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Presumptive identification of yeasts of biotechnological interest in kefir grains/IDENTIFICACAO PRESUNTIVA DE LEVEDURAS DE INTERESSE BIOTECNOLOGICO EM GRAOS DE KEFIR.

1 Introducao

Os graos de Kefir, que geram a bebida que leva o mesmo nome, sao pequenos granulos de forma irregular rico em micro-organismos que vivem em simbiose em uma matriz de polissacarideos, chamada de kefiran, atuando como fermentadores dos acucares presentes no meio e/ou substrato utilizado para a producao da bebida. Devido a essa simbiose e aos componentes bioativos resultantes do metabolismo microbiologico durante a fermentacao, a bebida torna-se probiotica trazendo beneficios a saude do consumidor (GUZEL-SEYDIM et al., 2011; WESCHENFELDER et al., 2011; LEITE et al., 2013; NIELSEN et al., 2014; PRADO et al., 2015).

Usualmente, a bebida Kefir pode ser preparada em matrizes de fermentacao lacteas como, por exemplo, leite de vaca, ovelha e cabra ou nao lacteas como solucoes de acucar mascavo, principal substrato alternativo (FIORDA et al.,2017). As caracteristicas sensoriais relativas a bebida Kefir, descrita como carbonatada, de sabor acido e de consistencia cremosa, e resultado da utilizacao dos substratos nas rotas bioquimicas dos micro-organismos presentes nos graos de Kefir que podem ser bacterias e/ou leveduras (DERTLI e CON, 2017; FIORDA et al., 2017).

Diferentes especies de micro-organismos tem sido relatadas como constituintes dos graos de Kefir obtidos de diferentes regioes. Dentre essas especies, destacam-se as bacterias acido laticas como Lactobacillus paracasei, L. parabuchneri, L. casei; bacterias aceticas como Acetobacter lovaniensis e leveduras como Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae, Lachancea meyersii. Ressalta-se a importancia da identificacao da comunidades microbianas nos graos de Kefir, uma vez que a partir disto e possivel investigar o potencial biotecnologico desses microorganismos (MAGALHAES et al., 2011; AHMED et al., 2015; DERTLI e CON, 2017).

As fontes de carbono disponiveis para o processo de fermentacao dos graos de Kefir influenciam diretamente a frequencia das especies e a concentracao dos bioprodutos disponiveis na bebida Kefir (FIORDA et al., 2017). Atribuiu-se as propriedades funcionais e os efeitos beneficos da bebida a sua diversificada composicao microbiana, metabolitos secundarios, peptideos bioativos e a matriz kefiran (LEITE et al., 2015). A populacao microbiana presente nos graos, incluindo leveduras do genero Kluyveromyces, Candida, Saccharomyces e bacterias do genero Lactobacillus, oferece a bebida efeitos antitumorais, anti-inflamatorios, antimicrobiano, modulacao do sistema imune intestinal, reduz os niveis de colesterol e melhora a digestao da lactose. Como antimicrobiano, a bebida Kefir tem mostrado atividade contra organismos patogenicos devido a presenca de acidos organicos, peroxido de hidrogenio, acetaldeido, gas carbonico, dentre outros. Alem disso, alguns micro-organismos isolados dos graos tem a capacidade de se ligarem a celulas mutagenicas diminuindo o crescimento de um possivel tumor. O consumo regular da bebida mostrou ser capaz de estimular celulas do sistema imunologico inato do intestino promovendo respostas mediadas por celulas contra tumores e infeccoes, auxiliando na homeostase intestinal e, alem disso, apresentou atuacao positiva sobre a pressao arterial devido a capacidade de dois peptideos, presentes na bebida Kefir, em inibir a ECA-- Enzima Conversora de Angiotensina (GUZEL-SEYDIM et al., 2011; FRANCO, et al., 2013; CARASI et al., 2014; NIELSEN et al., 2014; AHMED et al., 2015; PRADO et al., 2015).

Assim, o objetivo deste estudo foi isolar e identificar, presuntivamente, leveduras presentes nos graos de Kefir da regiao de Bauru/SP com capacidade para a producao de moleculas de interesse biotecnologico.

2 Materiais e Metodos

2.1 Obtencao e manutencao dos graos

Os graos foram obtidos na regiao de Bauru interior do estado de Sao Paulo e foram cultivados em leite integral UHT e agua com acucar mascavo, em potes de vidro a temperatura ambiente. Esses meios de cultivo foram renovados a cada 24 horas, durante 30 dias, lavando-se os graos em agua corrente a cada renovacao.

2.2 Isolamento das leveduras

Pesou-se 40 g dos graos cultivados no acucar e no leite, separadamente e, em seguida, promoveu-se a maceracao dos mesmos com auxilio de almofariz e pistilo, previamente esterilizados. O macerado obtido foi ressuspenso em solucao de triptona a 0,1% e mantidos durante 1 hora a 28 [degrees]C, conforme descrito por Diosma (2014). Apos este periodo, os graos foram semeados em agar Sabouraud com cloranfenicol e incubados a 35 [+ or -] 2[degrees]C. Apos este periodo, as colonias com caracteristicas macroscopicas diferentes foram isoladas e mantidas em tubos de ensaio contendo agar Sabouraud com cloranfenicol.

2.3 Identificacao presuntiva das leveduras

Para a realizacao do exame direto, uma pequena porcao de cada colonia foi coletada e ressuspensa em salina e observada entre lamina e laminula analisando-se as estruturas em microscopio optico nos aumentos de 10x e 40x, conforme ANVISA (2004).

Para a prova do tubo germinativo cada colonia foi semeada em 500 [mu]L de soro humano e incubadas a 37[degrees]C por 3 horas. Esta prova baseia-se na formacao de um filamento fino a partir de um blastoconidio de levedura, onde nao se observa nenhuma zona de constricao, indicando a presenca de Candida albicans (ANVISA, 2004).

A prova da ureia e uma prova bioquimica utilizada para a identificacao de leveduras. De acordo com a ANVISA (2004), a coloracao rosa no meio indica reacao positiva para a enzima urease, que degrada a ureia em amonia alterando o pH do meio para alcalino e invertendo o indicador de pH observado atraves da mudanca de cor.

3 Resultados

Observou-se que houve o crescimento de seis colonias com caracteristicas macroscopicas diferentes apos 24 horas e que no exame direto observaram-se diferentes estruturas microscopicas como pseudohifas, blastoconidios e blastoconidios em brotamento, que quando comparados a atlas micologicos, permitiu identificar, presuntivamente, as especies Saccharomyces cerevisiae, Candida glabrata e Candida krusei, devido a semelhanca das estruturas encontradas com as relatadas nestes atlas. Entretanto, notou-se que todas as colonias apresentaram resultado negativo para a prova da ureia, bem como para o teste do tubo germinativo, excluindo a possibilidade de alguma destas leveduras serem Candida albicans (Quadro 1). Assim, como nao foi possivel encontrar resultados compativeis para todas as chaves de identificacao de leveduras, consideraramse neste estudo, apenas as comparacoes entre atlas micologicos e o exame direto para a identificacao presuntiva das leveduras isoladas dos graos de Kefir.

4 Discussao

Em literatura sao descritas duas diferentes abordagens para o estudo da microflora dos graos de Kefir, as tecnicas dependentes de cultura, que consistem em metodos de cultivos, e as tecnicas independentes de cultura, que consistem, por exemplo, em eletroforese em gel de gradiente desnaturante (LEITE et al., 2012; DERTLI e CON, 2017). Neste estudo a avaliacao da microflora deu-se por intermedio de tecnica dependente de cultura. Foram isoladas seis colonias com caracteristicas macroscopicas e microscopicas diferentes dos graos de Kefir obtidos na regiao de Bauru/SP, identificando, presuntivamente, as especies Saccharomyces cerevisiae, Candida glabrata e Candida krusei.

Em estudo realizado por Magalhaes et al. (2011) com graos de Kefir obtidos na regiao de Lavras-MG, foram isoladas 110 leveduras entre especies de Saccharomyces sp. e de Candida sp., que foram identificadas por provas bioquimicas associadas a testes moleculares. Alem disso, outras especies de leveduras como Kluyveromyces sp., Pichia sp. e Zygosaccharomyces sp. foram reportadas em outras pesquisas com graos de Kefir obtidos em outros paises como Canada e Estados Unidos da America (MIGUEL et al., 2012; AHMED et al., 2015), o que remete ao fato de que graos obtidos em diferentes regioes podem apresentar constituicoes distintas em relacao a populacao microbiana encontrada na matriz de polissacarideos (LEITE et al., 2013) e ainda a necessidade de continuidade do presente estudo com o intuito de identificar biomolecularmente as leveduras isoladas.

Estudos recentes relatam a grande diversidade da comunidade microbiana presente nos graos de Kefir. No entanto, tambem ha estudos em que a diversidade microbiana presente nos graos e baixa, nestes casos sendo descritos como micro-organismos isolados principalmente Saccharomyces spp., Kluyveromyces lactis, Kazachtania spp. e Candida spp. Pressupoe-se que tal discrepancia seja oriunda das tecnicas de caracterizacao microbiana empregadas, sendo as tecnicas moleculares as mais sensiveis e avancadas para a deteccao (LEITE, et al., 2012; DERTLI e CON, 2017; FIORDA et al., 2017).

Saccharomyces em graos de Kefir podem apresentar comportamentos diferentes que sao dependentes do substrato de fermentacao. Quando em matrizes acucaradas tem seu crescimento estimulado pelo alto teor de sacarose do meio, uma vez que sao capazes de converter a sacarose em glicose e frutose. Enquanto nas matrizes lacteas estimulam o crescimento de outras leveduras, pois as especies de Saccharomyces nao apresentam bom desempenho na conversao da lactose do meio em monossacarideos. Apesar disto, S. cerevisiae nao deixa de ser retratada como sendo a principal levedura fermenativa isolada de graos de Kefir, contudo e encontrada em niveis baixos em comparacao a outros micro-organismos (DERTLI e CON, 2017; FIORDA, et al., 2017).

Segundo Ceccato-Antonini e Sudbery (2004), S. cerevisiae sofre dimorfismo a partir de fatores ambientais em que se encontra, podendo adquirir varias formas. Ainda de acordo com os autores, essa capacidade oferece vantagens as celulas, como aumento da absorcao de reagentes e/ou secrecao de produtos, possibilitando sua aplicacao em diferentes setores industriais. Acreditase que este fenomeno tenha sido observado nos exames diretos das colonias que apresentaram diferencas quanto as caracteristicas microscopicas, porem macroscopicamente apontaram ser a mesma levedura.

Outros aspectos importantes com relacao a essas leveduras sao a capacidade de producao de enzimas de interesse biotecnologico, devido a facilidade de manipulacao genetica e a grande diversidade bioquimica que tornam estes micro-organismos uma excelente fonte enzimatica, mostrando potencial em aplicacoes industriais.

As especies de Candida sp. possuem grande importancia clinica, entretanto algumas delas vem mostrando potencial para a producao de farmacos e antifungicos e para a producao de biossurfactantes. Em estudo realizado por Andrade (2015), observou-se que uma linhagem de Candida glabrata, isolada de solo semi-arido, foi capaz de produzir biossurfactante polimerico com alta composicao de lipideos, proteinas e carboidratos, demonstrando a potencialidade desse micro-organismo na aplicacao em processos industriais (ANDRADE et al., 2015).

Com os avancos tecnologicos em engenharia genetica, atualmente e possivel clonar e expressar genes considerados incomuns em hospedeiros heterologos, possibilitando a obtencao de produtos biotecnologicos e, consequentemente, a criacao de organismos geneticamente modificados. Atraves da tecnica de DNA recombinante, Domingues et al. (1999) conseguiu construir estirpes de S. cerevisiae capazes de metabolizar lactose possibilitando sua aplicacao no tratamento do soro de queijo, um substrato toxico para o meio ambiente e amplamente gerado por industrias de laticinios. Alem disso, construiu tambem estirpes de S. cerevisiae excretoras de Pgalactosidase, enzima com importantes caracteristicas para aplicacoes biotecnologicas (DOMINGUES et al., 2002).

5 Conclusao

Os graos de Kefir sao ricos em micro-organismos que podem trazer beneficios a saude e que, quando isolados, podem ainda ser aplicados em processos biotecnologicos contribuindo para os avancos neste setor. Neste contexto, concluimos que foram isoladas leveduras dos generos Saccharomyces sp. e Candida sp. com grande relevancia para processos biotecnologicos.

6 Referencias

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Fernanda Mincev ANTONIASSI, Bruna Leticia MARTINS & Geisiany Maria de QUEIROZ- FERNANDES

Universidade do Sagrado Coracao. Bauru, Sao Paulo, Brasil.

* Autor para correspondencia: geisiany.queiroz@usc.br

DOI: http://dx.doi.org/10.18571/acbm.145a
Quadro 1: Identificacao presuntiva de leveduras isoladas dos graos de
Kefir da regiao de Bauru-SP. * TG = Tubo Germinativo;
** (--) = Negativo.

Identificacao      Caracteristicas     Caracteristicas    TG *   Ureia
Presuntiva          Macroscopicas       Microscopicas

Candida               Pequenas,         Blastoconideos     --     --
glabrata           cremosas, lisas,    e blastoconideos
                  com  bordos lisos     em brotamento
                        e bege

Sacharomyces       Grandes e secas,     Blastoconideos     --     --
cerevisiae          rugosas, com        em brotamento,
                   bordos crenados,     pseudohifas e
                   brancas opacas       blastoconideos
                  com centro branco

Sacharomyces       Grandes e secas,     Pseudohifas e      --     --
cerevisiae           rugosas, com       blastoconideos
                  bordos crenados na
                     cor branca,
                    incolores com
                        centro
                    esbranquicado

Sacharomyces       Grandes e secas,     Pseudohifas e      --     --
cerevisiae           rugosas, com       blastoconideos
                   bordos crenados,
                    brancas opacas

Sacharomyces          Pequenas,         Blastoconideos     --     --
cerevisiae         cremosas, lisas,
                  com bordos lisos e
                       brancas

Candida krusei    Grandes, cremosas,    Blastoconideos     --     --
                  lisas, com bordos      com vacuolos
                   lisos e brancas
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Title Annotation:texto en portugues
Author:Antoniassi, Fernanda Mincev; Martins, Bruna Leticia; de Queiroz-Fernandes, Geisiany Maria
Publication:Acta Biomedica Brasiliensia
Date:Dec 1, 2017
Words:2785
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