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Phenanthrene dissipation by Azolla caroliniana utilizing bioaugmentation with hydrocarbonoclastic microorganisms/Remocion de fenantreno por Azolla caroliniana utilizando bioaumentacao con microorganismos hidrocarbonoclasticos/Remocao de fenantreno por Azolla caroliniana utilizando bioaumentacao com microorganismos hidrocarbonoclasticos.

SUMMARY

The aim of this work was to evaluate the ability of Azolla caroliniana to grow and to dissipate phenanthrene (PHE) by using bioaugmentation with hydrocarbonoclastic microorganisms. A. caroliniana was selected from four Mexican strains based on its tolerance to increasing concentrations of PHE. Afterwards, A. caroliniana was exposed to PHE concentrations of 20, 40 and 60mg x [l.sup.-1] and/or inoculated with the microbial consortium conformed by Bacillus stearothermophilus and Oscillatoria sp. (BST+OSC), strains previously tested for their tolerance to 100mg PHE x [l.sup.-1]. After 49 days, the higher dry mass production was observed at the treatment with 20mg PHE and at that with BST+OSC in presence of 40mg PHE x [l.sup.-1]; both treatments had 19.7% more dry mass than the control. Treatments with higher dry mass production also had higher nitrogenase activity (7-12nmol[C.sub.2][H.sub.4] x [g.sup.-1] x [h.sup.-1]), whereas the lowest activity was observed at the treatments with 60mg PHE (3-4nmol [C.sub.2][H.sub.4] x [g.sup.-1] x [h.sup.-1]). The lowest PHE dissipation (45%) was observed in A. caroliniana without BST+OSC in the presence of 20mg PHE; in contrast, the highest PHE dissipation (80%) was observed with A. caroliniana, either inoculated or not, when in presence of 60mg PHE. This is one of the first reports describing the negative effects of PHE on the growth of Azolla and its microsymbiont, as well as the potential of A. caroliniana for the dissipation of PHE with or without bioaugmentation.

RESUMEN

El objetivo de este trabajo fue conocer la capacidad de crecimiento y remocion de fenantreno (FEN) por el helecho Azolla caroliniana, utilizando bioaumentacion con microorganismos hidrocarbonoclastas. A. caroliniana fue seleccionada de entre cuatro colectas de Azolla de Mexico, por su tolerancia a concentraciones crecientes de FEN. Posteriormente, A. caroliniana fue expuesta a tres concentraciones de FEN: 20, 40 y 60mg x [l.sup.-1], e/o inoculada con el complejo microbiano Bacillus stearothermophilus y Oscillatoria sp. (BST+OSC) con tolerancia in vitro a 100mg FEN x [l.sup.-1] de medio de cultivo. A los 49 dias despues de la inoculacion (DDI), la mayor produccion de materia seca se presento en el tratamiento con 20mg FEN y en el que se aplico bioaumentacion con BST+OSC en presencia de 40mg FEN. Ambos tratamientos superaron en 19,7% al testigo. Los tratamientos con mayor produccion de materia seca presentaron mayor actividad nitrogenasa (7-12nmol [C.sub.2][H.sub.4]x[g.sup.-1]x[h.sup.-1]), mientras que la menor actividad se observo en los tratamientos con 60mg FEN (3-4nmol [C.sub.2][H.sub.4]x[g.sup.-1]x[h.sup.-1]). La menor remocion de FEN (45%) se observo en A. caroliniana sin BST+OSC con 20mg FEN; en contraste, la mayor remocion (80%) se presento en A. caroliniana inoculada y/o sin inocular en presencia de 60mg FEN. Este trabajo es uno de los primeros reportes del efecto negativo de FEN sobre el crecimiento de Azolla y su microsimbionte, asi como del potencial de remediacion de FEN por A. caroliniana mediante el uso de bioaumentacion.

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi conhecer a capacidade de crescimento e remocao de fenantreno (FEN) pela Azolla Caroliniana (Azolla caroliniana), utilizando bioaumentacao com microorganismos hidrocarbonoclasticas. A. caroliniana foi selecionada de entre quatro coletas de Azolla de Mexico, por sua tolerancia a concentracoes crescentes de FEN. Posteriormente, A. caroliniana foi exposta a tres concentracoes de FEN: 20, 40 e 60 mg x [l.sup.-1], e/ou inoculada com o complexo microbiano Bacillus stearothermophilus e Oscillatoria sp. (BST+OSC) com tolerancia in vitro a 100mg FEN x [l.sup.-1] de meio de cultivo. Aos 49 dias depois da inoculacao (DDI), a maior producao de materia seca apresentou-se no tratamento com 20mg FEN e naquele onde foi aplicada bioaumentacao com BST+OSC na presenca de 40mg FEN. Ambos tratamentos superaram em 19,7% ao testemunha. Os tratamentos com maior producao de materia seca apresentaram maior atividade nitrogenase (7-12nmol [C.sub.2][H.sub.4] x [g.sup.-1] x [h.sup.-1]), enquanto que a menor atividade foi observada nos tratamentos com 60mg FEN (3-4nmol [C.sub.2][H.sub.4] x [g.sup.-1] x [h.sup.-1]). Observou-se a menor remocao de FEN (45%) em A. caroliniana sem BST+OSC com 20mg FEN; em contraposicao, apresentou-se a maior remocao (80%) em A. caroliniana inoculada e/ou sem inocular na presenca de 60mg FEN. Este trabalho e um dos primeiros relatorios a respeito do efeito negativo de FEN sobre o crescimento de Azolla e seu microsimbionte, assim como do potencial de remediacao de FEN por A. caroliniana mediante o uso de bioaumentacao.

PALABRAS CLAVE / Microorganismos Degradadores de HAP / Nitrogenasa / Remediacion / Simbiosis /

Introduccion

El petroleo es una mezcla de variados hidrocarburos y otros compuestos organicos, incluyendo algunos organometalicos con V y Ni, principalmente. Es tambien uno de los recursos naturales no renovables mas importantes para la humanidad y varia en composicion y propiedades fisico-quimicas de acuerdo a su sitio de extraccion. Los hidrocarburos del petroleo se clasifican, de acuerdo a su estructura y en orden de complejidad en alcanos, cicloalcanos, aromaticos y asfaltenos (Atlas y Cerniglia, 1995). La contaminacion de los ecosistemas con petroleo es un problema que ha estado presente a traves del tiempo y muchos estudios se han enfocado en la evaluacion de la degradacion de hidrocarburos persistentes en el ambiente, en especial los aromaticos polinucleares (HAP).

Algunas bacterias y cianobacterias, hongos y algas poseen diversas herramientas que les permiten utilizar HAP de bajo y alto peso molecular como unica fuente de energia y carbono (Van Hamme et al., 2003). El fenantreno (FEN) es un hidrocarburo con tres anillos aromaticos que se encuentra en altos porcentajes en productos refinados del petroleo, tiene un peso molecular de 178 y solubilidad en agua de 1,29mg x [ml.sup.-1] (Irwin et al., 1997). La presencia de FEN en los ecosistemas se debe a la combustion incompleta de materiales organicos como carbon, petroleo, gasolina y madera. Una minima porcion es derivada de incendios forestales y erupciones volcanicas. Las fuentes antropogenicas de contaminacion de ambientes acuaticos con FEN son los derrames de petroleo crudo o refinado, efluentes industriales o caseros, suelo acarreado por erosion hidrica y deposito directo desde la atmosfera (Valsaraj, 1988). El FEN y otros contaminantes pueden ser asimilados por las raices de las plantas y acumulados, metabolizados o volatilizados (Reynolds y Skipper, 2005).

Son pocos los reportes de plantas acuaticas usadas en la limpieza de aguas residuales urbanas e industriales contaminadas con metales pesados y compuestos organicos (Salmon et al., 1998). Cerniglia et al. (1980) describieron las vias de degradacion de naftaleno por la cianobacteria Oscillatoria sp.

Azolla es un helecho acuatico que forma simbiosis con la cianobacteria Anabaena azollae, la cual vive dentro de su fronda y puede fijar de 100 a 1564kg de [N.sub.2] x [ha.sup.-1] x [ano.sup.-1] (Quintero-Lizaola y Ferrera-Cerrato, 2000). Ha sido empleada en la limpieza de acuiferos por su habilidad de fijar [N.sub.2] y remover P de los ecosistemas (Shiomi y Kitoh, 1987). Tambien se utiliza como biofiltro de elementos toxicos en sistemas con agua circulante (Cohen-Shoel et al., 2002; Costa et al., 1999) y corno acumulador de metales pesados (Sela et al., 1989, Ortiz-Caton et al., 1994). Su uso potencial en bioremediacion se basa en sus estrategias de sobrevivencia y proliferacion en acuiferos contaminados (Uheda et al., 1995). Ladha y Reddy (2003) mencionan que Azolla puede ser usado como purificador de agua y su aplicacion biotecnologica requiere de seleccion de biotipos y desarrollo y mejoramiento de hibridos, ademas de mayor entendimiento de los mecanismos que inducen su esporulacion y reproduccion. Sin embargo, no se ba reportado el uso del helecho acuatico Azolla, ampliamente distribuido en el territorio mexicano, en la limpieza de acuiferos contaminados con hidrocarburos del petroleo (Ferrera-Cerrato et al., 2006).

El presente estudio se enfoca hacia la seleccion de colectas de Azolla de distintas zonas de Mexico, por su capacidad de crecer en presencia de y remover el FEN, al ser inoculadas con un consorcio degradador de hidrocarburos compuesto por Bacillus stearothermophilus y Oscillatoria sp.

Materiales y Metodos

Fase I. Seleccion de colectas de Azolla tolerantes al fenantreno. En esta fase se utilizaron cuatro colectas de Azolla de diferentes zonas de Mexico, cuyas caracteristicas se presentan en la Tabla I.

Se establecio un experimento completamente al azar con cinco diferentes concentraciones de fenantreno (Sigma [R] 96% de pureza; FEN), de 0, 25, 50, 75 y 100mg x [l.sup.-1] en la solucion nutritiva para cada uno de las cuatro colectas evaluadas. Las unidades experimentales con 5 repeticiones, fueron recipientes de plastico de 0,51 de capacidad y 86,5[cm.sup.2] de area, a los cuales seles anadieron 300ml de solucion nutritiva Yoshida compuesta por (g x [l.sup.-1]) 0,05 Na[H.sub.2]P[O.sub.4] x 2[H.sub.2]O; 0,09 [K.sub.2]S[O.sub.4]; 0,11 Ca[Cl.sub.2]; 0,4 MgS[O.sub.4] x 7[H.sub.2]O; 0,01 Mn[Cl.sub.2] x [H.sub.2]O; y acido citrico monohidratado 0,015g, y por (mg x [l.sup.-1]) 0,1 (N[H.sub.4])6[Mo.sub.7][O.sub.24] x 4[H.sub.2]O; 1,1 [H.sub.3]B[O.sub.3]; 0,4 ZnS[O.sub.4] x 7[H.sub.2]O; 0,04 CuS[O.sub.4] x 5[H.sub.2]O; 9,6 Fe[Cl.sub.3] x 6[H.sub.2]O. El FEN fue disuelto previamente en acetona para su distribucion en la solucion nutritiva y se coloco el helecho acuatico hasta despues de 24h, para permitir la volatilizacion del solvente. En cada recipiente se coloco 1g de peso fresco de las diferentes colectas de Azolla para cada recipiente. El experimento se llevo acabo en camara de crecimiento (Lab-Line Biotronette[R]) con temperatura de 27[grados]C y humedad relativa de 60%, fotoperiodo de 12h e intensidad luminica de 280[micron]mol x [cm.sup.-2] x [s.sup.-1]. Diaria-mente se mantuvo el nivel de solucion nutritiva en cada unidad experimental.

Esta fase experimental concluyo cuando el helecho lleno la superficie del recipiente de la primera unidad experimental, ~28 dias despues de la inoculacion (DDI). Se colecto la biomasa del helecho acuatico y se seco a 70[grados]C durante 72h. Terminado este proceso de secado se peso el material vegetal.

Fase II. Remocion de fenantreno por Azolla caroliniana utilizando bioaumentacion con Bacillus stearothermophilus y Oscillatoria sp. De acuerdo a los resultados obtenidos en la Fase I, se selecciono la colecta de Azolla que mostro mayor tolerancia a FEN.

El experimento se llevo a cabo en condiciones de invernadero. Se utilizaron recipientes de plastico (600ml de capacidad y 157,5[cm.sup.2] de area) conteniendo 300ml de solucion Yoshida. Se inoculo un consorcio con dos microorganismos degradadores de FEN, Bacillus stearothermophillus y Oscillatoria sp. (BST+OSC). La bacteria B. stearothermophillus fue asilada de un suelo contaminado con petroleo de Minatitlan, Veracruz, Mexico, y tiene la capacidad de producir un surfactante util en la degradacion de hidrocarburos del petroleo. Los biosurfactantes han sido considerados de importancia en la biorremediacion de ambientes contaminados pues son biodegradables, de baja toxicidad y mejoran la biodisponibilidad de los compuestos toxicos (Amezcua-Vega et al., 2004). La cianobacteria Oscillatoria fue previamente aislada de un acuifero contaminado con petroleo en Tabasco; es fijadora de [N.sub.2] atmosferico y tiene capacidad fotosintetica. Para su inoculacion, ambas cepas fueron propagadas por separado en medios de cultivo para bacterias (Merck[R]) y cianobacterias (Allen, 1968) e incubadas durante 48 a 120rpm y 27[grados]C. De cada cultivo microbiano se tomaron 5ml ([10.sup.9] celulas x [ml.sup.-1]), para inocular las respectivas unidades experimentales.

El experimento factorial 3x2 tuvo un diseno experimental completamente al azar con 11 repeticiones por tratamiento. El factor inoculacion del helecho tuvo dos niveles: 1) A. caroliniana (Tabasco) no inoculada y 2) A. caroliniana inoculada con BST+OSC. Para el factor FEN se consideraron tres concentraciones: 20, 40 y 60mg FEN por litro de solucion nutritiva. Ademas, se incluyo un tratamiento testigo sin FEN y sin inoculacion del consorcio microbiano.

Variables de crecimiento de A. caroliniana

Se determino el peso fresco de A. caroliniana a los 49 DDI en las cinco repeticiones restantes de cada tratamiento y la fitomasa fue luego secada a 70[grados]C por 48h para determinar el peso seco. Se calculo el porcentaje de inhibicion o estimulacion del crecimiento del helecho por efecto de las diferentes concentraciones de FEN tomando en cuenta como 100% de crecimiento al promedio del tratamiento testigo. Tambien, se determino la tasa de crecimiento relativo y el tiempo de duplicacion basado en peso seco, de acuerdo a la metodologia utilizada por Quintero-Lizaola (1998) y Vidal et al. (1992). Para la tasa relativa de crecimiento se utilizo la ecuacion TCR = (LnW2-LnW1)/(t), donde TCR: tasa de crecimiento relativo (g x [g.sup.-1] x [dia.sup.-1]), LnW2; logaritmo natural del peso final, LnW1: logaritmo natural del peso inicial, y t: tiempo de crecimiento (dias). En el caso de la tasa de duplicacion, esta se calculo como TD=Ln2/TCR, donde TD: tiempo de duplicacion expresado en dias.

Actividad de la enzima nitrogenasa

A los 7, 14 y 21 DDI, se realizo la prueba de reduccion de acetileno para determinar la actividad de la enzima nitrogenasa. Se coloco 1g de helecho acuatico en frascos de vidrio de 25ml que fueron sellados hermeticamente con un tapon de goma. Una hora despues, se extrajo 10% del aire, remplazandolo por acetileno comercial. Se extrajo una muestra de la fase gaseosa y se transfirio a tubos al vacio (Vacutainer[R]) de 10ml. Posteriormente, se determino la cantidad de acetileno y etileno en un cromatografo de gases (Hewlett Packard 5890) con temperatura de columna de 60[grados]C y de detector de 70[grados]C. La actividad nitrogenasa fue estimada de acuerdo con la metodologia propuesta por Ferrera-Cerrato et al. (1993).

Poblacion microbiana en la rizosfera de A. caroliniana

A los 49 DDI, se determino la poblacion de algunos grupos microbianos en la rizosfera del helecho acuatico, por el metodo de cuenta viable. Se prepararon diluciones decimales acuosas y siembra en placa de agar con el medio mineral minimo modificado (Hernandez-Acosta et al., 2003) derivado del medio fuente combinada de carbono (Rennie, 1981) y que consta de dos soluciones. Solucion 1: 0,8g [K.sub.2]HP[O.sub.4]; 0,2g K[H.sub.2]P[O.sub.4]; 0,1g Na[Cl.sub.2]; 28,0mg [Na.sub.2]FeE-DTA; 25,0mg [Na.sub.2]Mo[O.sub.4]; 0,25g extracto de levadura; y 900ml agua destilada. Solucion 2: 2,0g MgS[O.sub.4]; 0,06g Ca[Cl.sub.2]; 100mg de FEN diluidos en 10ml de acetona y 100ml de agua destilada. Las dos soluciones se esterilizaron por separado a 18lbs x [plg.sup.-2] durante 18min y cuando tibias se mezclaron. Para degradadores de FEN que no fijan [N.sub.2] atmosferico se utilizo el medio de cultivo anterior mas 1,5g N[H.sub.4]N[O.sub.3]. Seuso agar papa glucosa mas rosa de bengala para hongos totales (Beever y Bollard, 1970).

Contenido de fenantreno

El analisis del contenido de FEN de la solucion nutritiva se realizo semanalmente durante 49 dias. Durante los primeros seis muestreos se utilizo solo una repeticion por tratamiento. En el muestreo final se utilizaron cinco repeticiones. Para ello, a cada unidad experimental se le retiro el helecho, para ello se utilizo el metodo de extraccion en fase liquida con embudo de separacion. La solucion nutritiva (~300ml) se deposito en el embudo y se mezclo con 150ml de diclorometano. Se agito vigorosamente y se permitio la separacion de las fases. El diclorometano se colecto en matraz balon de fondo plano y se concentro la muestra en un rotavapor. Este proceso se repitio dos veces adicionando diclorometano, agitando y concentrando la muestra. La lectura del FEN se realizo en espectrofotometro UV-VIS (Hewlett Packard Modelo Chemstation) a 253nm. Se preparo una curva de calibracion con 1; 0,8; 0,6; 0,4 y 0,2 mg FEN x [ml.sup.-1] de diclorometano (Soroka y Soroka, 2002). La degradacion de FEN fue expresada como porcentaje.

Observacion microscopica del microsimbionte Anabaena azollae

Se observaron los posibles cambios en la morfologia microscopica de la cianobacteria en las frondas de A. caroliniana por efecto del contaminante. A los 28 DDI, se tomo una muestra de A. caroliniana en fresco de cada Watamiento. Una porcion de frondas (0,1g) fueron cuidadosamente maceradas en portaobjetos. Se trato de retirar la mayoria de los fragmentos de tejidos de A. caroliniana y solo dejar la savia con las cianobacterias libres. Sin realizar tincion, se coloco un cubreobjetos y se observo en microscopio optico, en campo claro y con el objetivo 40x para la toma de micrografias.

Analisis estadistico

Los datos de cada variable en cada fecha de muestreo, se sometieron a un analisis de varianza y prueba de comparacion de medias (Tukey, [alfa]=0,05), mediante el programa SAS para windows version 8.2, 1999-2001.

Resultados y Discusion

Seleccion de colectas de Azolla tolerantes al FEN

La presencia de FEN en la solucion nutritiva, independientemente de su concentracion, redujo significativamente el crecimiento de las cuatro colectas de Azolla. Las colectas de A. mexicana de Guamuchil (Sinaloa) y de Cerro Gordo (Veracruz) fueron las mas susceptibles al FEN, el cual produjo la muerte de estas colectas aun en las concentraciones mas bajas. A. caroliniana (Tabasco) mostro mayor tolerancia al FEN. El tiempo requerido para que esta colecta llenara la superficie del recipiente en presencia de 25mg FEN fue de 25 DDI, mostrando el mayor peso seco (0,16g). El tratamiento con 50mg de FEN tuvo 3,2g de peso fresco y 0,11g de peso seco, los cumes fueron mayores al testigo (2,7g de peso fresco y 0,06 de peso seco). En presencia de 75mg FEN la produccion de biomasa del helecho fue similar al testigo. En contraste, A. caroliniana no mostro crecimiento en presencia de 100mg FEN, tratamiento en el cual las raices de helecho estuvieron separadas y consecuentemente, la parte aerea estaba muerta (datos no presentados).

Aun cuando no se tienen reportes respecto al comportamiento de Azolla ante los HAP, la presencia de hidrocarburos del petroleo tiene efectos negativos en el crecimiento de este helecho acuatico. Cohen et al. (2002) mencionaron que A. pinnata no fue capaz de tolerar la presencia de diesel a concentraciones de 2,41 x [m.sup.-2]. Hasta donde pudimos conocer, el presente es de los primeros estudios que mencionan los efectos negativos del FEN en el crecimiento de cuatro colectas de Azolla, de las cuales A. caroliniana tuvo mayor tolerancia a concentraciones bajas.

Remocion de FEN por A. caroliniana utilizando bioaumentacion con BST+ OSC

En la segunda fase del estudio se utilizo el complejo de A. caroliniana (Tabasco) expuesta a concentraciones de FEN no mayores a 60mg por litro de solucion nutritiva. A los 42 DDI, A. caroliniana lleno la superficie del recipiente en el tratamiento con 40mg FEN inoculado con BST+OSC. La produccion de materia seca fue significativamente mayor (P<0,05) en los tratamientos de A. caroliniana con 20mg FEN y en A. caroliniana inoculada con BST+OSC en presencia de 40mg FEN, en comparacion con el tratamiento de A. caroliniana inoculada con BST+OSC y 60mg FEN (Tabla II). El efecto negativo de los HAP como el fenantreno, en el crecimiento de microorganismos simbioticos ha sido demostrado previamente (Alarcon et al., 2006; Franco-Ramirez et al., 2007), denotando la toxicidad de los HAP en microorganismos simbioticos y en sus hospedantes, como fue el caso de Azolla-Anabaena.

[FIGURA 1 OMITIR]

Considerando la ausencia del consorcio microbiano (BST+OSC), la dosis de 20mg FEN estimulo 19,7 y 4,5% el crecimiento del helecho con respecto al testigo; sin embargo, conforme las concentraciones de FEN incrementaron, el crecimiento fue disminuyendo. Aun cuando no se observaron diferencias significativas entre los tratamientos inoculados con BST+OSC, el crecimiento de Azolla fue estimulado en 19,7% por la bioaumentacion en presencia de 40mg de FEN (Tabla II). En contraste, en presencia de 60mg FEN e inoculacion de BST+OSC, el crecimiento del helecho fue reducido en 6,67%.

La TCR fue significativamente mayor en los tratarelentos A. caroliniana con 20 mg FEN y en A. caroliniana inoculada BST+OSC en presencia de 40mg FEN, mismos que presentaron menor TD en comparacion con el resto de los tratamientos (Tabla II). Esto indica que la colecta de A. caroliniana tiene la capacidad de crecer mejor en concentraciones bajas de contaminante (20mg FEN) y que la inoculacion del consorcio microbiano permitio el crecimiento de Azolla en presencia de 40mg FEN, lo que denota un efecto benefico de la bioaumentacion a esta concentracion de FEN. Estos resultados representan uno de los primeros reportes acerca del beneficio de la bioaumentacion con microorganismos hidrocarbonoclastas en Azolla expuesta a HAP.

El FEN, a excepcion de la dosis de 40mg, inhibio la actividad de la enzima nitrogenasa en A. caroliniana con respecto al testigo (Figura 1). Por su parte, la inoculacion del consorcio BST+OSC contribuyo a la disminucion de la actividad enzimatica, la cual fue en general muy similar a la observada en el testigo no inoculado (Figura 1). La actividad nitrogenasa en sistemas simbioticos como el caso de Azolla-Anabaena no ha sido previamente evaluada en presencia de HAP. No obstante, Stahl y Williams (1986) indicaron que la presencia de petroleo redujo significativamente la actividad nitrogenasa en el sistema simbiotico trebol-Rhizobium. Por otra parte, se tienen antecedentes de que esta actividad enzimatica en raices de trebol inoculadas con Rhizobium leguminosarum var. trifolii, puede ser estimulada en presencia de dosis bajas de Cr (10mg x [kg.sup.-1]); sin embargo, dosis mas altas (70mg x [kg.sup.-1]) inhiben tanto el crecimiento de la bacteria como su actividad nitrogenasa (Casella et al., 1988). Por su parte, la actividad nitrogenasa y la absorcion de N (N[H.sub.4.sup.+] y N[O.sub.3.sup.-]) en Nostoc muscorum son sensiblemente afectadas por la aplicacion de Cr, Ni y Pb (Rai y Raizada, 1989). Ademas, la nitrogenasa en bacterias de vida libre fijadoras de [N.sub.2] atmosferico presenta variaciones en su inhi bicion y/o estimulacion por efecto de plaguicidas, de manera particular la presencia de paraquat resulta en la inhibicion de esta actividad enzimatica (Jagnow et al., 1979).

[FIGURA 2 OMITIR]

Dado que las unidades experimentales no estuvieron en un sistema completamente cerrado, se considero la evaluacion de los microorganismos en la rizosfera del helecho. Las poblaciones de hongos totales (HT) y bacterias degradadoras (BD) de FEN (Figura 2) no presentaron diferencias significativas entre tratamientos. Sin embargo, la poblacion de bacterias que utilizan FEN como fuente de carbono y que ademas fijan [N.sub.2] atmosferico, fue significativamente mayor (P<0,05) en aquellos tratamientos donde se utilizo la bioaumentacion con BST+OSC, en todas las concentraciones de FEN (Figura 2b). Caudales et al. (1998) encontraron diferentes especies de Arthrobacter aisladas de la rizosfera de A. caroliniana, y mencionan que en aguas contaminadas se pueden presentar microorganismos versatiles y tolerantes a condiciones adversas cuyas funciones aun no estan definidas.

La poblacion tanto de HT y BD de FEN disminuyo conforme la concentracion de FEN incremento (Figura 2c), mientras que la poblacion de BD de-FEN que fijan [N.sub.2] atmosferico aumento conforme la concentracion de FEN incremento (Figura 2b). Lo anterior resalta la importancia de la microflora de la rizosfera de Azolla como elemento que podria contribuir en la destoxificacion de acuiferos contaminados. Hernandez-Acosta et al. (2003) senalan que las bacterias fijadoras de [N.sub.2] atmosferico (BFNA) son importantes para biorremediar suelos contaminados, ya que incorporan N en el sistema. Sin embargo, no se tienen reportes del efecto de este grupo bacteriano en sistemas acuaticos y sobretodo, en presencia del helecho Azolla, por lo que se sugiere realizar mas estudios al respecto a fin de evaluar la funcion de estas bacterias en la remediacion de acuiferos. Contrario a lo esperado, el aumento en la poblacion de BFNA no estuvo correlacionado con un aumento en la actividad nitrogenasa en el sistema simbiotico Azolla-Anabaena, sugiriendo la proliferacion de bacterias fijadoras de [N.sub.2] atmosferico con mayor actividad degradadora de FEN, especialmente en las concentraciones de 20 y 40mg FEN (Figura 1). No obstante, la actividad fisiologica de estas bacterias en la fijacion del nitrogeno atmosferico requiere de mayor estudio, de forma que se pueda estimar su actividad nitrogenasa y su contribucion en la incorporacion del [N.sub.2] en el sistema contaminado.

[FIGURA 3 OMITIR]

La remocion de FEN a los 49 DDI fue > 50% en todos los tratamientos (Figura 3). La inoculacion de los microorganismos hidro-carbonoclastas solo mejoro la remocion del contaminante en los tratamientos con dosis de 20mg FEN, mientras que en las dosis restantes, la remocion fue similar con a sin la aplicacion de la bioaumentacion (Figura 3). Doong y Lei (2003) mencionan que diversos surfactantes incrementaron la biodisponibilidad del pireno y, por ende, su degradacion en el suelo. Sin embargo, en ambientes acuaticos, al compararlos con el testigo, estos surfactantes redujeron la degradacion del contaminante, debido a que los microorganismos pudieron haber utilizado al surfactante como fuente de carbono facilmente asimilable. Lo anterior podria explicar la limitada capacidad de remocion del FEN en los tratamientos con bioaumentacion, denotando que en ambientes acuaticos la inoculacion de microorganismos productores de surfactantes como B. stearothermophilus puede reducir la degradacion de hidrocarburos. Aunado a esto, Gentry et al. (2003) mencionan que es comun aislar y seleccionar microorganismos degradadores de hidrocarburos. En la mayoria de los casos, su inoculacion en sitios contaminados no produce ningun efecto en terminos de degradacion de contaminantes, lo cual puede ser debido tambien a fenomenos de competencia con otros microorganismos nativos. No obstante, se sugiere mayor investigacion con respecto a las interacciones microbianas durante la remediacion y degradacion de contaminantes en sistemas acuaticos.

[FIGURA 4 OMITIR]

No se presentaron cambios en el microsimbionte por la exposicion del helecho a 20 y 40mg FEN, en comparacion con el testigo sin FEN. Sin embargo, en el tratamiento con 60mg FEN se observaron cadenas de la cianobacteria con menor numero de celulas y heterocistos (celulas especializadas en fijacion de [N.sub.2] atmosferico) desprendidos de la cadena (Figura 4). Estos resultados denotan el efecto negativo del FEN en la cianobacteria simbionte de Azolla, lo que puede explicar a su vez, el limitado crecimiento o incluso la muerte del helecho cuando estuvo expuesto a 75 y 100mg FEN en la primera fase del experimento. Estos resultados muestran por primera vez que la morfologia estructural de las cianobacterias simbioticas en Azolla es afectada por efecto de la aplicacion de 60mg FEN en una solucion nutritiva.

Conclusiones

Se observaron diferencias en la tolerancia de colectas de Azolla hacia concentraciones crecientes de FEN. A. caroliniana fue la colecta con mayor tolerancia a FEN, propiciando la remocion de este de la solucion nutritiva. La presencia de FEN produjo disminucion significativa en el crecimiento, TD y actividad nitrogenasa en el simbiosistema Azolla-Anabaena. La aplicacion de bioaumentacion con Bacillus stearothermophilus y Oscillatoria sp. produjo mayor degradacion de FEN en concentraciones de 20mg x [l.sup.-1], pero su efecto fue limitado en concentraciones >40mg FEN. Mas aun, la presencia de FEN produjo cambios morfologicos en la cianobacteria Anabaena azollae, cuyas cadenas de celulas fueron mas cortas y los heterocistos se encontraron libres, lo que denota toxicidad en la simbiosis y muerte del helecho en concentraciones de FEN >60mg x [l.sup.-1].

AGRADECIMIENTOS

El presente trabajo es parte del Proyecto SEMARNAT-CONACyT 2002-C01-0023 "Microorganismos simbioticos de la rizosfera de leguminosas y gramineas en la fitorremediacion de suelos contaminados con petroleo".

Recibido: 19/03/2007. Modificado: 23/06/2008. Aceptado: 26/06/2008.

REFERENCIAS

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Luis Alfredo Castro-Carrillo. Licenciatura en Biologia, Universidad Autonoma Metropolitana, Mexico. Quimico, Laboratorios Schering-Plough Mexico S.A. de C.V., Ciudad de Mexico, Mexico.

Julian Delgadillo-Martinez. Ingeniero Agronomo, Universidad Autonoma Chapingo. Maestro en Ciencias en Edafologia, COLPOS, Mexico. Investigador, COLPOS, Montecillo, Mexico. e-mail: juliandm@ colpos.mx

Ronald Ferrera-Cerrato. Quimico Bacteriologo Parasitologo, Escuela Nacional de Ciencias Biologicas (ENCB), Instituto Politecnico Nacional (IPN), Mexico. Doctor en Ciencias en Microbiologia, IPN, Mexico. Profesor Investigador, Colegio de Postgraduads (COLPOS), Montecillo, Mexico. Direccion: area de Microbiologia. Colegio de Postgraduados. Carretera Mexico-Texcoco km 36.5. Montecillo, Estado de Mexico. CP 56230, Mexico. e-mail: ronaldfc@colpos.mx

Alejandro Alarcon. Ingeniero Agronomo, Universidad Veracruzana, Mexico. Maestro en Ciencias en Edafologia, COLPOS, Mexico. Ph.D. en Horticultura, Texas A&M University, EEUU. Profesor, COLPOS, Montecillo, Mexico. email: alexala@colpos.mx
TABLA I
CLASIFICACION DE LAS COLECTAS DE Azolla DE ORIGEN MEXICANO,
UTILIZADAS EN EL EXPERIMENTO

Lugar de coleccion          Altitud    Catalogo   Clasificacion
                              (m)        IRRI      taxonomica *

Cerro Gordo, Veracruz           1435       8028   A. mexicana
Guamuchil, Sinaloa                50        --    A. mexicana
Tlahuac, Distrito Federal       2240        --    A. filiculoides
Cardenas, Tabasco                 10       4139   A. caroliniana

IRRI: International Rice Research Institute.

* Clasificacion de acuerdo a analisis molecular
segun Zimmerman et al. (1993).

TABLA II
VARIABLES DEL CRECIMIENTO DE A. caroliniana EXPUESTA
A CONCENTRACIONES DE FENANTRENO EN LA SOLUCION NUTRITIVA
Y BIOAUMENTACION CON UN CONSORCIO MICROBIANO AISLADO DE
UN HUMEDAL CONTAMINADO CON PETROLEO, A LOS 49 DDI

                Fenantreno
                  (mg x         Peso      Peso
                [l.sub.-1)     fresco     seco
Tratamiento                      (g)       (g)

Azolla              0            282     1,32 ab
                    20           318     1,58 a
                    40           309     1,49 ab
                    60           296     1,32 ab
Azolla con          20           314     1,38 ab
BST+OSC
                    40           324     1,58 a
                    60           278     1,10 b

              Estimulacion *   TCR **      TD
Tratamiento        (%)                   (dias)

Azolla             --          0,22 b     3,2 b
                  19,70        0,39 a     1,7 c
                  12,88        0,34 ab    2,0 ab
                   0,00        0,22 b     3,2 b
Azolla con         4,54        0,26 b     2,6 ab
BST+OSC
                  19,70        0,40 a     1,7 c
                  -6,67        0,04 c    18,7 a

* Estimulacion o inhibicion del crecimiento de A. caroliniana
con respecto al tratamiento sin inoculacion y sin fenantreno.

** g producidos / g inoculados por dia

TCR: tasa de crecimiento relativo, TD: tiempo de duplicacion, BST:
Bacillus stearothermophilus, OSC: Oscilatoria sp. Promedios con la
misma letra en la misma columna son estadisticamente iguales
(Tukey, ([alpha] = 0,05). n =  5.
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Title Annotation:REPORTS/COMUNICACIONES/COMUNICACOES
Author:Castro-Carrillo, Luis Alfredo; Delgadillo-Martinez, Julian; Ferrera-Cerrato, Ronald; Alarcon, Alejan
Publication:Interciencia
Date:Aug 1, 2008
Words:6064
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