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Primera evidencia de Chlamydia psittaci en huron sable (Mustella putorios furo) en Venezuela.

First evidence of Chlamydia psittaci in the sable ferret (Mustella putorios furo) in Venezuela

INTRODUCCION

Chlamydia psittaci (Cp) es una bacteria intracelular obligada que posee la capacidad de infectar mas de 460 especies de aves (Kaleta y Taday 2003). Desde el punto de vista del hospedador posee diferencias filogeneticas, donde existe especificidad a especies aviares y mamiferas (Sachse 2015). Sin embargo, Cp ha diversificado su capacidad de infectar a multiples especies, y es considerada un factor de riesgo mortal para especies en cautiverio (Frutos et al. 2015). La transmision de Cp ocurre mediante la inhalacion de aerosoles provenientes de secreciones nasales, orina, heces secas, tejidos y plumas de animales portadores de la bacteria (Sachse et al. 2015). Como consecuencia, en los centros de cautiverio existe un riesgo de transmision permanente para diversas especies animales que de esta manera pueden llegar a desarrollar clamidiosis (Rodriguez-Leo et al. 2017a).

La clamidiosis es una infeccion del tracto respiratorio superior relacionada con conjuntivitis serosa y sinusitis, puede ser limitada o progresar rapidamente a neumonia, septicemia, hepatitis, esplenitis y en ocasiones muerte subita del ave. En mamiferos generalmente es sub-clinica, sin embargo, puede generar letargo, anorexia, crecimiento retardado de crias, infertilidad, diarrea, cuadros graves de neumonia, queratoconjuntivitis y poliartritis (Sachse et al. 2015). Recientemente Cp ha adquirido mayor relevancia a nivel mundial en esta clase de animales; Bhardwaj et al. (2015) asociaron a Cp como causante de neumonia (72,7%) y abortos (78,9%) en ovejas y cabras de vida libre en el Himalaya. En Alemania, Sprague et al. (2009) reportaron la presencia de Cp en cuatro caninos de una casa de crianza, las cuales presentaban cuadros recurrentes de queratoconjuntivitis, dificultad respiratoria y mortalidad del 50% en crias, asumiendo que la persistencia del cuadro se debe a la circunstancial introduccion de tres psitacidos positivos para Cp.

El contacto previo con aves infectadas principalmente del orden Psittaciforme es un factor predisponente para la adquisicion de Cp, por ello son necesarios metodos diagnosticos para la identificacion de este agente. La implementacion de tecnicas moleculares para el diagnostico de Cp de fauna en cautiverio, permite generar informacion para la creacion de mecanismos epidemiologicos que eviten la diseminacion de este microorganismo, sobre todo en Venezuela donde no existe un diagnostico habitual de este agente en centros de cautiverio. Rodriguez-Leo et al. (2017b) demostraron elevada endemicidad en aves de diversos ordenes y senalan el riesgo de transmision de Cp a mamiferos adyacentes a las jaulas de las aves positivas para este patogeno. Por ello, el presente trabajo tuvo como objeto la busqueda de Cp en individuos de huron sable (Mustellaputorios furo) en cautiverio que habitaban junto a una perdiz crestada (Colinus cristatus) con caracteristicas clinicas de clamidiosis aviar.

MATERIALES Y METODOS

Recoleccion de muestras

A partir de cinco individuos de huron sable (Mustelasputorios furo) y una perdiz crestada (Colinus cristatus) en cautiverio, se recolectaron muestras de hisopados rectal y cloacal respectivamente. Para ello, los hurones fueron capturados con guantes de lona para la recoleccion de muestras de hisopados rectales, se lavo la region anal con una gasa y SSF 0,9% esteril, a continuacion se introdujo un hisopo esteril en el recto de cada ejemplar; durante este proceso se realizaron movimientos rotatorios para la recoleccion de mayor cantidad de celulas, el mismo procedimiento se realizo para la perdiz. La manipulacion de los animales se ejecuto de acuerdo a la Guia para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del NCR (2011). Para ambas especies el procedimiento se realizo por cuadriplicado en el mismo espacio de tiempo, seguidamente, cada hisopo esteril se almaceno en un tubo con 1 mLde SSF 0,9% esteril y se guardo en una cava a temperatura promedio de -4[grados]C para posteriormente ser transportadas al laboratorio No 8 del Area de Biologia Molecular, Instituto de Investigaciones Biomedicas Dr. Francisco Triana Alonso, Universidad de Carabobo, Venezuela.

Procedimiento experimental

La extraccion del ADN bacteriano a partir de las celulas presentes en las muestras de hisopado rectal y cloacal se realizo a traves del protocolo de fenol-cloroformo precipitacion con etanol (Rodriguez-Leo et al. 2017a). Se empleo la tecnica de PCR anidada optimizada por Rodriguez-Leo et al. (2017a) utilizando en la primera reaccion de PCR un par de cebadores especificos sentido Cp1F (ACG GAA TAA TGA CTT CGG) antisentido Cp1R, (TAC CTG GTA CGC TCA ATT. T) dirigidos a los miembros de la familia Chlamydiaceae, especificamente a la secuencia de una porcion del gen 16s ADNr, donde se esperaba un amplicon de 436 pb. Posteriormente, en la segunda reaccion de amplificacion se utilizo un segundo par de cebadores dirigidos a las regiones variables de la especie Cp CpintF sentido (ATA ATG ACT TCG GTT GTT ATT) y CpintR antisentido (TGT TTT AGA TGC CTA AAC AT), que se une a las copias de secuencias de los productos formados en la primera reaccion de PCR, a partir de los cebadores dirigidos a los miembros de la familia antes mencionada; en esta segunda reaccion se esperaba obtener un amplicon de 126 pb. Se utilizaron dos controles positivos a ADN de Cp (CP018 y CP046) donados por el Laboratorio de Biologia Molecular de la Universidad del Zulia, Venezuela.

Las mezclas se realizaron con: Tampon de reaccion (Promega[R]), Tris HCl 20 mM (pH 8,4), KCl 50 mM; 2,5 mM MgCl2 (Promega[R]), desoxinucleotidostrifosfato (dNTPs, del ingles 2'-desoxynucleoside 5'-triphosphate) (10 mM), oligonucleotidos (10pmol/[micron]L), Taq polimerasa (1,25 U/[micron]L). A las mezclas de reaccion se agregaron 01 [micron]L (50ng) de las muestras de ADN extraidas, la mezcla de reaccion se sometio a incubacion con el siguiente programa de amplificacion: desnaturalizacion inicial a 95[grados]C por 5 minutos, seguido de 35 ciclos de desnaturalizacion a 94[grados]C por 1 minuto, hibridacion a 55[grados]C por 2 minutos, elongacion a 72[grados]C por 1 minuto y una extension final a 72[grados]C por 8 minutos en un termociclador PTC-100[TM] (MJ Research, INC[R]). La segunda reaccion de PCR se realizo de igual manera usando como ADN molde 02 [micron]L (50ng) de los productos de amplificacion de la primera reaccion, para un volumen final de reaccion de 50 [micron]L. Las condiciones de tiempo y temperatura fueron identicas a las usadas en la primera reaccion de amplificacion.

Los productos finales se visualizaron en geles de agarosa al 2%, (Figura 1) y se compararon con el marcador de tamano molecular 100 pb ADN Promega[R]. El resultado de la migracion se observo en un equipo de fotodocumentacion Gel Doc 1000 BIO-RAD[R] mediante el programa MultiAnalyst version 1.1 (1996-97).

RESULTADOS Y DISCUSION

Chlamydia psittaci ha sido descrita primordialmente en aves, sin embargo, posee la capacidad de infectar a diversas especies de mamiferos, siendo descrita con mayor frecuencia en porcinos, equinos, caninos, caprinos y ovinos (Reinhold et al. 2012; Rodolakis et al. 2015). En un principio los genotipos de Cp eran considerados especie-especificos; no obstante, en la ultima decada se ha evidenciado que los genotipos han ampliado el rango de hospedadores. Frutos (2015) aislo el genotipo WC en Passeriformes demostrando la variabilidad que Cp presenta y su capacidad de infectar a diferentes especies indistintamente del genotipo. En la presente investigacion se identifico ADN compatible para Cp en un ejemplar de Colinus cristatus, dicha ave presentaba signos clinicos caracteristicos de clamidiosis aviar entre ellos: plumas erizadas, depresion, respiracion dificultosa, secrecion nasal, ocular y diarrea, la cual se presume fue el reservorio y fuente aparente de infeccion para el resto de las animales en la habitacion donde residia, principalmente para los hurones debido a que su jaula se encontraba junto a la de ellos.

Chlamydia psittaci se detecto en 4 de 5 individuos de Mustella putorios furo. Este hallazgo demostro la posibilidad de un nuevo reservorio para esta bacteria, lo que representa el primer reporte de Cp en Mustella putorios furo en Venezuela.

En relacion a las condiciones de cautiverio de los hurones, estos eran mantenidos en dos jaulas de 80 x 50 x 70 cm, dentro de una habitacion compartida con multiples especies de aves y mamiferos. En la parte superior se encontraban dos jaulas con Psittacula krameri cuyas excretas se diseminaban por toda la habitacion. Estos Psittaciformes no se muestrearon debido a que se encontraban en fase de ovipostura. Este orden de aves ha sido identificado como uno de los que mayor incidencia de Cp presenta (Raso et al. 2015). Por ello, representan un riesgo de transmision para el resto de las especies de aves y mamiferos albergadas en la misma habitacion.

A su vez, en la parte inferior de la habitacion se encontraban multiples jaulas con especies de conejos (Oryctolagus cuniculus), acures (Cavia porcellus y Cavia Sheltie) y erizos morunos (Atelerix algirus vagans). En relacion a la ventilacion, esta era deficiente ya que la habitacion solo poseia la puerta principal y una cupula en la parte superior, lo que concentraba la cantidad de productos de excrecion de los animales y la circulacion de Cp.

Adicionalmente, uno de los elementos que posibilito la transmision de Cp en los hurones es que la perdiz presentaba signos clinicos de clamidiosis aviar, asi que a traves de aerosoles provenientes de sus secreciones nasales, orina, heces secas y plumas pudieron transmitir Cp a los primeros. Sin embargo, debido al desconocimiento sobre el tiempo de permanencia de los animales en el centro de cautiverio, la ausencia de un periodo de cuarentena, control del ingreso de especies animales y la ausencia del diagnostico molecular de Cp, el mecanismo de transmision es desconocido. En este sentido, es posible que la perdiz pudiera haber sido infectada por el contacto de los productos de excrecion de los hurones representando una cepa de Cp de mayor virulencia en aves.

En este sentido, pudieron ser multiples factores quienes favorecieron la transmision de Cp a los hurones como la infraestructura sin ventilacion, el espacio reducido, las deficiencias sanitarias, la diversidad de especies, asi como la presencia de un ave positiva para Cp con signos de clamidiosis aviar. No obstante, la evidencia de ADN complementario para Cp no descarta la posibilidad de coinfeccion por otros miembros de la familia Chlamydiaceae. Asi pues, es relevante destacar que especies como C. pneumoniae, C. pecorum, y C. abortus poseen la capacidad de infectar aves y mamiferos (Frutos et al. 2015). En Argentina se identifico ADN compatible para Chlamydia sp. en hurones, donde no hubo amplificacion para secuencias de C. pneumoniae, C. psittaci y C. abortus (Frutos 2015).

C. psittaci y C. abortus guardan una estrecha relacion filogenetica, han sido descritos genotipos de Cp mas cercanos a C. abortus siendo clasificados como cepas intermedias C psittaci / C. abortus las cuales poseen elevada capacidad de infeccion a especies en cautiverio y vida libre (Szymanska-Czerwinska et al. 2017). Madani et al. (2013) identifico en Psittacula krameri una unica secuencia de ADN con 98% y 92% de identidad con C. abortus y el genotipo F de Cp, respectivamente. En el presente estudio los cinco ejemplares de Mustella putorios furo se encontraban en contacto permanente con las excretas de Psittacula krameri, siendo este un mecanismo de transmision para cualquier especie de la familia Chlamydiaceae que posea como reservorio Psittaciformes. Por ello, es ineludible la aplicacion de tecnicas moleculares para la deteccion de especies Chlamydiales. Opota et al. (2015) disenaron una PCR altamente especifica y sensible para la identificacion de las especies de Cp y C. abortus debido al alto impacto que posee no solo para las aves y mamiferos, sino ademas para la salud publica.

La diversidad genetica de Cp y su capacidad de infectar nuevos reservorios apunta hacia una aparente perspectiva evolutiva de esta especie, generando un nuevo abanico de huespedes susceptibles a estas bacterias con genotipos altamente heterogeneos y con elevada capacidad de dispersion.

En este sentido se debe realizar el analisis filogenetico de los aislados de especies clamidiales no solo para identificacion de una posible coinfeccion, sino ademas, para la identificacion del genotipo de Cp que se encuentre circulando. Madani et al. (2013) afirman el advenimiento de nuevos genotipos de Cp donde la caracterizacion molecular representara una herramienta invaluable para el entendimiento y distribucion de esta especie.

En el presente estudio no se logro realizar a la caracterizacion molecular debido a limitaciones de recursos financieros. No obstante, esta debe ser un instrumento que debe aplicarse debido a la diversidad de agentes clamidiales en fauna en cautiverio y vida libre, donde Venezuela, por ser uno de los paises con una enaltecida biodiversidad debe velar por su conservacion y preservacion, primordialmente para la fauna en riesgo de extincion.

CONCLUSIONES

Se demostro por primera vez en Venezuela la presencia de ADN de Cp en Mustella putorios furo, donde el contacto con Colinus cristatus infectada, el hacinamiento, la inadecuada ventilacion y las condiciones sanitarias deficientes favorecieron la infeccion por Cp. La identificacion de Cp en fauna en cautiverio es un procedimiento que debe ser ejecutado de forma habitual, aun cuando el animal no posea signos de clamidiosis, incluyendo especies aviares y mamiferos debido a la diversidad de reservorios que posee Cp.

Recomendaciones

Es necesaria la caracterizacion molecular de los aislados de Cp para relacionar el genotipo presente en Mustella putorios furo con el de Colinus cristatus y ampliar la identificacion de Cp en mamiferos en cautiverio, principalmente los que se encuentren en contacto con aves o con la cercania de estas a sus jaulas. Por ultimo, es preciso evaluar la presencia de Cp en fauna silvestre de Venezuela para el reconocimiento de los reservorios y su relacion con las condiciones geograficas de este pais.

DOI: 10.15446/RFMVZ.V65N2.75639

REFERENCIAS

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C. Rodriguez-Leo (1,2) *, D. Camacho (1), V. Hernandez-Aguilera (2), M. Viettri (1), C. Flores (2), H. Henriquez (2), M. Gonzalez (2)

Articulo recibido: 31 de diciembre de 2017 * Aprobado: 1 de agosto de 2018

(1) Instituto de Investigaciones Biomedicas Dr. Francisco J. Triana Alonso (BIOMED), Universidad de Carabobo (Venezuela).

(2) Laboratorio de Investigaciones Microbiologicas Dr. Carlos Palacios, Departamento de Microbiologia, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo, Sede Aragua (Venezuela).

* Autor para correspondencia: leogod1985@hotmail.com

Leyenda: FIGURA 1. Electroforesis Gel de agarosa al 2% en TAE (Tris-acetato 40 Mm, EDTA 1 Mm pH 8) tenido con bromuro de etidio (0,5 ug/ml) de los Productos de amplificacion de la subunidad 16s ADNr de Chlamydia psittaci de los reservorios animales positivos en cautiverio. M: Maracador de tamano molecular 100 pares de bases Promega[R]), carril 1 Colinus cristaceo, carril 2 - 5 Mustella putorios furo, CP Control Positivo, CN Control negativo.
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Title Annotation:Reporte de caso
Author:Rodriguez-Leo, C.; Camacho, D.; Hernandez-Aguilera, V.; Viettri, M.; Flores, C.; Henriquez, H.; Gonz
Publication:Revista Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia
Date:May 1, 2018
Words:3136
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