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Plantas medicinales: efecto antibacteriano in vitro de Plantago major L, Erythroxylum novogranatense, Plowman var truxillense y Camellia sinensis sobre bacterias de importancia estomatologica.

Medicinal plants: Antibacterial effect in vitro de Plantago major L, Erythroxylum novogranatense, Plowman var truxillense and Camellia sinensis on stomatologic importance bacteria

Introduccion

En muchas ocasiones para curar determinadas patologias que afectan la salud se ha tenido que recurrir a ciertos procedimientos terapeuticos que se apartan de la medicina tradicional. En la actualidad, esta alternativa medica experimenta un auge cada vez mas creciente, sin embargo estas no son absolutamente nuevas, sino que casi en su totalidad son los resultados de tecnicas y procedimientos usados tradicionalmente.

El uso de las plantas con fines terapeuticos es de gran utilidad, ya que de ellas son obtenidas innumerables sustancias quimicas. La investigacion, en este sentido, brinda la oportunidad de encontrar nuevos principios activos desde el punto de vista farmacologico, a partir de una materia prima mas economica y natural.

Para la presente investigacion se seleccionaron a tres plantas medicinales usadas en medicina tradicional que se cultivan o crecen en el Peru debido a que existen numerosos antecedentes de sus propiedades antibacterianas sobre diversas bacterias patogenas, el objetivo fue el comparar la actividad antibacteriana de los extractos hidroalcoholicos obtenidos de tres plantas medicinales: Plantago major L. (llanten), Erythroxylum novogranatense (Rusby) Plowman var. truxillense (coca Trujillo) y Camellia sinensis (te verde) en concentraciones de 25 [micron]g/mL y 50 [micron]g/ mL sobre cinco bacterias patogenas orales de importancia estomatologica presentes en caries dental y enfermedad periodontal: Streptococcus mutans, Lactobacillus acidophilus, Actinomyces viscosus, Prevotella melaninogenica y Fusobacterium nucleatum; mediante el metodo de Difusion en Agar con el uso de discos. Estas bacterias se van a encontrar en la placa dental y aunque existen diversos metodos utilizados para el control de la placa ninguno ha demostrado--ser totalmente eficaz. Cada vez esta mas extendido el denominado control quimico de la placa de manera complementaria a un control mecanico ineficaz, para lo cual se utilizan antisepticos bucodentales; sin embargo existen efectos secundarios no deseados como la pigmentacion. Por eso al demostrar la actividad antibacteriana de sustancias de origen natural se estarian planteando alternativas economicas y de mayor aceptacion por la poblacion peruana.

Metodologia

1. Obtencion de las plantas medicinales

Las hojas de las plantas provienen de diversas zonas del territorio peruano. Las hojas frescas de Plantago major L. se recolectaron en el valle de Carapongo a la altura del km 17 de la Carretera Central, Chosica, Lima, Peru; se lavaron y se pusieron a secar bajo sombra durante dos dias; la hojas secas de Erythroxylum novogranatense (Rusby) Plowman var. truxillense se obtuvieron en el caserio de Huayobamba, Huaranchal, Provincia de Otuzco, La Libertad, Peru. Las hojas secas de Camellia sinensis fueron adquiridas en forma del producto comercial Te verde "Schagreen" (Alprosur), tipo granel por l00 g que contiene 100 % hojas de te verde, las cuales provienen del valle Yanayaco Chico s/n, Huayopata, La Convencion, Cusco, Peru.

2. Obtencion de principios activos totales

Para la obtencion de los principios activos totales se empleo la tecnica de maceracion alcoholica. (1,2,3,4) El procedimiento fue el siguiente: en un envase esteril de vidrio ambar de 4 litros de capacidad se coloco en su interior V Kg. de hojas secadas en estufa por 24 h a 60[grados]C, de la planta seleccionada previamente molida. Luego se anadio alcohol etilico rectificado de 70 % hasta que cubra por completo el contenido de las hojas molidas. Este frasco se agito tres veces por dia; el tiempo de maceracion fue por 7 dias.

Despues de los 7 dias de maceracion se filtro por una membrana esteril. Posteriormente se procedio a la evaporacion del contenido alcoholico de lo filtrado con la ayuda del Buche Rotavapor V-805 a 270 mbar de presion, 40[grados]C de temperatura y a una rotacion de 100 rpm, obteniendose, de esta manera los principios activos totales.

3. Analisis Fitoquimico (5,6)

El analisis fitoquimico de los extractos hidroalcoholicos de principios activos totales de las plantas medicinales, comprendio la identificacion de los grupos funcionales que con mas frecuencia se encuentran en estas plantas, mediante pruebas especificas y claras (Tabla 1).

4. Reactivacion de las cepas estandares ATCC

Cada una de las cepas ATCC se mantuvo en condiciones de refrigeracion normal (2-8[grados]C) hasta su reactivacion bajo las condiciones de crecimiento que cada una de ellas requiere (Tabla 2).

Prueba para la determinacion de la sensibilidad antibacteriana

Se tomaron las colonias con asas de siembra de cada una de las cepas reactivadas y se diluyeron en suero fisiologico hasta obtener la escala de turbidez de 0.5 de Mc Farland, 1,5 x [10.sup.8] excepto para el caso de Lactobacillus que fue de 2, 6 x [10.sup.8] UFC/ml, con el fin de poder apreciar mejor los halos de inhibicion. Con micropipeta se extrajeron 100 de cada una de las suspensiones mencionadas y este contenido se deposito en las placas con agar. Con ayuda de un hisopo esteril, se realizo la siembra por diseminacion. Fueron sembrados: Streptococcus mutans en agar TSA, Lactobacillus acidophilus en agar Rogosa y, en los casos de Actinomyces viscosus, Prevotella melaninogenica y Fusobacterium nucleatum en Agar Shadler suplementado con sangre de cordero al 5 %

Con pinzas esteriles se procedio a colocar en cada placa un disco de papel de filtro embebido en 10 [micron]L de digluconato de clorhexidina al 0,12 % (control positivo), un disco de papel filtro embebido en 10 ul de alcohol al 96 % (control negativo), un disco de papel de filtro embebido con 10 [micron]L del extracto hidroalcoholico a la concentraciones de 25 [micron]g/mL y 50 [micron]g/mL de las siguientes plantas: Plantago major L, Erythroxylum novogranatense (Rusby) Plowman var. Truxillense y Camellia sinensis; a una distancia no menor de 15 mm entre ellos y a 1,5 cm del borde de la placa, presionandolos firmemente sobre la superficie del agar. Seguidamente se incubaron bajo las condiciones mencionadas en tabla 2, para proceder a la lectura de los resultados en terminos de mm de diametro de halos de inhibicion. Todo el procedimiento se realizo en el Laboratorio de Microbiologia de la Facultad de Odontologia de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

Resultados

En el Cuadro 3 se presentan los resultados de las actividades antibacterianas de los extractos hidroalcoholicos de las tres plantas medicinales en las diluciones 25 y 50 [micron]g/mL, del Control positivo (PerioAid[R]) y del control negativo (alcohol etilico al 70 %), basados en los promedios de las de los halos de inhibicion de crecimiento bacteriano.

En general se aprecia que dicha actividad siempre fue mayor que la del control negativo y menor que la del control positivo, se observa tambien que de entre los grupos de estudio los resultados mayores los obtuvo el extracto hidroalcoholico de C. sinensis a 50 [micron]g/ mL sobre S. mutans (20 mm), mientras que la menor la presenta el extracto hidroalcoholico de P. major L a 25 [micron]g/mL sobre A. viscosus (7,4 mm). Se aplico la prueba estadistica de Kruskall y Wallis comparando la actividad antibacteriana de los tres extractos a 25 [micron]g/mL con los controles positivo y negativo por tipo de bacteria, el mismo procedimiento se realizo con los extractos a 50 [micron]g/mL, obteniendose como resultado de dicha prueba que existen diferencias estadisticamente significativas (valores p<0,05) entre la actividad antibacteriana de los extractos hidroalcoholicos y los controles por tipo de bacterias al 95 % de confianza. Posteriormente se aplico la prueba de Comparaciones Multiples HSD de Tukey, comparando la actividad antibacteriana de cada extracto con cada control y los extractos entre ellos por tipo de bacteria y de esa manera se determino que solamente en la comparacion de la actividad antibacteriana de Camellia sinensis a 50 [micron]g/mL con el Control positivo sobre la bacteria Prevotella melaninogenica se obtuvo un valor p = 0,127, lo que indica que estadisticamente dichas sustancias presentan el mismo comportamiento.

En la Figura 1 se observan los halos de inhibicion formados por la actividad de los extractos hidroalcoholicos de las tres plantas medicinales en ambas concentraciones, del control postivo y del control negativo sobre Streptococcus mutans.

En las Figuras 2, 3, 4 y 5 se observa dicha actividad pero sobre las bacterias Lactobacillus acidophilus, Actinomyces viscosus, Prevotella melaninogenica y Fusobacterium nucleatum respectivamente.

[FIGURA 1 OMITIR]

[FIGURA 2 OMITIR]

[FIGURA 3 OMITIR]

[FIGURA 4 OMITIR]

[FIGURA 5 OMITIR]

Discusion

Los extractos obtenidos mediante maceracion alcoholica de las hojas de Plantago major L. (llanten), Erythroxylum novogranatense (Rusby) Plowman var. truxillense (coca Trujillo) y Camellia sinensis (te verde) en concentraciones de 25 y 50 [micron]g/mL, demostraron tener propiedades antibacterianas in vitro sobre cepas de bacterias patogenas orales como: Streptococcus mutans, Lactobacillus acidophilus, Actinomyces viscosus, Prevotella melaninogenica y Fusobacterium nucleatum que conforman parte de la microbiota bucal y estan implicadas en patologias orales como caries dental y enfermedad periodontal. El comportamiento de los extractos, en terminos de tamano de halo de inhibicion, siempre fueron menores a la presentada por el control positivo (PerioAid) y mayores a la del control negativo (alcohol 70 %).

Complementariamente al estudio se realizo el analisis fitoquimico de los extractos hidroalcoholicos empleados en la investigacion, comprobandose que contienen en su composicion principios activos a los cuales se les puede atribuir sus propiedades antibacterianas.

Si bien no existen antecedentes que comparen la actividad antibacteriana de los tres extractos empleados en este estudio, los resultados presentados por cada uno de ellos, y analizados de manera individual, coinciden con la investigaciones realizadas acerca de los extractos hidroalcoholicos de Plantago major, (1) Erythroxylum novogranatense var. truxillense (7,8,9) y Camellia sinensis. (2, 10)

En la comparacion de la actividad antibacteriana de los tres extractos hidroalcoholicos, Camellia sinensis presento, en ambas concentraciones, los mejores resultados sobre la mayoria de las bacterias patogenas orales, este resultado se explicaria por la presencia de polifenoles, los cuales tienen diferentes mecanismos de accion, entre ellos la inhibicion de la produccion de acidos y de la enzima glucosiltransferasa.

Conclusiones

1. Los tres extractos hidroalcoholicos en las diluciones de 25 y 50 [micron]g/mL presentaron actividad antibacteriana sobre Streptococcus mutans, Lactobacillus aci dophilus, Actinomyces viscosus, Prevotella melaninogenica y Fusobacterium nucleatum.

El efecto antibacteriano aumento con la concentracion en P. melaninogenica, que fue la cepa mas sensible y A. viscosus la menos sensible

2. De la comparacion entre los extractos diluidos a 25 [micron]g/mL, los resultados con mayores valores los presento el extracto hidroalcoholico de Camellia sinensis, excepto sobre A. viscosus; mientras que los menores se observaron con el de Plantago major L.

3. De la comparacion entre los extractos diluidos a 50 [micron]g/mL, los resultados con mayores valores los presento el extracto hidroalcoholico de Camellia sinensis, excepto sobre F. nucleatum, en cuyo caso los mayores valores los presento el extracto de Plantago major L; en el resto de los casos esta ultima sustancia registro los menores resultados.

Referencias bibliograficas

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Veronica Alvarado Villanueva [1], Hilda Moromi Nakata [2]

[1] Bachiller de la Facultad de Odontologia de la UNMSM

[2] Profesora Principal del DA de C. Basicas UNMSM

Correspondencia:

CD Veronica Alvarado Villanueva

E-mail: veronicajanetav@gmail.com

Fecha de recepcion: 24-06-10

Fecha de aprobacion: 08-11-10
Tabla 1. Principios activos encontrados en los extractos
hidroalcoholicos de plantas medicinales.

Prueba                    Principio activo   Llanten   Te verde   Coca

Prueba de la espuma       Saponinas             E         +        E
Reaccion de Shinoda       Flavonoides           +         -        -
Reaccion de cloruro       Fenoles               +         +        +
  ferrico
Reaccion de Draguendorf   Alcaloides            -         E        +
Reaccion de Mayer         Alcaloides            -         -        +
Reaccion de Baljet        Lactosas              -         -        +
Reaccion de Bortranger    Quinonas              +         +        -
Reaccion de Hidroxamato   Cumarinas             -         E        E
  ferrico

Intensidad de la respuesta, (+) Positivo, (E) Escaso, (-) Negativo

Tabla 2. Condiciones para la reactivacion de cepas utilizadas para el
estudio.

Tipo de                Numero      Temperatura       Tiempo
microorganismo         ATCC         incubacion      incubacion

Streptococcus mutans   25175       37[grados]C         48 h

Lactobacillus          314         37[grados]C         48 h
  acidophilus
Actinomyces            15987       37[grados]C         48 h
  viscosus
Prevotella             25845       37[grados]C         7 dias
  melaninogenigenica
Fusobacterium          25586       37[grados]C         7 dias
  nucleatum

Tipo de                Condiciones      Medio de
microorganismo         de aerobiosis     cultivo

Streptococcus mutans   Microanae-         Agar
                       robiosis        Tripticasa
                                        soya(TSA)
Lactobacillus          Anaerobiosis     A.Rogosa
  acidophilus
Actinomyces            Anaerobiosis    A.Schaedler
  viscosus
Prevotella             Anaerobiosis    A.Schaedler
  melaninogenigenica
Fusobacterium          Anaerobiosis    A.Schaedler
  nucleatum

Tabla 3. Halos de inhibicion promedio de extractos
hidroalcoholicos frente a cinco cepas bacterianas.

                               Extractos hidroalcoholicos

Bacterias               P. major                  C. sinensis

                   25 [micron]  50 [micron]  25 [micron]  50 [micron]
                       g/mL        g/mL        g/mL         g/mL

S. mutans              7,6          8,8          15,4         20,0
L. acidophilus         9,0          9,2          10,6         11,6
A. viscosus            7,4          9,2          7,6          9,4
P. melaninogenica      10,4         11,2         13,6         15,2
F. nucleatum           9,0          11,0         9,6          10,6

                          Extractos
                      hidroalcoholicos           Controles

Bacterias             E. novogranatense      Control      Control
                                             positivo     negativo
                   25 [micron]  50 [micron]
                      g/mL         g/mL

S. mutans              8,8          10,4         22,0         5,0
L. acidophilus         9,8          10,0         13,2         5,4
A. viscosus            8,8          9,4          13,2         5,8
P. melaninogenica      12,6         13,4         17,0         5,8
F. nucleatum           9,6          11,0         15,4         5,8
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Author:Alvarado Villanueva, Veronica; Moromi Nakata, Hilda
Publication:Odontologia sanmarquina
Article Type:Report
Date:Jul 1, 2010
Words:2731
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