Semana   3ra Semana
                             de vida      de vida      de vida

Acido ascorbico (mg)           12,5         16,5          20
Tiamina (g)                    0,05         0,05         0,05
[H.sub.2]O destilada (ml)      100          100          100
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Author:Gonzalez Navarro, Barbara O.; Forte Miranda, Candida; Alonso Rojas, Ramon; Alfonso Montero, Antonio;
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Jul 1, 2014
Words:4384
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