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Primer reporte de la mancha bacteriana en parchita (Passiflora edulis Sims f. flavicarpa) en Venezuela.

First report of bacterial blight of passion fruit (Passiflora edulis Sims f. flavicarpa) in Venezuela

INTRODUCCION

La parchita maracuya, un frutal perteneciente a la familia Passifloraceae, representa un cultivo tipico de paises de clima tropical, y dentro de estos Venezuela ocupa uno de los primeros lugares como productor a nivel mundial (Pinto et al., 2003).

La planta puede verse afectada por diversos tipos de patogenos, y para el desarrollo de las estrategias de control es necesario realizar estudios en cuanto a la identificacion y caracterizacion del agente causal de la enfermedad en las regiones donde esta se presente.

En la localidad de Aroa (estado Yaracuy) se han presentado danos tales como manchas humedas en las hojas de este cultivo. Con la finalidad de determinar la identidad del agente causal del dano, se llevo a cabo el presente trabajo mediante la colecta de hojas afectadas y posterior estudio de este material en condiciones de laboratorio.

MATERIALES Y METODOS

Hojas sintomaticas de parchita con manchas dispersas en toda la hoja fueron colectadas en una finca de Aroa y procesadas en el laboratorio de Bacteriologia de los Posgrados de Agronomia de la Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado (UCLA) para el diagnostico e identificacion del agente causal. Para el aislamiento del presunto patogeno, las muestras identificadas para el diagnostico como P-0185 fueron desinfectadas con NaOCl al 2 %, lavadas tres veces en agua destilada esteril (ADE) y transferidas luego al medio agar nutritivo (AN) de composicion (3 g extracto de carne, 5 g de peptona y 15 g de agar), por el metodo de dilucion en serie, esparciendo 0, 1 mL de las diluciones [10.sup.5] a [10.sup.6] con una varilla de vidrio esteril para la obtencion de colonias individuales. Las capsulas se incubaron a temperatura ambiente (aproximadamente 24 a 26 [grados]C) en posicion invertida y se espero hasta la formacion de las colonias. Se realizaron pruebas presuntivas, en las cuales se uso KOH al 3 % para determinar si eran Gram (-) o Gram (+) (Suslow et al., 1982) y la tincion con rojo congo para observar en el microscopio optico (100X) la forma de la celula bacteriana. Para la obtencion del cultivo puro la colonia bacteriana fue repicada en el medio extracto de levadura, dextrosa, carbonato de calcio (YDC) de composicion (10 g extracto de levadura, 20 g dextrosa (glucosa), 20 g carbonato de calcio y 15 g de agar) para obtener a las 24 a 48 horas. El cultivo puro se utilizo para la realizacion de las pruebas de patogenicidad y la identificacion del patogeno (French y Hebert, 1980).

La preparacion del inoculo fue realizado a partir de cepas bacterianas puras desarrolladas en AN de 24-48 horas de crecimiento. Se prepararon suspensiones con agua destilada esteril con una concentracion de [10.sup.8] UFC x [mL.sup.-1], correspondiente al tubo No. 4 segun la escala de McFarland (Barret, 1975). Para la inoculacion se utilizaron plantas provenientes de semillas de frutos sanos de parchita, las cuales fueron sembradas en bolsas de polietileno de 2 kg de capacidad, conteniendo una mezcla de sustrato preparado con tierra negra y concha de arroz en proporcion 2:1, respectivamente, y esterilizado con vapor. Se inocularon plantas de 60 dias de edad con la cepa bacteriana. Se utilizaron los metodos de aspersion en las hojas con heridas y sin heridas, el primero consistio en realizar pequenas heridas a las hojas con la aguja de una jeringa y luego asperjar con la suspension del inoculo tres hojas por cada planta. Se dejaron tres plantas testigo las cuales fueron inoculadas de la misma manera pero con ADE. Las plantas se mantuvieron en camara humeda pre-inoculacion por 48 horas y posterior a la inoculacion por 72 horas, para lo cual se utilizo una bolsa plastica transparente, con una armadura hecha de alambre y mantenidas en umbraculo a una temperatura de 27 [grados]C y 68 % de HR en promedio. Las plantas se asperjaron con agua dos veces al dia y se realizaron observaciones diariamente hasta que se presentaron los sintomas. Posteriormente se reaislo la bacteria y se realizaron pruebas para corroborar que se trataba de la misma bacteria que fue inoculada. Kososki et al. (2008) siguieron metodologias y condiciones en las pruebas de patogenicidad similares a las usadas en este experimento.

Para la identificacion y caracterizacion del genero y especie de la bacteria se realizaron observaciones morfologicas y fueron estudiadas las caracteristicas culturales. Igualmente, fueron realizadas pruebas bioquimicas y fisiologicas de acuerdo a metodologias recomendadas (Holt et al., 1994; Schaad et al., 2001).

La evaluacion de caracteristicas culturales se realizo luego de 24 horas, a partir de colonias bacterianas puras en los medios de cultivo AN y YDC. Se observaron caracteristicas de borde, brillo, elevacion, consistencia y color de las cepas individuales (Schaad et al., 2001).

Las caracteristicas morfologicas fueron determinadas en colonias de 24 a 48 horas de crecimiento. Se procedio a observar en el microscopio optico (100X) la forma de la celula bacteriana mediante la tincion con rojo congo (Schaad et al., 2001). Para la determinacion de las caracteristicas fisiologicas y bioquimicas, se utilizaron diferentes pruebas tales como: KOH al 3 %, prueba de Hugh y Leifson (requerimiento de oxigeno), bactotioglicolato, bactofenol rojo dextrosa agar, oxidasa, catalasa, hidrolisis de almidon. Produccion de [H.sub.2]S, crecimiento a 35 [grados]C, produccion de ureasa, digestion de las proteinas, licuefaccion de la gelatina, hidrolisis de esculina, produccion de acidos a partir de carbohidratos, reduccion de nitratos, tolerancia de la bacteria a NaCl (0-5 %). Se determino la produccion de acidos a partir de arabinosa, glucosa, manosa, celobiosa, fructosa, galactosa, trehalosa. Finalmente se realizaron pruebas de crecimiento en los medios semiselectivos SX y Tween (Klement et al., 1990; Holt et al., 1994; Schaad et al., 2001).

RESULTADOS Y DISCUSION

Aislamiento del patogeno, pruebas presuntivas y obtencion del cultivo puro

El aislamiento puro obtenido a partir de las manchas en hojas de parchita fue un crecimiento bacteriano de color amarillo en el medio YDC y color crema amarillento en AN (Figuras 1A, 1B), el cual al realizarse las pruebas presuntivas resulto Gram negativo (positivo al KOH 3 %) y con celulas en forma de baston. Luego, se procedio a la inoculacion de la bacteria purificada en plantas de parchita.

Pruebas de patogenicidad

La bacteria inoculada produjo sintomas de manchas foliares necroticas con un halo amarillo, 15 dias despues de la inoculacion, las manchas se iniciaron en la parte terminal del foliolo y manchas necroticas circulares en toda la superficie del foliolo, estas se tornaban amarillentas y se desprendian facilmente de la planta (Figuras 1C, 1D, 1E). Del reaislamiento se obtuvo una colonia bacteriana con las mismas caracteristicas de la bacteria inoculada cumpliendose con los postulados de Koch y posteriormente se procedio a la identificacion del patogeno.

Los sintomas obtenidos fueron similares a los senalados por otros autores al inocular esta bacteria en plantas de parchita, como manchas pequenas aceitosas, con halos visibles, que al evolucionar la enfermedad las lesiones se tornaron castanas y causaban el secamiento de las hojas y defoliacion. El comienzo de la mancha en la extremidad de la hoja, tambien es mencionado por Tassa y Duarte (2002). La mancha foliar necrotica con halo clorotico, en los margenes de la hoja, tambien fue obtenida por Pinto et al. (2003), quienes observaron el sintoma en hojas maduras que al coalescer se diseminaba por toda la hoja, secandola y causando posteriormente la muerte y defoliacion; ademas observaron que la bacteria causa danos a los frutos, con manchas verdosas grasientas en la superficie, y cuando penetra produce una fermentacion, dano que es de gran importancia debido a que afecta directamente el producto comercial. Por su parte, Liberato y Zerbini (2003) senalan que el patogeno ataca los foliolos de la planta y produce una costra dura en los frutos que impide su comercializacion. Los sintomas de mancha necrotica a partir de los margenes de la hoja, obtenidos en este trabajo, asi como clorosis de las hojas han sido similares a los reportados por Miranda (2004). Halfeld-Vieira y Nechet (2006) tambien obtuvieron los sintomas rapidos de quema foliar al pulverizar las plantas en umbraculo con una suspension bacteriana ajustada a 5 x [10.sup.7] UFC x [mL.sup.-1]. Lopes et al. (2006) utilizaron la misma tecnica de inoculacion de aspersion por heridas de una suspension bacterial de [10.sup.8] UFC x [mL.sup.-1] a partir del crecimiento bacteriano en AN en plantas que luego se mantuvieron en umbraculo a una temperatura promedio de 28 [grados]C, similar a los parametros de este experimento.

Identificacion y caracterizacion de la bacteria. Caracteristicas culturales

La colonia bacteriana se observo de color amarillo, circular, mucoide, brillante, de bordes enteros y superficie lisa en el medio YDC, y colonia crema a amarilla claro en AN. Estas colonias crecieron despues de las 24 h de su siembra, coincidiendo con lo descrito para esta bacteria por otros autores (Tassa y Duarte, 2002; Halfeld-Vieira y Nechet, 2006).

Caracteristicas morfologicas, fisiologicas y bioquimicas

La bacteria presento forma de baston en la tincion con rojo congo asi como en la tincion de Gram. Resulto positiva en la prueba del KOH al 3 %, bactotiglicolato, hidrolisis de almidon, produccion de [H.sub.2]S, licuefaccion de la gelatina, prueba de catalasa, y reaccion negativa en la prueba de oxidasa, Hugh y Leifson, bactofenol rojo dextrosa agar y reduccion de nitratos. Todas las caracteristicas mencionadas en el Cuadro 1 coinciden con las descritas para el genero Xanthomonas (Holt et al., 1994; Schaad et al., 2001; Tassa y Duarte, 2002).

El crecimiento de la bacteria a 35 [grados]C fue evidenciada por la turbidez del tubo de YS inoculado, comparado con el testigo. Tambien se observo crecimiento de la colonia en YS agar, la bacteria resulto positiva para digestion de la proteina, hidrolisis de esculina, licuefaccion de la gelatina (licuefaccion total a los 3 dias) y resulto negativa en la produccion de la ureasa. En las placas con concentracion de NaCl en concentracion de 0, 1, 2 y 3 % se observo un desarrollo completo de la bacteria, mientras que a concentraciones de 4 y 5 % se observo poco desarrollo y la bacteria no redujo nitrato. La bacteria fue capaz de formar acidos despues de reducir los carbohidratos arabinosa, glucosa, manosa, fructosa, trehalosa, galactosa y celobiosa, lo cual fue evidenciado por el cambio de color de los tubos inoculados. Estos resultados coinciden con lo senalado por Holt et al. (1994).

[FIGURA 1 OMITIR]

Todas las caracteristicas antes mencionadas (Cuadros 1 y 2) coinciden con las descritas para el genero Xanthomonas (Holt et al. 1994; Schaad et al., 2001; Vicente et al., 2001). Es una enfermedad de ocurrencia generalizada en Brasil, que ha llegado a limitar la produccion en algunas regiones (Kososki et al., 2008; Nakatani et al., 2009). En otros paises de America Latina como Colombia y Ecuador tambien ha sido senalada (FAO, 1999). Nakatani et al. (2009) mencionan a la mancha bacteriana causada por Xap como una de las mas importantes de la parchita en la region del Brasil, pudiendo limitar la produccion en algunas regiones. El uso de resistencia genetica, control quimico, conjuntamente con medidas de exclusion, es una de las practicas de control mas recomendadas. Lopes et al. (2006) concluyeron en la importancia del analisis de la diversidad genetica entre los aislamientos de Xap, ya que esta demostrado que hay variabilidad para agresividad o virulencia (Goncalves y Rosato, 2000).

Para la identificacion de la especie (campestris) se observo el crecimiento en Sx y Tween; en ambos medios de cultivo la prueba resulto positiva, evidenciado por el crecimiento de la bacteria, con la formacion de un aclaramiento alrededor del estriado.

Para la determinacion del patovar, la bacteria presento patogenicidad al ser inoculada en parchita, mostrando la mancha bacteriana ya mencionada y confirmando el pv. passiflorae. Liberato y Zerbini (2003) senalaron a Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (Pereira) como bacteria patogena que causa manchas foliares en parchita, la cual es tambien nombraba bajo la sinonimia de X. campestris pv. passiflorae (Pereira) Dye. La mancha bacteriana fue descrita por primera vez por Pereira (1969), en Sao Paulo, Brasil, quien la clasifico como una nueva especie: Xanthomonas passiflora, aunque mas tarde, Dye et al. (1980) la reclasificaron como X. campestris pv. passiflorae. Finalmente, Goncalves y Rosato (2000), por medio de tecnicas de hibridacion ADN-ADN, propusieron su reclasificacion como X. axonopodis pv. passiflorae.

Como se menciono anteriormente, la especie Xanthomonas campestris incluye los patovares designados segun la patogenicidad en sus hospedantes. X. campestris pv. passiflorae es una bacteria patogenica en parchita, y raramente es un patovar incluido en los estudios taxonomicos generales, quizas porque la planta hospedante es cultivada en las regiones tropicales y subtropicales (Goncalves y Rosato, 2000). La reclasificacion del genero Xanthomonas fue propuesta por Vauterin et al. (1995) basados principalmente en el analisis de hibridacion DNA-DNA. X. campestris fue dividido en 16 nuevas especies y el Comite de Taxonomia de bacterias patogenas en plantas valido la propuesta. Sin embargo, la Xanthomonas patogena en parchita no habia sido analizada y la designacion anterior de X. campestris pv. passiflorae se habia mantenido (Goncalves y Rosato, 2000). La bacteria tambien fue estudiada por Tassa y Duarte (2002) en parchita y la identificaron como X. axonopodis pv. passiflorae por presentar reaccion (-) a la oxidasa y uso de glucosa, manosa, galactosa, trealosa y celobiosa, lo cual, coincide con los resultados que se presentan en el Cuadro 1. Ya caracterizada e identificada la bacteria como X. axonopodis pv. passiflorae, es mantenida en glicerol 15 % a -20 [grados]C, en el Cepario de Bacterias Fitopatogenicas del Posgrado de Agronomia de la UCLA.

CONCLUSIONES

De acuerdo con la sintomatologia observada en cuanto a los resultados positivos de las pruebas de patogenicidad, a las caracteristicas morfologicas, culturales, fisiologicas y bioquimicas, y al crecimiento de la bacteria en los medios semiselectivos Sx y Tween, se identifico el agente causal como Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (Pereira, 1969) Goncalves & Rosato (2000) y se comprobo que los sintomas observados son causados por esta bacteria. Representa el primer reporte en Venezuela de este patogeno en el hospedante Passiflora edulis Sims f. flavicarpa.

LITERATURA CITADA

(1.) Barret, T. 1975. Preparation of bacterial vaccine. In: Proceedings of the First Workshop of Phytobacteriology. R.N. Goodman (ed.). Columbia. University of Missouri. pp. 1-6.

(2.) Dye, D., J. Bradbury, M. Goto, A. Hayward, R., Llelliot y M. Sohro. 1980. International standards for naming pathovars of phytopathogenic bacteria and a list of pathovar names and pathotype stains. Review of Plant pathology 59: 153-168.

(3.) F.A.O. 1999. Impactos actuales y potenciales de las enfermedades de los cultivos perennes de la Amazonia y posibilidades de control para el desarrollo sostenible de la region. Tratado de Cooperacion Amazonica. Secretaria pro tempore. Caracas, Venezuela. 178 p.

(4.) French, E. y T. Hebert. 1980. Metodos de Investigacion Fitopatologica. Editorial IICA. San Jose, Costa Rica. 289 p.

(5.) Goncalves, E. y Y. Rosato. 2000. Genotypic characterization of xanthomonad strains isolated from passion fruit plants (Passiflora spp.) and their relatedness to different Xanthomonas species. Int. J. Syst. Evolu. Microbiol. 50: 811-821.

(6.) Halfeld-Vieira, B. y K. Nechet. 2006. Ocorrencia da mancha bacteriana do maracujazeiro em Roraima. Fitopatol. Bras. 31(2): 5513 (Abstract).

(7.) Holt, J., N. Krieg, P. Sereath, J. Staley y S. Williams (eds.). 1994. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. William & Wilkins. Baltimore.

(8.) Klement, Z., K. Rudolph y D. Sands. 1990. Methods in Phytobacteriology. Akademiai Kiado, Budapest. 568 p.

(9.) Kososki, R.M., J.R. Peixoto, N.T. Junqueira, C.H. Uesugi y B. de Melo. 2008. Reacao de genotipos de maracujazeiro-azedo a Xanthomonas campestris pv. passiflorae, em casa de vegetacao. Passionfruit genotypes reaction to Xanthomonas campestris pv. passiflorae, under greenhouse conditions. Bioscience Journal 24(1): 60-66.

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(11.) Lopes, R., M.T. Gomes Lopes, M. Sampaio Carneiro, F. de Pina Matta, L.E. Aranha Camargo y M.L. Carneiro Vieira. 2006. Linkage and mapping of resistance genes to Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae in yellow passion fruit. Genome 49: 17-29.

(12.) Miranda, J. 2004. Reacao de variedades de maracujazeiro amarelo (Passiflora edulis Sims. f flavicarpa Deg.) a bacteriose causada por Xanthomonas campestris pv. passiflorae. Trabajo de Grado. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz. Sao Paulo-Brasil. 99 p.

(13.) Nakatani, A.K, R. Lopes y L.E. Camargo. 2009. Variabilidade genetica de Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae. Summa phytopathol. 35(2): 116-120.

(14.) Pereira, A.L.G. 1969. Uma nova doenca bacteriana do maracuja (Passiflora edulis, Sims) causada por Xanthomonas passiflorae n.sp. Arq. Inst. Biol. 36: 163-174.

(15.) Pinto, F., F. Oliveira, J. Cardoso y J. Vidal. 2003. Principais Doencas do Maracujazeiro na Regiao Nordeste e seu Controle. Comunicado Tecnico 86: 1-12.

(16.) Schaad, N.W., J.B. Jones y W. Chun. 2001. Laboratory Guide for identification of Plant Pathogenic Bacteria. APS Press. Minessota. 373 p.

(17.) Suslow, T., M. Schroth y M. Isaka. 1982. Application of rapid method for gram differentiation of plant pathogenic and saprophytic bacteria without staining. Phytopathology 72: 917-918.

(18.) Tassa S. y V. Duarte. 2002. Ocorrencia de mancha bacteriana causada por Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae, em maracujazeiro no estado de mato grosso. Fitopatologia Brasileira 27(6): 647.

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(20.) Vicente, J., J. Conway, S. Roberts y J. Taylor. 2001. Identification and origin of Xanthomonas campestris pv. campestris races and related pathovars. Phytopathology 91(5): 492-499.

Yoleidy Escalona [1] y Nancy Contreras [1]

[1] Posgrado de Fitopatologia, Decanato de Agronomia, Universidad Centroccidental "Lisandro Alvarado". Apdo 400. Barquisimeto, Venezuela. e-mail: yoleidyescalona@ucla.edu.ve; ncontreras@ucla.edu.ve

Recibido: Mayo 13, 2010

Aceptado: Febrero 7, 2011
Cuadro 1. Caracteristicas culturales, morfologicas, fisiologicas y
bioquimicas de la bacteria aislada

Prueba                     Reaccion         Prueba          Reaccion

Forma de la celula          Baston     Produccion ureasa       -
  bacteriana
KOH al 3 %                    +        Crecimiento a 35        +
                                          [grados]]C
Bactotioglicolato             +       Tolerancia al NaCl:
Hugh y Leifson                -           0-3 % (buen          +
                                         crecimiento)
Bactofenol rojo               -           4-5 % (poco         +/-
  dextrosa agar                          crecimiento)
Oxidasa                       -          Produccion de
                                      acidos a partir de:
Catalasa                      +            Arabinosa           +
Hidrolisis del almidon        +             Glucosa            +
Produccion de [H.sub.2]S      +             Manosa             +
Digestion de proteinas        +            Celobiosa           +
Hidrolisis esculina           +            Fructosa            +
Licuefaccion gelatina         +            Trehalosa           +
  (total a 3 dias)
Reduccion de nitrato          -            Galactosa           +

Cuadro 2. Crecimiento de la bacteria en diferentes
medios de cultivos diferenciales y convencionales

Medio   X. campestris   Crecimiento colonia

SX            +                 +
Tween         +                 +
AN        Amarillo       Crema amarillento
YDC       Amarillo         Amarillo claro
YS           +                  +
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Title Annotation:NOTA TECNICA
Author:Escalona, Yoleidy; Contreras, Nancy
Publication:BIOAGRO
Article Type:Report
Date:Jan 1, 2011
Words:3334
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