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Presencia de un polimorfismo de la CSP-12 relacionado con susceptibilidad a sepsis grave en una muestra de tres poblaciones colombianas.

Presence of a polymorphism of the csp-12 related with susceptibility to severe sepsis in colombian individuals from three different populations

INTRODUCCION

La sepsis es el sindrome de respuesta inflamatoria sistemica que se desarrolla cuando la defensa inicial y apropiada del hospedero a una infeccion se amplifica y no es controlada por los inhibidores naturales; se define como grave cuando se presenta con disfuncion organica, y como choque septico cuando se asocia a hipotension refractaria. (1) A pesar de los avances que se han alcanzado en la comprension molecular de la relacion patogenohospedero y la respuesta inmunologica a la infeccion, la sepsis sigue siendo una de las causas de muerte mas importantes en las unidades de cuidados intensivos (UCI).

Se estima una ocurrencia de 750.000 pacientes por ano en Estados Unidos, con un aumento en su incidencia de 1,5% por ano y una tasa de mortalidad entre 30-70%. (2) Se considera que ademas del tipo de microorganismo y del tamano del inoculo, hay otras caracteristicas propias del paciente, como la edad, la constitucion genetica y el estado inmune y nutricional, que pueden ayudar a determinar el curso y pronostico de esta condicion.

Son multiples los mecanismos activados durante la respuesta inflamatoria que estan implicados en la patogenesis de la enfermedad, entre estos se incluyen celulas efectoras (neutrofilos, monocitos y macrofagos), asi como sus productos: especies reactivas de oxigeno (ROS), metabolitos de nitrogeno (RNS), citocinas, quimiocinas y aumento en la expresion de receptores de superficie que participan activamente en el proceso de diapedesis. (3) Reportes recientes demuestran que individuos con alteraciones en los genes que regulan estos mecanismos de respuesta pueden presentar susceptibilidad o resistencia a enfermedades infecciosas. Entre estas alteraciones se han descrito polimorfismos en los receptores Fc, en los receptores tipo toll (TLR) y en receptores de citoquinas, como TNF e IL-1. (4,5) Estos ultimos determinan las concentraciones de moleculas pro o anti inflamatorias en la sangre y de esta manera pueden hacer que una persona desencadene una marcada respuesta hiper o hipoinflamatoria a la infeccion. (6) Por tanto, el conocimiento de los polimorfismos de los genes involucrados en la respuesta inmune ayudara a comprender mejor la enorme variabilidad de respuesta de los individuos afectados por sepsis y permitira la instauracion de terapias mas eficientes y personalizadas.

Entre los genes descritos como relacionados con la respuesta inmunologica en sepsis se encuentran los que codifican para las caspasas, enzimas claves en la mediacion de los eventos proteoliticos en las cascadas de inflamacion y de muerte celular por apoptosis. (7) Entre este grupo se encuentra la caspasa 12 (csp-12), la cual se relaciona filogeneticamente con las caspasas de maduracion de citocinas (caspasas 1, 4 y 5, conocidas como caspasas inflamatorias). Sin embargo, se ha reportado que en ratones actua como un mediador de apoptosis inducida por estres en el reticulo endoplasmatico (RE). (8) En humanos, Saleh y colaboradores reportaron un polimorfismo de un solo nucleotido (T >C) en el codon 125 del exon 4 del gen de la csp-12, el cual conduce a un cambio de un codon de terminacion por una arginina, originando la sintesis de una proteina truncada (Csp-12S) o una proteina larga (Csp-12L), respectivamente. Ademas, encontraron que aproximadamente el 20% de 776 individuos norteamericanos de descendencia surafricana presentaban dicho polimorfismo, mientras que en poblaciones caucasicas y asiaticas estaba ausente. (9) Sin embargo, estudios recientes acerca de la frecuencia del alelo de la csp-12L en diferentes poblaciones alrededor del mundo mostraron que la csp-12L no se presenta exclusivamente en descendientes afroamericanos, pues tambien se encuentra en poblaciones del norte de Africa (Argelia) y del medio oriente (Israel), asi como en algunas poblaciones del sur (Pakistan) y del este de Asia (Bougainville, Combadie, China, Japon, Nueva Guinea), aunque en una baja frecuencia. (10)

Desde el punto de vista funcional se sugiere que la csp-12L humana tiene un papel en la modulacion de la respuesta a endotoxinas y citocinas (IL-1[beta], TNF-[alfa], IFN-[gamma]), actuando como un regulador dominante-negativo de la activacion de caspasas inflamatorias, potencialmente por antagonismo en los complejos de inflamacion y asociaciones en las vias pro-inflamatorias, constituyendo un factor de riesgo para el desarrollo de la sepsis. (9,11,12) Estos datos son soportados por un estudio hecho en ratones con deleccion en el exon 2 del gen de la csp-12 (csp-12-/-), lo cuales mostraron resistencia a peritonitis y a choque septico; se observo sin embargo que en respuesta a ligandos de receptores tipo Toll y NOD los ratones silvestres mostraban una atenuacion en la produccion de citocinas pro-inflamatorias, como IL-1[beta], IL-18, IFN-[gamma], pero no de IFN-[alfa] y IL-6. Los autores propusieron por tanto una asociacion de la csp-12 con la caspasa-1 que produce inhibicion de su actividad proteasa impidiendo la maduracion de las citocinas proinflamatorias. (13)

Con base en el anterior conocimiento se diseno el presente estudio con el fin de determinar la presencia de los alelos que codifican para las formas larga y corta de la csp-12 en individuos con diagnostico de sepsis, en individuos sanos de una poblacion afroamericana del Choco y en individuos sanos de la ciudad de Medellin.

METODOS

Poblacion de estudio

Se emplearon 128 muestras de ADN genomico de individuos Colombianos discriminados en tres grupos: 81 pacientes con diagnostico de sepsis (Ensayo clinico HETRASE (14)), 23 descendientes afroamericanos del Choco y 24 individuos sanos de Medellin. Las muestras de la poblacion del Choco pertenecen al banco de ADN del grupo de Genetica Molecular (GENMOL) de la Universidad de Antioquia y han sido plenamente definidas como provenientes de descendientes afroamericanos mediante marcadores moleculares especificos. Las muestras de sangre periferica de los pacientes con sepsis fueron obtenidas de individuos que participaron en el proyecto Heparina no Fraccionada Para el Tratamiento de la Sepsis: Un Experimento Clinico Controlado (Estudio HETRASE), en el Hospital Universitario San Vicente de Paul de la ciudad de Medellin. Todos los sujetos, o sus representantes legales, firmaron un consentimiento informado aprobado por el Comite de Etica de la institucion para la participacion del proyecto HETRASE y en estudios ligados a este.

Recoleccion de muestras y extraccion de DNA

Personal de enfermeria entrenado especialmente para el proyecto de HETRASE recolecto 3 ml de sangre venosa periferica en tubos con EDTA (acido etilen-diamino-tetraacetico) en cada uno de los pacientes con diagnostico de sepsis; en los individuos sanos se hizo la misma recoleccion, pero por bacteriologos del grupo de Inmunodeficiencias Primarias. La extraccion de ADN genomico y su purificacion fueron efectuadas mediante un estuche comercial Gentra Systems[R] (Lot No. 8241468 - 8241543) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Deteccion del polimorfismo 125 T [flecha diestra] C en el exon 4 del gen de la csp-12

La deteccion del polimorfismo de 125T [flecha diestra] C se realizo mediante las tecnicas de polimorfismos conformacionales de DNA de cadena sencilla (PCR-SSCP, por sus siglas en ingles) y de polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restriccion (PCR-RFLP, por sus siglas en ingles). En ambos casos se realizo la amplificacion de un fragmento de 314 pb del exon 4 del gen de la csp-12 por PCR (Reaccion en cadena de la polimerasa), utilizando los oligonucleotidos sentido, 5'-GTCATTCTGTGTGTAT TAATTGC-3' y antisentido, 5' -CCTATAATATCATACATCTT GCTC-3') (9), bajo las siguientes condiciones: cinco min a 94[grados]C - 30 ciclos de 94[grados]C - 30", 55[grados]C - 30", 72[grados]C - 30", diez min a 72[grados]C y se conserva a 4[grados]C. La amplificacion de los fragmentos se confirmo en un gel de agarosa al 1,5% tenido con 1ml de bromuro de etidio (BrEt) con una concentracion de 10mg/ml.

PCR-SSCP

Se tomaron 5 [micron]l del producto de la PCR y se realizo una electroforesis en un gel vertical de poliacrilamida al 4% en condiciones no desnaturalizantes. Los productos de la PCR se mezclaron con 1 [micron]l de tampon de carga (Fermentas Lot No. 00029840) y se calentaron a 90[grados]C por dos minutos para desnaturalizar el ADN. Los pozos se cargaron con 4 a 6 [micron]l de la muestra, con los respectivos controles positivos y negativos. La electroforesis se corrio a 180 V durante cinco horas. Una vez finalizada, se procedio a revelar las bandas de ADN por tincion con plata (Marca Analyticals Carlo Erba).

PCR-RFLP

Se realizo de acuerdo con los reportes en la literatura: (9) se tomo la secuencia completa del gen de csp-12 (GenBank No.AP002004 172081 bp DNA linear cromosoma 11q) para establecer la region de interes e identificar una enzima de restriccion que reconociera la variante genica de csp-12 mediante el programa Restriction Mapper (RestrictionMapper - on line restriction mapping the easy way[R]). La enzima seleccionada fue LweI o su isoesquizomero SfaNI, que reconocen la secuencia del polimorfismo para csp-12L (5' ... GCAT C(N)5 [flecha inferior] ..3'). Despues de obtener los fragmentos amplificados de la region del exon 4 de la casp-12, se realizo la digestion con la enzima de restriccion LweI (Fermentas No.ER1621) bajo las siguientes condiciones: 24 h a 37[grados]C, 20 min a 65[grados]C y luego se llevo a 4[grados]C. Los productos se analizaron en geles de agarosa al 2,5%, tenidos con BrEt y en geles de poliacrilamida al 8% tenidos con plata con el fin de evidenciar los diferentes patrones de corte del ADN.

Secuenciacion del AND

La confirmacion de los resultados obtenidos en la genotipificacion por PCR-RFLP de individuos que presentaron el polimorfismo, T125C, se analizaron mediante secuenciamiento de la region amplificada por PCR del exon 4. El secuenciemiento fue realizado por el laboratorio Macrogen Advancing through Genomics (Seul-Corea). Para el analisis de las secuencias se utilizo el programa chromas version 1.45.

Analisis estadistico

En Colombia no existen estudios previos que permitan determinar el tamano de muestra requerido para un analisis estadistico significativo de los polimorfismos en el gen de la csp-12, por tanto, en este estudio se realizo un muestreo por conveniencia. Las frecuencias alelicas y genotipicas se calcularon utilizando el programa Genepop version 3.1. Las pruebas de significancia (chicuadrado ([X.sup.2]) o prueba exacta de Fisher) para las diferencias alelicas y genotipicas se hicieron mediante el programa Epi-Info version 6.

RESULTADOS Y DISCUSION

Con el proposito de identificar el SNP de interes se utilizo inicialmente SSCP, pero no fue posible evidenciar sin embargo diferencias en la electroforesis de los patrones de bandas analizados que permitiera evidenciar la presencia de los genotipos C/T y T/T (resultados no mostrados). Para tratar de suplir esta limitante en la identificacion del SNP se procedio a utilizar el metodo de PCR-RFLP. Para esto, los productos de PCR obtenidos se digirieron con la enzima de restriccion LWeI que permite identificar el cambio de T [flecha diestra] C en el codon 125 del exon 4 del gen csp-12, el cual se asocia con la forma larga de la proteina codificada por este gen. La digestion con esta enzima permitio distinguir los diferentes genotipos: T/T y C/T. En la figura n.o 1 se presenta un gel de poliacrilamida en el que se observan las bandas que se encontraron para cada genotipo.

[FIGURA 1 OMITIR]

En el carril 1 marcador de peso molecular Fermentas, en el carril 2 se encuentra un individuo heterocigoto C/T con un patron de bandas de 314 pb, 189 pb y 125 pb, en el carril 3, 4, 5 y 6 se muestran individuos homocigotos T/T con un patron de bandas de 314 pb.

El genotipo homocigoto T/T se observo con mayor frecuencia en las poblaciones analizadas (tabla n.o 1). El genotipo heterocigotico C/T se encontro solo en siete individuos, discriminados asi: tres individuos del grupo de pacientes con sepsis, tres individuos de la poblacion afro descendiente del Choco, y un sujeto de la poblacion sana de Medellin; el genotipo C/C no se encontro en ninguno de los individuos estudiados (tabla n.o 1). Se puede observar por tanto que en las tres poblaciones existe una presencia elevada del alelo T y una baja del alelo C. Desde el punto de vista de la distribucion de frecuencias genotipicas solo se encontraron diferencias significativas entre el grupo de pacientes y el grupo de afrodescendientes sanos y no se encontraron diferencias entre las frecuencias alelicas de todos los grupos de estudio (tabla n.o 2). Es de notar que debido a la muestra tan pequena de las poblaciones de afroamericanas sanos del choco y de los individuos sanos de Medellin los resultados no permitieron determinar acertadamente las frecuencias de los alelos para la csp-12 en la poblacion colombiana, pero si se observo un comportamiento muy similar al reportado en estudios anteriores (9) en los cuales el analisis de las secuencias de mas de 1100 genomas de DNA de individuos de distintas etnias mostro predominantemente el genotipo T/T, el cual codifica para la forma truncada de la csp-12. En el estudio mencionado, la frecuencia del polimorfismo que resulta en la csp-12L (C/C) fue baja, encontrandose solo en la poblacion de descendientes afroamericanos (T/C=20,3%, T/T=1,3%) y estuvo ausente en las otras poblaciones del estudio (caucasicos, asiaticos). (9)

Para confirmar los resultados obtenidos por el analisis de PCR-RFLP se realizo la secuenciaciondel ADN de dos pacientes con sepsis y en dos individuossanos de la ciudad de Medellin que presentaron el genotipo homocigoto T/T y heterocigoto T/C. Se confirmo la presencia del alelo C en el codon 125 del exon 4 (figura n.o 2), que predice el cambio de un codon de parada por uno que codifica para arginina (figura n.o 3). Estos resultados confirman que la tecnica de PCR-RFLP reportada por primera vez en nuestro estudio puede ser utilizada como herramienta de identificacion del polimorfismo que permite la posible expresion de la csp-12L.

A pesar de tratarse de una muestra pequena, en los datos obtenidos en este estudio fue posible identificar el alelo C125 en nuestra poblacion, el cual corresponde al polimorfismo que se asocia a la expresion de la csp-12L. La forma larga de esta caspasa se considera el genotipo ancestral de acuerdo con el estudio evolutivo realizado por Xue Y, et al, en el 2006, en el que mostro que desde hace unos 100.000 anos, cuando las primeras poblaciones de humanos migraron fuera del Africa, se empezo a presentar una fuerza de seleccion positiva sobre dicho polimorfismo, de manera que permitio el aumento de la frecuencia del alelo T que codifica para la forma corta de la csp-12, dirigiendolo cerca de la fijacion. De acuerdo con esto, este estudio propone que la forma larga de la caspasa tiende a desaparecer. Dicha seleccion ocurrio cuando hubo un incremento del tamano y densidad de la poblacion en Europa y Asia expuesta a enfermedades infecciosas, lo que favorecio la reproduccion de individuos que tenian la forma truncada de la caspasa. (15) En Afrodescendientes, por su parte, el cruce entre distintos grupos raciales introdujo la csp-12S en su perfil genetico, lo que favorecio la perpetuacion de su raza. De acuerdo con lo anterior, y con base en los resultados del presente estudio, podemos observar que en nuestra poblacion el alelo T de la csp-12 aun no se ha fijado completamente puesto que aun existen individuos heterocigotos T/C, pero se evidencia el proceso de seleccion positiva que existe sobre el alelo T por su alta frecuencia en la poblacion estudiada. La presencia del polimorfismo csp-12L en un individuo se ha asociado con una mayor susceptibilidad a desarrollar sepsis grave, (9,13) por lo tanto, y de acuerdo con nuestros resultados se podria sugerir que la poblacion afrocolombiana tendria mayor riesgo de sufrir las complicaciones de la sepsis, en comparacion con las poblaciones mestizas, predisposicion debida a que se ha demostrado que en nuestro medio el mestizaje es producto de una mezcla europea, amerindia y africana , esta ultima en una baja proporcion, situacion especialmente valida para la poblacion de Medellin, la cual presenta un 65% de europeo, 25% amerindio y solo un 10% africano. (16)

[FIGURA 2 OMITIR]

[FIGURA 3 OMITIR]

Como ya se habia mencionado, se ha sugerido que la csp-12L actua como un regulador dominante negativo inhibiendo el efecto de las caspasas proinflamatorias, y por lo tanto, induciendo una disminucion en la produccion de citoquinas como IL-1[beta], IL-18 e INF-[gamma]. Se esperaria entonces una menor severidad en el desarrollo de sepsis en los individuos con atenuacion de produccion de estas citoquinas, y no un estado de gravedad mayor, como lo han mostrado los estudios poblacionales. (9)

Esto podria explicarse por la naturaleza dual de las citoquinas proinflamatorias. Aunque ellas pueden causar danos inflamatorios perjudiciales contra las organismo, la inmunidad innata - la primera respuesta del cuerpo a los agentes infecciosos - induce una produccion temprana de citoquinas para detectar y limitar la infeccion. Por ejemplo, ratones que son deficientes para el receptor tipo Toll 4 (TLR4), el cual detecta lipopolisacaridos de los microorganismos y activa una cascada celular que lleva a la produccion de citoquinas, son altamente resistentes a los efectos sistemicos inducidos por estos productos bacterianos, pero mas susceptible a infecciones causadas por los patogenos que expresan estas moleculas. (12,17) Igualmente, pacientes que reciben terapia anti-TNF para reducir la inflamacion, asi como los individuos que tienen un defecto en la via de senalizacion de los TLR, presentan un mayor riesgo de infeccion. Como consecuencia, se predice que muchos tratamientos desarrollados para la sepsis grave pueden aumentar el riesgo de inmunosupresion e infeccion secundaria. Las estrategias terapeuticas futuras contra la sepsis podrian necesitar equilibrar este riesgo contra el potencial benefico de tratar a corto plazo un exceso de un mediador inflamatorio. Hasta ahora el desarrollo de nuevas estrategias terapeuticas para tratar la sepsis se ha basado en gran parte en la premisa de neutralizar toxinas y mediadores circulantes potencialmente toxicos con el fin de detener o disminuir los efectos de este sindrome. Sin embargo, hasta el momento esta estrategia no ha tenido resultados alentadores puesto que ni los corticosteroides, ni los bloqueadores del lipopolisacarido, ni los bloqueadores del TNF-[alfa] , ni los antagonistas del receptor de la IL-1 han tenido exito en los ensayos clinicos, lo que ha llevado al cuestionamiento de si la muerte en los pacientes con sepsis origina una inflamacion incontrolada. De acuerdo con lo anterior, se ha propuesto como posibles causas de la falla terapeutica la heterogeneidad de los pacientes con sepsis, y se postula que los blancos de la terapia, su tiempo de administracion, las dosis utilizadas y la combinacion de terapias sean erradas. (18)

Poder diferenciar adecuadamente entre los desordenes inmunes y las sub-poblaciones de pacientes que presentan la forma corta o larga de la caspasa-12 adquiriria entonces importancia para instaurar el tratamiento adecuado. De esta manera, se podria proponer que la identificacion del alelo C de la csp-12 en pacientes con sepsis se asocia con un perfil de citoquinas determinado, y en estos pacientes no se esperaria que se derive un beneficio significativo de la estrategia antiinflamatoria que se ha propuesto tradicionalmente. Nuestro estudio reporta entonces por primera vez la presencia del alelo C en la poblacion colombiana y describe una tecnica molecular para su caracterizacion. Estos datos pueden ser la base para realizar estudios de asociacion entre la presencia de este alelo y un patron de citoquinas caracteristico, lo que podria identificar previamente un desorden inmunologico aun no reconocido que confiera susceptibilidad al desarrollo de entidades inflamatorias como la sepsis grave. Se necesitan estudios posteriores con muestreos mas amplios que nos permitan definir la frecuencia del alelo C de la csp-12 en nuestra poblacion y que nos ayuden a comprender si existe una relacion entre los polimorfismos asociados a la csp-12 con algunas caracteristicas clinicas de la sepsis, lo que a su vez permitiria disenar nuevas alternativas terapeuticas dirigidas a pacientes que sean portadores de este polimorfismo.

Recibido: julio 23 de 2009 Aceptado: marzo 16 de 2010

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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Susana Pamela Mejia de Los Rios [1], Pablo Javier Patino Grajales [2], Fabian Alberto Jaimes Barragan [3], Gabriel de Jesus Bedoya [4], Juan Alvaro Lopez Quintero [5], Julian Camilo Arango [6], Laura Yaneth Gamez Diaz [7]

[1] Biologa, Universidad del Valle, Joven Investigador de Colciencias, Grupo de Inmunodeficiencias Primarias, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia, Medellin, Colombia

[2] Profesor Titular, Grupo de Inmunodeficiencias Primarias, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia, Medellin, Colombia

[3] Profesor asociado y Jefe de departamento de Medicina Interna y Grupo academico de Epidemiologia Clinica, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia, Medellin, Colombia

[4] Profesor Titular y Jefe del Grupo de Genetica Molecular, Universidad de Antioquia, Medellin, Colombia

[5] Profesor asociado, Escuela de Microbiologia, Grupo de Microbiologia Molecular, Universidad de Antioquia, Medellin, Colombia

[6] Profesor de ocasional, Escuela de Microbiologia, Grupo de Inmunodeficiencias Primarias, Universidad de Antioquia, Medellin, Colombia

[7] Bacteriologa, Universidad Industrial de Santander, Estudiante de Maestria de Biologia, Universidad de Antioquia, Medellin, Colombia

Correspondencia: Susana Pamela Mejia susana_mejia@hotmail.com
Tabla n.o 1. Genotipos, frecuencias genotipicas y alelicas de un
grupo de pacientes con sepsis de la ciudad de Medellin, de
individuos de una poblacion afrodescendiente sana del Choco y
de grupo de individuos sanos de la ciudad de Medellin

Poblaciones                  Pacientes        Afrodescendientes
                             con sepsis             sanos

No. total de individuos          80                   24
                                                  Genotipos
TT                               77                   21
TC                               3                     3
CC                               0                     0
                                                 Frecuencias
                                                  genotipicas
TT                              0,96                 0,87
TC                              0,03                 0,12
CC                               0,0                 0,0
                                                 Frecuencias
                                                   alelicas
Alelo T                         0,981               0,938
Alelo C                         0,019               0,063

Poblaciones               Individuos sanos
                             de Medellin

No. total de individuos          23

TT                               22
TC                                1
CC                                0

TT                              0,95
TC                              0,04
CC                               0,0

Alelo T                         0,978
Alelo C                         0,022

Tabla n.o 2. Resultados de chi-cuadrado [ji al cuadrado] de las
frecuencias genotipicas y alelicas entre las tres poblaciones de
estudio

                                        Frecuencias Alelicas

Poblaciones                       [ji al cuadrado] df       P-valor

Pacientes con sepsis Vs.
Individuos sanos de Medellin             0,216               0,642

Pacientes con sepsis Vs.
Afrodescendientes sanos                  3,074               0,079

Afrodescendientes sanos Vs.
Individuos sanos de Medellin             0,272               0,601

                                     Frecuencias Genotipicas

Poblaciones                        [ji al cuadrado]df       P-valor

Pacientes con sepsis Vs.
Individuos sanos de Medellin             0,205               0,650

Pacientes con sepsis Vs.
Afrodescendientes sanos                  3,960               0,046

Afrodescendientes sanos Vs.
Individuos sanos de Medellin             1,000               0,316
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Author:Mejia de Los Rios, Susana Pamela; Patino Grajales, Pablo Javier; Jaimes Barragan, Fabian Alberto; Be
Publication:Iatreia
Article Type:Perspectiva general de la enferm
Date:Jun 1, 2010
Words:4698
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