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Polimorfismos intragenicos de los genes de los factores VIII y IX y su utilidad en el diagnostico indirecto de portadoras de Hemofilias A y B.

Intragenic polymorphisms of factor VIII and IX genes and their utility in the indirect diagnosis of carriers of Haemophilias A and B.

INTRODUCCION

Las Hemofilias A y B (HA y HB) son enfermedades hereditarias severas, cuyo mecanismo de transmision es recesivo ligado al X, con una incidencia de 1 por cada 5.000 a 10.000 varones nacidos vivos (1-3) y de 1 por cada 30.000 a 40.000 respectivamente (4, 5). Ambas entidades se deben a defectos en los genes que codifican para el FACTOR VIII (FVIII) o FACTOR IX (FIX), proteinas que intervienen en la serie de reacciones que conducen a la coagulacion sanguinea. En ambas enfermedades la manifestacion clinica principal es el sangrado, cuya localizacion en el caso de frecuencia y en la severidad dependera de la actividad residual del FVIII y del FIX. Por tratarse de un trastorno ligado al cromosoma X, la afectacion es generalmente en varones, aunque se han descrito algunos casos de mujeres afectadas (6-8).

El gen que codifica al FVIII se localiza en el brazo largo del cromosoma X en la region Xq28, aproximadamente a un Megabase del telomero (9); tiene una longitud de 186 Kilobases (Kb), distribuidas en 26 exones y 25 intrones; ocupa el 0,1% del cromosoma X (10) y su producto es un peptido de 2.332 aminoacidos que representan 9 Kb del total del tamano del transcripto. El resto, lo constituyen 177 Kb representadas por 25 intrones, 6 de ellos miden mas de 14 Kb y algunos son de hasta 32 Kb. Los exones 14 y 26 contienen 3.106 y 1.958 pares de bases (pb) respectivamente, el resto de los exones varian en longitud entre 69 y 262 pb (11, 12). El gen que codifica para el FIX esta localizado en el brazo largo del cromosoma X, en posicion proximal al sitio fragil (gen FMR1), ubicado en la banda Xq 27,3. Este gen esta proximo al gen del FVIII, al del Daltonismo y al de la Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa. Posee una longitud de 34 Kb y esta compuesto por 8 exones capaces de codificar diferentes dominios en la proteina del FIX y de 7 intrones (13, 14).

Se ha encontrado una amplia gama de eventos mutacionales en ambos genes: deleciones, mutaciones puntuales, inserciones, inversiones, etc. (15), incluso, cerca del 50% de los afectados de HA con fenotipo severo, presenta grandes inversiones en su secuencias, que pueden ser de tipo proximal o distal, dependiendo del punto de ruptura entre la secuencia F8A, ubicada en el intron 22 del gen y las ubicadas en el extremo proximal o distal al locus Xq28 (16). Cabe destacar ademas que para el caso de HB, algunos pacientes afectados presentan grandes deleciones que involucran el gen completo (8).

Debido a la gran heterogeneidad mutacional, la deteccion directa del defecto causante de ambos tipos de hemofilias, es complicada ademas de costosa, lo que dificulta su aplicacion en la identificacion de mujeres portadoras del gen defectuoso. En vista de ello, se han desarrollado estrategias que permiten la asignacion del estado portador de la enfermedad. Una de ellas se basa en el estudio de la segregacion familiar de polimorfismos presentes en el ADN, independientemente de la naturaleza de la mutacion responsable de la enfermedad y el objetivo de su uso, es identificar al cromosoma X portador del gen defectuoso, apoyados en el estudio de la genealogia. De esta manera, es posible establecer el diagnostico indirecto molecular tanto de portadoras como del estado de afectacion de nuevos casos familiares de HA y HB.

El objetivo del trabajo es identificar mujeres portadoras a traves del analisis indirecto del polimorfismos en los genes que codifican para el FVIII y el FIX en familias segregantes de HA y HB residentes en el estado Zulia, Venezuela.

PACIENTES Y METODOS

Se estudiaron 29 y 8 familias residentes del estado Zulia, Venezuela, con antecedentes de HA y HB respectivamente, se tomo en cuenta como criterio de inclusion, que cada familia presentara mas de un miembro afectado de HA o HB segun el caso. El diagnostico de HA y HB en los individuos afectados fue realizado previamente por un hematologo. Las hermanas y tias maternas de los afectados conformaron grupos de 79 y 27 probables portadoras de HA y HB respectivamente. Se incluyeron en el estudio 84 mujeres no relacionadas geneticamente y sin antecedentes de HA ni HB, como grupo control para las estimaciones de frecuencias alelicas.

Para la realizacion de este trabajo, se conto con el consentimiento informado de las familias y grupos estudiados asi como la aprobacion del Comite de Bioetica de la institucion.

Para todas las muestras, se aislo ADN a partir de 200 [micron]L de sangre periferica por la tecnica CTAB/DTAB (17). Para HA, se caracterizaron tres polimorfismos intragenicos del gen del FVIII: a) a partir de 500 ng de ADN, se amplifico un fragmento de 142 pb ubicado en el intron 18 el cual contiene un polimorfismo de restriccion para la enzima BclI (rs4898352), con alelos de 142 y 99+43 pb (18, 19) y se caracterizaron los fragmentos mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) al 12% en buffer TBE 1X tenido con bromuro de etidio y visualido con luz UV; b) a partir de 250 ng de ADN, se amplificaron simultaneamente dos polimorfismos de longitud ubicados en los intrones 13 y 22 del gen, conocidos como (CA)n y (GT)n(AG)n respectivamente (20-23), pero se introdujeron modificaciones en el programa original de la PCR: 94[grados]C, por 5 minutos; 10 ciclos de 94[grados]C, 52[grados]C y 72[grados]C por un minuto cada paso y despues 25 ciclos de 90[grados]C, 53[grados]C y 72[grados]C por 1 minuto cada paso y una extension final de 5 minutos a 72[grados]C; la caracterizacion de fragmentos amplificados se realizo a traves de PAGE al 10% en buffer TBE 1X y la visualizacion se hizo con tincion argentica como describen Santos y col. (24). Para conocer el numero de alelos diferentes de estos polimorfsmos de longitud, por cada gel se seleccionaron los alelos de distintos tamanos y posteriormente se aplicaron estos productos reunidos todos en un mismo gel y de acuerdo a la posicion de las bandas observadas, se nomino el alelo No 1 ([A.sub.1)] como el de menor tamano para ambos polimorfismos, el alelo No 6 ([A.sub.6)] y alelo No 5 ([A.sub.5)] para los alelos de mayor tamano para el intron 13 y 22 respectivamente.

Para los polimorfismos de HB, se amplificaron cuatro marcadores intragenicos del gen del FIX: a) el polimorfismo HinfI, ubicado en el intron 1 del gen que amplifica directamente fragmentos de 325 y 375 pb (4, 25); b) el polimorfismo XMnI (rs438601), ubicado en el intron 3 del gen, generando fragmentos de 1.176 y 858+318 pb (5); c) el polimorfismo TaqI (rs398101), ubicado en el intron 4 del gen, el cual consiste en un fragmento amplificado de 343 pb con un sitio de restriccion para la enzima TaqI que genera fragmentos de 343 y 171 + 172 pb (26); d) el polimorfismo HhaI (rs3117459), ubicado en el extremo 3' no traducible del gen, el cual consiste en amplificar un fragmento de 230 pb y contiene un sitio de restriccion para la enzima HhaI, generando productos de 230 y 150+80 pb (5). La caracterizacion genotipica de los 4 polimorfismos intragenicos para HB se realizo a traves de electroforesis en geles de agarosa al 2%, buffer TBE 1X tenidos con bromuro de etidio y visualizada las bandas con exposicion a luz UV.

RESULTADOS

La caracterizacion de los polimorfismos analizados, tres para HA y cuatro para HB, permitio crear y asignar haplotipos a cada miembro de los grupos de familias. Los resultados nos indican que fue posible hacer diagnostico o descartar el estado portador para HA en el 93% de las familias (27/29) y en el 100% para HB (8/8). Se logro identificar a 75 mujeres del grupo de las 79 que requerian el estudio para HA, lo cual representa el 95% de los casos, de las cuales, 46 resultaron ser portadoras del gen defectuoso y 29 fueron identificadas como no portadoras. Con respecto a HB, se determino el diagnostico en todas las mujeres que necesitaban el estudio, identificando a 15 de ellas como portadoras de HB. Los resultados generales se indican en la Tabla I. En un grupo de cuatro mujeres no fue posible determinar ni descartar el diagnostico de portadora HA, ya que las madres de los afectados resultaron ser homocigotas para los tres polimorfismos analizados en el gen del FVIII.

La posibilidad de que una familia sea informativa dependera que la madre del afectado sea heterocigota para al menos un polimorfismo, resultando tener haplotipos distintos en cada cromosoma X, que al comparar con su hijo afectado, se podra identificar al cromosoma X portador del gen defectuoso, y por consiguiente, se observara si esta o no presente en las probables portadoras. Por tanto, la informatividad en terminos de utilidad diagnostica en cada polimorfismo se puede determinar estimando la probabilidad de encontrar mujeres heterocigotas en la muestra de la poblacion general analizada. Esta probabilidad se estimo en base a la muestra de 84 mujeres no relacionadas geneticamente para cada polimorfismo y cuyas frecuencias alelicas y valores de utilidad diagnostica se presentan en la Tabla II.

La informatividad en los polimorfismos de restriccion se estimo segun la regla del binomio cuadrado: [[(p + q).sup.2]:[p.sup.2] + 2pq + [q.sup.2] (27), sustituyendo en 2pq las frecuencias de cada alelo para obtener el nivel de heterocigosis esperada.

Para los polimorfismos con sistemas multialelicos, como ocurre en los (CA)n y (GT)n(AG)n, el grado de heterocigosis esperada se estimo con la formula: 1 - ([p.sup.2] + [q.sup.2] + [r.sup.2]), segun Yip y col. (23).

En las Figs. 1 y 2, se muestran genealogias con antecedentes de HA y HB respectivamente, y donde se indican los haplotipos asignados a cada miembro del grupo familiar y se identifican aquellas que resultaron portadoras o no del gen defectuoso.

DISCUSION

El desarrollo que en las ultimas decadas se ha evidenciado en el campo de la Biologia Molecular ha permitido el analisis detallado de genes humanos y generan conocimientos sobre los fenomenos moleculares implicados en la genesis de las enfermedades. En el caso de HA y HB, estos adelantos han permitido analizar la estructura del FVIII y FIX respectivamente, logrando en primer termino determinar los defectos moleculares implicados y posteriormente identificar en estos genes regiones polimorficas, de considerable valor para el diagnostico de mujeres portadoras y en algunos casos para el diagnostico prenatal (15, 28-31), enriqueciendo de esta manera la practica del asesoramiento genetico a familias con antecedentes de HA y HB.

[FIGURA 1 OMITIR]

La deteccion oportuna de mujeres portadoras es de suma importancia en Genetica Medica; la estrategia tradicional para detectar portadoras a traves de pruebas de coagulacion, resulta solo util en familias con casos esporadicos de afectados de HA y HB, ademas es un sistema poco adecuado, la reproducibilidad de sus resultados se ve afectada o dependera de fluctuaciones en la actividad del factor VIII, de la relacion FVIII/FvW en el caso de HA, del factor IX, de la activacion de la cascada de coagulacion durante la manipulacion de la muestra, y de una serie de factores como edad, ciclo menstrual, la practica de ejercicios, procesos inflamatorios, embarazo, fiebre, diabetes, trastornos de la glandula tiroides y cirugias, ademas el fenomeno de inactivacion del cromosoma X origina un amplio espectro de valores, los cuales se consideran falsamente normales (22, 32-34).

[FIGURA 2 OMITIR]

Los polimorfismos intragenicos representan marcadores de alto valor para los estudios de ligamiento. El porcentaje de recombinacion entre los marcadores intragenicos y el sitio de mutacion es aproximadamente de 0,01% (9, 28, 35, 36). La posibilidad de proporcionar un diagnostico erroneo con el uso de los polimorfismos en el ADN queda limitada a la probabilidad de recombinacion entre el sitio polimorfico asociado al gen anormal y el sitio de la mutacion, evento poco probable dado que los marcadores analizados estan ubicados en el interior del gen sujeto a estudio. La principal desventaja del analisis indirecto a traves de polimorfismos en la identification de mujeres portadoras, es en primer lugar, su incompetencia para casos esporadicos, donde habria que detectar el tipo de mutacion presente en el paciente afectado y desarrollar estrategias diagnosticas para las potenciales portadoras del grupo familiar; otra desventaja es la necesidad de analizar miembros clave, que pueden no estar disponibles para el estudio.

Por otra parte, debido a la amplia variedad con respecto al tipo, numero y ubicacion de mutaciones reportadas en ambos genes (37-41), se hace necesario implementar estrategias practicas para el diagnostico molecular de portadoras de HA y HB. Excepto los casos esporadicos, una de las estrategias es la deteccion indirecta a traves del analisis de polimorfismos en el ADN. En HA, el polimorfismo intragenico BclI, ha sido uno de los mas utilizados para identificar portadoras (42, 43), su utilidad diagnostica se ha determinado en distintas poblaciones, encontrandose alrededor del 42% (15, 19, 44, 45). En esta investigacion, la utilidad esperada se estimo en 44% y la observada en 43% y en combinacion con el resto de los polimorfismos se mostro en un 95%. Al analizar solo el polimorfismo BclI, en 59% de las familias (17/29) habia sido posible identificar las portadoras de HA, mientras que con la incorporacion del analisis de los intrones 13 y 22 del gen, el poder diagnostico se vio incrementado por la creacion de los haplotipos, logrando establecer el diagnostico en el 93% de las familias (27/29).

La utilidad diagnostica esperada para el polimorfismo (CA)n se estimo en 80% y para el (GT)n(AG)n en 73%, mientras que la observada fue 81% y 75% respectivamente. En la poblacion caucasica la informatividad resulto mas util que en la presente muestra, 91% para el marcador (CA)n y menos util con 33% para el polimorfismo (GT)n(AG)n (20-22). En poblaciones de China y de Turquia se han senalado valores alrededor de 53% para el (CA)n y de 50% para el (GT)n(AG)n (23, 46).

Con respecto a la identificacion de portadoras de HB a traves de cuatro polimorfismos intragenicos, se inicio el analisis con el polimorfismo HinfI, el cual mostro un nivel de heterocigosis esperado de 46% y observado de 43%, cifra mayor a las reportadas en grupos caucasicos con 36% (4). El polimorfismo XmnI, resulto poco util en nuestro estudio, con un 21% y 23% de heterocigosis esperada y observada respectivamente, cifras inferiores al comparar con poblacion caucasica que mostro niveles de 41% (4). En cuanto al polimorfismo TaqI, la utilidad diagnostica esperada se estimo en 49% y observada en 45%, siendo esta misma informatividad indicada para poblacion caucasica (4). El marcador HhaI fue el ultimo polimorfismo investigado y con su incorporacion a la bateria de polimorfismos para HB, fue posible completar la lista de mujeres que requerian el estudio para su identificacion; la heterocigosis esperada y observada se estimo en 50%, tal como se senala para poblaciones caucasicas (4, 25, 47).

Los resultados en ambos genes constituyen los primeros datos haplotipicos investigados en poblacion venezolana. En este trabajo, el analisis permitio no solo identificar a mujeres libres de portar el gen mutado de HA y HB, sino que 93% de las mujeres identificadas como portadoras de HA y HB (43/46) y (14/15) respectivamente, resulto tener genotipo de heterocigota, por tanto estas mujeres son informativas, esto significa una importante condicion para el asesoramiento genetico efectivo a grupos de mujeres con riesgo de trasmitir el gen defectuoso a su descendencia y hace posible la aplicacion del diagnostico prenatal para los nuevos casos de cada familia, independientemente de la naturaleza de la mutacion que se esta segregando en el grupo familiar.

Ante la limitante de no poder identificar en algunas mujeres el estado portador de HA por la no informatividad en los marcadores analizados, se hace necesario incorporar nuevos marcadores a este estudio, con la finalidad de identificar el cromosoma X ligado a la HA en todas las mujeres de las familias analizadas.

Recibido: 17-05-2009. Aceptado: 08-04-2010.

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Lisbeth Borjas [1], William Zabala [1], Lennie Pineda [1], Tatiana Pardo [1], Erika Fernandez [2], Mariana Zambrano [3], Jose M. Quintero [1], Melvis Arteaga-Vizcaino [2], Alisandra Morales-Machin [1] y Wilmer Delgado [1].

[1] Laboratorio de Genetica Molecular, Unidad de Genetica, [2] Instituto de Investigaciones Clinicas "Dr. Americo Negrette" y [3] Catedra de Bioquimica Clinica, Facultad de Medicina, Universidad del Zulia. Maracaibo, Venzuela.

Autor de correspondencia: Lisbeth Borjas. Unidad de Genetica Medica, Facultad de Medicina, Universidad del Zulia. Maracaibo, Venezuela. Apartado Postal: 15047. Fax: 58-261-7533822. Correo electronico: lisbethborjas@gmail.com.
TABLA I
DISTRIBUCION DE LAS PACIENTES ESTUDIADAS PARA IDENTIFICAR EL ESTADO
DE PORTADORAS DE HA Y HB

Parametro                               Hemofilia A   Hemofilia B

Afectados                                   46            11
Portadoras obligadas                        41            10
Requieren diagnostico *                     79            27
Portadoras *                                46            15
No portadoras *                             29            12
Sin conclusion *                             4            --
Portadora informativa*                      43            15
Madres de afectados no informativas *        2            --

* Diagnosticadas en el presente trabajo.

TABLA II
FRECUENCIAS ALELICAS Y UTILIDAD DIAGNOSTICA EN LA MUESTRA CONTROL
ANALIZADA, N:84 MUJERES

                                                  Utilidad
              Polimorfismos     Frecuencia       diagnostica
Gen             Ubicacion         alelica            (%)

FACTOR VIII       Bcl I         142 pb: 0,32         44
                Intron 18      99+43 pb: 0,68

                  (CA)n       [A.sub.1]: 0,09        80
                Intron 13     [A.sub.2]: 0,18
                              [A.sub.3]: 0,32
                              [A.sub.4]: 0,27
                              [A.sub.5]: 0,05
                              [A.sub.6]: 0,09

               (GT)n(AG)n     [A.sub.1] : 0,05       73
                Intron 22     [A.sub.2] : 0,05
                              [A.sub.3] : 0,27
                              [A.sub.4] : 0,36
                              [A.sub.5] : 0.27

FACTOR IX         Hinf I        325 pb: 0,65         46
                Intron 1        375 pb: 0,35

                  Xmn I        1.176 pb; 0,88        21
                Intron 3      858+318 pb: 0,12

                  Taq I         343 pb: 0,48         49
                Intron 4      171+172 pb: 0,52

                  Hha I         230 pb: 0,54         50
               Extremo 3'     150+80 pb: 0,46

A: Alelos; pb: pares de base.
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Author:Borjas, Lisbeth; Zabala, William; Pineda, Lennie; Pardo, Tatiana; Fernandez, Erika; Zambrano, Marian
Publication:Investigacion Clinica
Date:Sep 1, 2010
Words:4709
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