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Polyploidy induction and identification in Hymenaea courbaril L. var. stilbocarpa (Hayne) Lee et Lang./ Inducao e identificacao de poliploidia em Hymenaea courbaril L. var. stilbocarpa (Hayne) Lee et Lang.

INTRODUCAO

O jatoba (Hymenaea courbaril L. var. stilbocarpa (Hayne) Lee et Lang.) e especie climax da familia Fabaceae com elevado potencial de absorcao de carbono, planta semidecidua, que ocorre desde o Mexico, passando pela America Central, ocorrendo com maior frequencia na Amazonia, atingindo o estado de Sao Paulo, Brasil (LOUREIRO, 1979; LORENZI, 2008). Encontrado em matas de terra firme sob solo argiloso, pouco exigente em fertilidade, atinge altura de 15 a 20 metros, com tronco de ate 1 metro de diametro (BARBIERI JUNIOR et al., 2007). Hymenaea coubaril tem grande potencial medicinal, as cascas e folhas sao utilizadas no tratamento de diarreias, colicas intestinais, cistite, tosses, bronquite e asma (AMOROZO, 2002; BEZERRA et al., 2013). E muito apreciados os frutos por varios roedores que auxiliam na dispersao das sementes (ASQUITH et al., 1999; LIMA et al. 2010). A madeira e de densidade 0,96 g x [cm.sup.-3], muito dura ao corte, de media resistencia ao ataque de organismos xilofagos sob condicoes naturais e empregada na construcao civil e naval na forma serrada ou rolica (JENRICH, 1989; LORENZI, 2008). A polpa farinacea dos frutos e utilizada na alimentacao humana (MACEDO, 1992; BEZERRA. et al., 2013) e a resina que exsuda do seu tronco serve para fabricacao de vernizes (CARVALHO, 2003). A especie apresenta ainda grande potencial melifero, paisagistico urbano e na recuperacao de areas degradas (LORENZI, 2008).

Em relacao ao aspecto citogenetico, Hymenaea coubaril apresenta conjunto cromossomico de 2n = 2x = 24 (WATSON; DALLWITZ, 1993). O desenvolvimento de variantes de ploidia, podem apresentar caracteristicas uteis, dobrando o numero de produtos genicos (THAO et al., 2003) que teriam um avanco no mercado florestal como por exemplo aumento do diametro do tronco (MADON et al., 2005).

A inducao da duplicacao cromossomica e de interesse para os programas de melhoramento genetico de plantas, sendo empregada com distintas finalidades para varias especies. Metodologias eficientes de duplicacao cromossomica podem contribuir para acelerar etapas dos programas de melhoramento e viabilizar o emprego de estrategias que nao sao possiveis naturalmente (PEREIRA et al., 2012).

A poliploidizacao pode ser feita utilizando substancias antimitoticas, as quais atuam sobre as fibras do fuso acromatico durante a divisao celular, impedindo sua polimerizacao ou promovendo a sua fragmentacao e, assim, nao permitem a separacao dos cromossomos na anafase. Consequentemente, as celulas iniciam o ciclo celular seguinte com a quantidade de DNA duplicado (PEREIRA et al., 2012).

Agentes quimicos como a colchicina, e os herbicidas oryzalina e trifluralin ou aaatrifluoro-2,6-dinitro-N, Ndipropyl-p-toluidine comercializado com o nome de Treflan[R], sao utilizados na poliploidizacao de plantas. Estes produtos quimicos tem sido aplicados com sucesso em diversas plantas ornamentais (HORN, 2002) para obter novos genotipos com variacoes de tamanho e/ou a cor das flores e folhas (NOTSUKA; TSURU; SHIRAISHI, 2000). O herbicida trifluralina tem demonstrado maior afinidade pela tubulina das fibras do fuso das plantas em relacao as celulas animais (BARTELS; HILTON, 1973).

O herbicida trifluralin forma um complexo herbicida-tubulina que inibe a polimerizacao dos microtubulos, levando a desconfiguracao fisica e perda de funcao. Em consequencia, o fuso mitotico nao ocorre, causando a falta de alinhamento e separacao dos cromossomos durante a mitose. Alem disto, a chamada placa equatorial nao se forma. Os microtubulos tambem possuem funcao na formacao da parede celular. A perda de microtubulos induzida pela presenca de herbicidas pode causar o sintoma de intumescimento de extremidades de raizes, que ocorre nos tecidos meristematicos, uma vez que eles nao se dividem nem conseguem se alongar (SENSEMAN, 2007).

Existem diferentes metodos para a inducao de poliploidia em plantas como o tratamento de sementes (HANZELKA; KOBZA, 2001; QUAN. et al., 2004), botao floral (WU. et al., 2007.), meristema radicular, que consiste na submissao das radiculas as substancias quimicas em diferentes concentracoes e tempos (LAVANIA; SRIVASTAVA, 1991; SAHARKHIZ, 2007), em tecnicas de cultura de tecidos in vitro (ROY et al. 2001).

Nos programas de melhoramento, e importante a determinacao do nivel de ploidia em diferentes estagios de desenvolvimento da planta (CAMPOS et al., 2009). A contagem do numero de cromossomos em celulas mitoticas de meristemas radiculares e um procedimento preciso para determinar o nivel de ploidia, mas e demorado e requer muita experiencia (CARVALHO; SARAIVA, 1993).

Metodos indiretos para determinacao da ploidia podem ser utilizados de forma satisfatoria. Em muitas especies de plantas, nao ha correlacao entre o nivel de ploidia e as caracteristicas citogeneticas tais como tamanho das celulas dos estomatos, porem, na avaliacao de hibridos de Viola x wittrockiana Gams, o tamanho dos estomatos foi util na triagem primaria para verificar o nivel de ploidia (AJALIN et al. 2002).

O presente estudo teve como objetivo induzir e verificar a poliploidia em celulas de meristemas radiculares de Hymenaea courbaril (jatoba) por meio de caracteristicas morfologicas e citologicas.

MATERIAL E METODO

O experimento foi realizado no Laboratorio de Citogenetica e Cultura de Tecidos Vegetais da Universidade do Estado de Mato Grosso Campus de Alta Floresta - MT. As sementes foram adquiridas de viveiro particular no municipio de Alta Floresta - MT, localizado a S -09[degrees]53'54.804" W -57[degrees]55'16.943", obtidas a partir de uma unica matriz, utilizaram-se 250 sementes de Hymenaea courbaril L. varstilbocarpa (Hayne) Lee et Lang para cada tratamento.

As sementes foram escarificadas em lixa no 40 do lado oposto ao hilo e colocadas em um becker com 1 L de agua destilada por um periodo de 24 h para superacao de dormencia. Posteriormente, as sementes foram postas em placas de petri com papel filtro umedecido em agua destilada e acondicionadas em camara de germinacao a 25[degrees]C e fotoperiodo de 12 h por 15 dias. Apos 15 dias, as radiculas atingiram entre 1,0 a 1,5 cm de comprimento. Estas foram imersas em solucao bloqueadora com herbicida antimitotico trifluralin (aaa- trifluoro-2,6-dinitro-N, Ndipropyl-p-toluidine) a concentracao de 3 [micro]M.

Foram realizados os seguintes tratamentos: 14 a 19 h (controle), segundo Barella e Karsburg (2007), Karsburg, Carvalho e Clarindo (2009), Mergonar, Karsburg e Bona (2010) e Lima, Miranda e Karsburg (2012), 24, 48, 72 e 96 h de exposicao ao herbicida a temperatura de 4[degrees]C. Ao termino do tratamento, com a solucao antimitotica foram retirados da solucao os meristemas radiculares de cada tratamento. Em seguida, as radiculas foram seccionadas e lavadas tres vezes durante 10 min e, posteriormente, com solucao fixadora constituida de metanol acido: acetico P.A. na proporcao 3:1 a -4[degrees]C tres vezes durante 10 min, sendo que, apos a ultima lavagem, as radiculas permaneceram sob refrigeracao em um frasco fechado com solucao fixadora. Para cada tratamento foram analisadas 30 celulas em estagio de metafase.

Os meristemas radiculares permaneceram por 12 h na solucao fixadora, antes da digestao enzimatica que consistiu na maceracao com enzima pectinase (Sigma[R]). Para o processo de digestao, as radiculas foram retiradas da solucao fixadora, seccionada em quatro partes e lavadas tres vezes em intervalos de 10 min cada, com agua destilada.

Em seguida, foram transferidas para tubos do tipo Eppendorf[R] com capacidade de 1,5 mL contendo 300 [micro]L de enzima pectinase (Sigma[R]), permanecendo em banho-maria por 2h30min a 34[degrees]C. Concluida a digestao enzimatica, o material foi lavado novamente tres vezes com agua destilada. Depois da ultima lavagem foi vertido fixador completando-se o volume de 5 mL do Eppendorf[R], que, na sequencia, permaneceu no minimo 24 h sob refrigeracao antes da confeccao das laminas, para analise cromossomica do material. Sendo analisadas 30 celulas em estagio de metafase para cada tratamento.

Seguindo-se a metodologia descrita por Carvalho e Saraiva (1993), os meristemas radiculares foram submetidos a dissociacao celular, secagem ao ar e secagem em placa aquecedora a 50[degrees]C. Em seguida, foram coradas com Giemsa a 5% por 3 min, lavadas com agua destilada, secadas ao ar e em placa aquecedora. Foram analisadas 20 laminas de cada tratamento, sendo que, em cada um, foram observadas, em media, 30 celulas.

As sementes dos tratamentos com diferentes tempos de exposicao ao trifluralin foram semeadas em copos plasticos com capacidade para 300 mL contendo substrato composto por casca de cafe (10%), esterco (15%) e solo (75%) para se efetuar a analise do tamanho dos estomatos. Para a visualizacao dos estomatos foi utilizada a tecnica de impressao epidermica da folha do lado adaxial, colando-se a folha na lamina com adesivo instantaneo universal ester de cianoacrilato (SuperBonder[R]) em uma lamina histologica (SEGATTO et al., 2004). Apos a secagem, retirou-se, rapidamente, a folha, deixando-se somente a impressao da epiderme. Em cada tratamento foram medidos (em mm), entre uma crista e outra, 200 estomatos empregando-se o programa Corel Photo Paint X3.

As imagens (de metafases e estomatos) de interesse foram fotografadas com o uso de um microscopio fotomico binocular (Leica ICC 50) acoplado a um computador com software LAZ EZ V1. 7.0.

As medias dos tamanhos dos estomatos avaliados em cada tratamento foram submetidas a analise de variancia e, para as causas de variacao significativas, utilizou-se o teste Tukey ao nivel de 5% de probabilidade empregando-se o programa Sisvar[R] (FERREIRA, 2011).

RESULTADOS E DISCUSSAO

Com a utilizacao do herbicida trifluralin 3 [micro]M em meristemas radiculares de Hymenaea courbaril durante 24, 48 e 72 h, foram observadas diferencas quanto a compactacao dos cromossomos, sem alteracao do conjunto genomico original 2n = 2x = 24 cromossomos (Figuras 1B, 1C e 1D). O uso do herbicida trifluralin inibe a formacao das fibras do fuso mitotico que sao constituidas pelas proteinas tubulinas, quando os meristemas radiculares sao expostos a concentracoes baixas (3 a 6 [micro]M) por diferentes periodos, dependendo da duracao do ciclo celular de cada especie, sao obtidos cromossomos com maior ou menor condensacao da cromatina (KARSBURG et al., 2009). Isso permite obter cromossomos metafasicos bem distribuidos na placa equatorial.

Os meristemas radiculares expostos a 96 h no herbicida trifluralin 3 [micro]M apresentaram 2n = 4x = 48 cromossomos (Figura 1E), os quais se apresentaram bem condensados. A duplicacao dos cromossomos, provavelmente, ocorreu pela nao disjuncao dos cromossomos durante a divisao, o que pode estar associado a nao formacao do fuso mitotico e a duplicacao do material genetico (GUPTA; TSUCHIYA, 1991; OTTO, 2007). Petersen, Hagberg e Kristiansen (2003) e Madon et al. (2005) verificaram que a colchicina foi mais eficiente que herbicidas na inducao de duplicacao cromossomica em Miscanthus sinensis e Elaeis guineensis respectivamente. Contudo, Hansen e Andersen (1996) que conduziram experimento comparando os efeitos da colchicina e mais tres herbicidas, entre eles o trifluralin, utilizando Brassica napus, constataram que todos os tratamentos eram semelhantes a colchicina, tanto na regeneracao de embrioes, quanto na poliploidizacao dos cromossomos. Os embrioes tratados com trifluralin a 30 [micro]M por 12 horas atingiram 65% de regeneracao de poliploidizacao, com a vantagem do trifluralin ser menos toxico que a colchicina.

Um comportamento comum aos poliploides estabelecidos e sua diploidizacao, ou seja, apesar de terem mais de dois genomas, iguais ou semelhantes, a tendencia e que, ao longo do tempo, passem a comportar-se como diploides. Isto tanto ao nivel da heranca genica, que tende a passar de multissomica a dissomica, como ao nivel do pareamento cromossomico na meiose: enquanto que, em poliploides jovens, e comum a formacao de autopoliploides, e a regularizacao do pareamento, com formacao exclusiva, ou quase, de bivalentes. O genoma do poliploide e reestruturado e passa a comportar-se como diploide (RAMSEY; SCHEMSKE, 2002).

Pela analise do tamanho estomatico obtido dos diferentes tratamentos (Figuras 1G, 1H, 1I e 1J), o comprimento entre uma crista a outra variou de forma crescente conforme o tempo de exposicao dos meristemas radiculares, diferenciando significativamente o tratamento de 96 h de exposicao em relacao aos demais com tamanho medio do estomato de 0,215 mm (Tabela 1). Organismos que apresentam variacao quanto a ploidia normalmente apresentam ainda variacao quanto ao tamanho de diferentes estruturas, frutos, folhas, quantidade de determinadas substancias, estomatos e numero de cloroplastos presentes nos estomatos (SINGH, 1993). A analise atraves dos estomatos nem sempre pode ser eficiente, ja que a folha esta em constante modificacao em resposta as alteracoes ambientais, e o resultado em sua pesquisa mostrou que o tamanho dos estomatos de Dendrobium nobile e inversamente proporcional ao nivel de ploidia (VICHIATO et al., 2006). O tamanho dos estomatos em Hemarthria altissima apresentou diferenciacao em relacao a ploidia (TEDESCO et al., 1999).

O aumento das dimensoes do estomato das plantas tratadas por 96 h no herbicida trifluralin, provavelmente ocorreu porque as celulas com um maior complemento de cromossomos cresceram para manter uma relacao constante de citoplasma de volume nuclear, e expressam maior quantidade de proteinas com a presenca de mais genes.

CONCLUSOES

Com base nesses resultados preliminares conclui-se que a concentracao de 3 [micro]M de trifluralin por 96 h a 4[degrees]C foi eficiente na inducao da poliploidia, entretanto, outros produtos quimicos, cujo efeito e semelhante ao do trifluralin, devem ser testados, como a orizalina, APM (amiprofosmetil) e colchicina, visando a obtencao de um numero maior de plantulas. Porem, por meio dos estudos citogeneticos classicos mesmo que eficientes, o trabalho se torna bastante laborioso, sugerindo estudos com uso da citometria de fluxo pela agilidade das avaliacoes dentro de programas de melhoramentos. Avaliacoes em campo dos individuos poliploidizados para verificacao de quais estruturas apresentam modificacoes, informacao que para especies florestais pode depender de longos prazos, pelo seu ciclo vegetativo.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a FAPEMAT pelo suporte financeiro.

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Diego Antonio Ottonelli Bona (1) Isane Vera Karsburg (2) Ricardo Gallo (3)

(1) Engenheiro Florestal, Mestre em Engenharia Florestal, Universidade Federal do Espirito Santo, Rua Nicanor Santos, Centro, CEP 29550-000, Jeronimo Monteiro (ES), Brasil. diego_ottonelli@hotmail.com

(2) Biologa, Dra., Professora Adjunta do Departamento de Ciencias Biologicas, Universidade do Estado de Mato Grosso, Perimetral Rogerio Silva, 4930, Bairro Flamboyant, Caixa Postal 324, CEP 78580-000, Alta Floresta (MT), Brasil. isane9@yahoo.com.br

(3) Engenheiro Florestal, Doutorando em Engenharia Florestal, Universidade Federal de Vicosa, Av. Peter Henry Holfs, s/n, Campus Universitario, CEP 36570-000, Vicosa (MG), Brasil. etrom_gallo@hotmail.com

Recebido para publicacao em 25/03/2013 e aceito em 6/04/2015

Caption: FIGURE 1: Hymenaea coubaril metaphase cells and stomata obtained from different exposure times in 3 [micro]M trifluralin herbicide at 4[degrees]C. Metaphase with 2n = 2 x = 24 chromosomes exposed to: A) control, B) 24 h, C) 48 h, D) 72 h, E) Metaphase with 2n = 4 x = 48 chromosomes exposed to 96 h. Stomata of different exposure times: F) control, G) 24 h, H) 48 h, 72 h, J) 96 h. Bar = 10 [micro]m.

FIGURA 1: Celulas metafasicas e estomatos de Hymenaea coubaril obtidos a partir de tratamentos que consistiram de diferentes tempos de exposicao no herbicida trifluralin com 3 [micro]M a temperatura de 4[degrees]C. Metafases com 2n = 2x = 24 cromossomos expostos a: A) controle, B) 24 h C) 48 h, D) 72 h, E) Metafase com 2n = 4x = 48 cromossomos com exposicao de 96 h. Estomatos de diferentes tempos de exposicao, F) controle, G) 24 h, H) 48 h, I) 72 h. J) 96 h. Barra = 10 [micro]m.
TABLE 1: Hymenaea coubaril stomata size mean values: control, 24, 48,
72 and 96 h in 3 [micro]M trifluralin herbicide.

TABELA 1: Valores medios do tamanho dos estomatos de Hymenaea
coubaril: controle, 24, 48, 72 e 96 h de exposicao no herbicida
trifluralin a 3 [micro]M de concentracao.

Tratamentos       Total de estomatos    Media dos estomatos (mm)
                      analisados

Controle (14 h)           200                    0,165b
24 h                      200                    0,174b
48 h                      200                    0,180b
72 h                      200                    0,187b
96 h                      200                    0,215a
Media                                            0,185
CV (%)                                            3,76

Em que: Medias seguidas pela mesma letra minuscula na coluna nao
diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
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Title Annotation:texto en portugues/ingles
Author:Bona, Diego Antonio Ottonelli; Karsburg, Isane Vera; Gallo, Ricardo
Publication:Ciencia Florestal
Date:Oct 1, 2016
Words:3738
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