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Perfiles proteicos de estados de desarrollo de Gonipterus scutellatus (Coleoptera: Curculionidae).

Resumen: En 1998 se detecto en Chile al gorgojo del eucalipto, Gonipterus scutellatus (Gyllenhal, 1833) (Coleoptera: Curculionidae), uno de los principales defoliadores del genero Eucalyptus, que causa perdidas de crecimiento y economicas. Esto ha generado preocupacion pues hay mas de 525.000 ha plantadas con especies de eucaliptos. Con el objetivo de conocer la respuesta de las proteinas de estados de desarrollo de G. scutellatus a las tres especies de eucaliptos mas importantes en el pais, se obtuvieron y caracterizaron perfiles electroforeticos en geles de poliacrilamida bajo condiciones desnaturalizantes, y se buscaron proteinas marcadoras por densitometria de geles. Las proteinas se hicieron mas numerosas a medida que los insectos se desarrollan. Las bandas de proteinas se concentraron entre los 20 y 120 kDa, con excepcion de los huevos, los que presentaron valores menores. La aparicion de distintas bandas de proteinas en los extractos de larvas y adultos de G. scutellatus alimentados con distintas especies de eucaliptos reflejo tambien cambios en su metabolismo. Estos antecedentes son utiles para el manejo integrado de plagas debido a que la identificacion de proteinas marcadoras posiblemente esta asociada a patrones metabolicos relacionados con el consumo de las plantas hospederas. Los cambios en la dieta del insecto podrian incidir en las proteinas marcadoras, indicando una habilidad diferencial de G. scutellatus para usar las plantas hospederas.

Palabras clave: Gorgojo del eucalipto. Eucalyptus. Electroforesis.

Protein profiles of Gonipterus scutellatus (Coleoptera: Curculionidae) development stages

Abstract: In 1998 the eucalyptus weevil, Gonipterus scutellatus (Coleoptera: Curculionidae), a major defoliator of the genus Eucalyptus, which causes growth and economic losses, was detected in Chile. This has caused concern because more than 525,000 ha are planted with species of eucalypt. To understand the protein responses of development stages of G. scutellatus red on the three species of eucalypt trees most important in the country, electrophoretic profiles were obtained and characterized on polyacrylamide gels under denatufizing conditions, and marker proteins were sought through gel densitometry. Proteins became more numerous with insect development. Protein bands were concentrated between 20 and 120 kDa, with the exception of eggs, which presented lower values. The appearance of distinct bands of proteins in the extracts from larvae and adults of G. scutellatus red on different species of eucalypts reflected changes in their metabolism. These results are useful for integrated pest management, as the identification of marker proteins is possibly associated with metabolic patterns related to the consumption of host plants. Changes in insect diet may affect the marker proteins, indicating a differential ability of G. scutellatus to use host plants.

Key words: Eucalypt weevil. Eucalypt snout beetle. Eucalyptus. Electrophoresis.

Introduccion

El gorgojo del eucalipto, Gonipterus scutelallatus (Gyllenhal, 1833) (Coleoptera: Curculionidae), es un insecto australiano especifico del genero Eucalyptus (Withers 2001) y uno de los principales agentes de dano para estas especies. Se ha distribuido practicamente por todos los continentes y se ha constituido en una plaga en la mayoria de las plantaciones de eucaliptos de Africa, Europa (Mansilla 1992; Rabasse y Perrin 1979; Richardson y Meakins 1986; Cordero et al. 1999), California (Cowles y Downer 1995; Hanks et al. 2000) y Nueva Zelanda (Cadahia 1980). En Sudamerica, se ha detectado en Argentina, Brasil, Uruguay y Chile (Rosado 1993; Beeche 1999; Zanuncio et al. 1998).

Tanto las larvas como los adultos de G. scutellatus se alimentan del follaje del eucalipto. El dano causado por este insecto es muy caracteristico, dejando huellas en las hojas afectadas (Elliott y De Little 1984). Su poblacion puede crecer mucho en pocos anos, si abundan arboles hospedantes, existe un clima templado y no hay enemigos naturales (Tooke 1953). El alto potencial reproductivo del insecto, junto con su intensa capacidad de defoliacion puede causar perdidas de crecimiento o deformaciones del fuste (Santolamazza y Cordero 1998). Incluso, defoliaciones continuas pueden causar la muerte de los arboles (Elliott y De Little 1984).

En Chile central, G. scutellatus se detecto por primera vez en 1998 en las regiones 5a y Metropolitana (Beeche 1999), y podria afectar el futuro de las 525.057 ha plantadas en el pais con eucaliptos (1NFOR 2006). En la actualidad esta plaga se ha desplazado hacia el norte (4a Region) como hacia el sur (regiones 7a y 8a) (SAG 2005).

G. scutellatus ha tenido una marcada preferencia por varias especies de Eucalyptus (Cordero y Santolamazza 2000). En Chile, la especie principal es E. globulus ssp. globulus (Labill., 1800). Otras especies plantadas de cierta importancia son E. virninalis (Labill., 1806) y E. camaldulensis (Den., 1832), en zonas aridas, y E. nitens ((Deane y Maiden) Maiden, 1913) en areas mas frias (INFOR 2006). En la zona de San Felipe, 5a

Region, G. scutellatus presenta entre tres y cuatro generaciones (Estay et al. 2002). Segun Klein y Waterhouse (2000), su importancia como plaga de los eucaliptos es superada solo por el taladrador del eucalipto, Phoracantha semipunctata (Fabricius, 1775) (Coleoptera: Cerambycidae).

Las caracteristicas morfologicas y bioquimicas de las plantas pueden causar alteraciones en el metabolismo de los insectos, y traducirse en cambios en la composicion de sus proteinas (Metcalf y Luckmann 1992), de forma que el conocimiento de estas variaciones es importante cuando se desean utilizar estrategias de tipo genetico en el Manejo Integrado de Plagas (MIP), pues puede revelar compuestos quimicos que sirvan como instrumento para alterar su comportamiento.

Los genes permanecen basicamente sin cambio de un ano a otro, pero las proteinas de las celulas varian segun su tipo, edad, genero, sanidad, y otras. La proteomica engloba tres actividades principales, la identificacion de todas las proteinas sintetizadas por una celula, tejido u organismo, la determinacion del modo en que interactuan, y el trazado de sus estructuras tridimensionales precisas (Ezzell 2002). Los resultados de las electroforesis de proteinas son caracteres fenotipicos que reflejan mucho mejor las diferencias geneticas entre especies o poblaciones que cuando se estudian los caracteres morfologicos. Por ello, la electroforesis en gel ha llegado a ser la herramienta mas valiosa para los estudios taxonomicos, sistematicos y evolutivos (Navas et al. 2002).

Esta investigacion se desarrollo con el objetivo de abordar desde el punto de las proteinas la reaccion de G. scutellatus frente a la alimentacion con distintas especies de eucaliptos, mediante una caracterizacion de perfiles electroforeticos del insecto y la busqueda posterior de proteinas marcadoras (PM) por densitometria de los geles, para indagar PM asociadas posiblemente a cambios fisiologicos del insecto, aportando con ello hacia su caracterizacion en el plano molecular y por ende hacia programas de MIP.

Materiales y Metodos

El material biologico se recolecto en arboles juveniles de E. globulus fuertemente infestados por G. scutellatus en el Sector El Tartaro, Comuna de Putaendo, Provincia de San Felipe (5a Region de Chile) (32[grados]32'30"S, 70[grados]43, 16"W). Las plantas se adquirieron.en el Vivero Antumapu de la Facultad de Ciencias Forestales de la Universidad de Chile, y se trasplantaron a macetas de Plastico de 18 cm de diametro con un substrato compuesto de arena, tierra de hoja y turba, tratado con fungicida Captan 2g/L y fertilizado con urea,

Perfiles electroforetieos de G. scutellatus alimentados con E. globulus. En una fase inicial de campo se recolectaron en forma periodica a fines de verano ejemplares adultos, pupas, larvas y huevos de G. scutellatus. Los insectos se mantuvieron en laboratorio, alimentando a las larvas y adultos con hojas frescas de E. globulus, previamente lavadas con hipoclorito de sodio al 15% (Cordero y Santolamazza 2000). Los huevos y las pupas se ubicaron en placas Petri; las larvas y los adultos se mantuvieron en cajas plasticas cerradas de 20 x 15 cm. Las crianzas se hicieron en el Laboratorio de Entomologia Forestal del Departamento de Silvicultura de la Facultad de Ciencias Forestales de la Universidad de Chile.

Se tomaron tres muestras de dos insectos por estado de desarrollo (huevo, larva, pupa y adulto) y se homogenizaron a 4[grados]C en buffer (TRIS-HC1 50mM pH 8,5, EDTA 5 mM, SDS 0,07%) con un inhibidor de proteasa FMS 0,1 mM. Esta homogenizacion se hizo forzando los insectos a pasar por un espacio estrecho entre un embolo de teflon y un recipiente de vidrio (Fleischer et al. 1979) y se centrifugaron 10 mina 1.250 G. Este material se refrigero inmediatamente y se almaceno a -20[grados]C. Luego estas muestras se maceraron y se les extrajeron las proteinas y determino su concentracion mediante el metodo de Bradford (1976). Los extractos de proteinas se utilizaron para determinar los perfiles electroforeticos mediante gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE), utilizando la tecnica de Laemmli (1970) y el protocolo de Bollag et al. (1996).

Perfiles electoforeticos de G. scutellatus alimentados con tres especies de eucalipto. En una segunda fase se caracterizaron electroforeticamente los perfiles de proteinas asociadas a G. scutellatus alimentados con tres especies de eucaliptos de importancia economicaen Chile y que presentan algun grado de susceptibilidad a la plaga; estos son: E. globulus, E. robusta (Sm., 1793) y E. camaldulensis.

Para caracterizar electroforeticamente los perfiles de proteinas de los insectos alimentados con cada una de las especies de eucalipto, se hizo un ensayo en una jaula (1,8 x 1,5 x 1,8 m) instalada bajo condiciones naturales de clima Mediterraneo e irrigacion periodica, donde se ubicaron plantas de un ano (cerca de 1 m de altura) de cada especie, las que se infestaron con dos larvas por planta (5-8 mm de longitud). Las plantas se protegieron con una bolsa de tul, para evitar su escape, con una abertura longitudinal con velcro para facilitar las evaluaciones. Las larvas permanecieron en cada una de las plantas hasta que pasaron a pupa; las larvas que murieron por manipulacion se reemplazaron por otras que se: encontraran en la misma fase de desarrollo.

Al finalizar el ensayo con larvas se desarrollo una segunda etapa, en la que se pusieron durante un mes dos insectos adultos en las mismas plantas utilizadas en la primera parte del ensayo, para su alimentacion sobre las mismas; los adultos que murieron antes del fin del ensayo se reemplazaron por otros en la misma fase de desarrollo.

Transcurrido un mes se tomaron muestras de larvas alimentadas con las diversas especies de eucalipto para hacer el analisis electroforetico de proteinas. De igual forma se tomaron muestras de los adultos. Los insectos se mantuvieron 24 h en placas Petri sin alimentarse para vaciar su tubo digestivo y se homogenizaron, refrigeraron y almacenaron con los mismos procedimientos senalados anteriomaente. Se maceraron varios insectos en cada muestra, cada uno de ellos alimentado con la misma especie de eucalipto. El diseno experimental para estos analisis electroforeticos tuvo dos factores de efecto fijo, el primero fue el nivel de desarrollo del insecto (larva o adulto) y el segundo, la especie de eucalipto; se realizaron tres repeticiones para cada nivel de desarrollo del insecto en cada una de las especies de plantas. Alas muestras de insectos adultos y larvas se les extrajeron las proteinas y determino su concentracion mediante los mismos protocolos ya mencionados.

Posteriormente, se analizaron los perfiles electroforeticos de proteinas de los insectos alimentados con las especies de eucalipto, en busca de PM mediante la determinacion de su posicion y los cambios en su concentracion y localizacion. La busqueda de dichas PM se hizo mediante densitometria de geles, usando el Software BioCaptMW (version 11.01, Microsoft, Redmond, EE.UU.) Para evaluar si existian diferencias significativas entre los resultados se hicieron pruebas de [Chi.sup.2] y analisis de variacion segun diseno bifactorial. Ademas se hizo un analisis de similitud entre las PM de G. scutellatus, mediante el algoritmo de UPGMA (Sneath y Sokal 1973), usando el indice de similitud 1-Pearson r, basado en la presencia o ausencia de PM en las muestras. Se uso el programa Statistica (1993).

Resultados y Discusion

Perfiles electroforeticos de G. scutellatus alimentados con E. globulus. La composicion proteica de los estados de desarrollo de G. scutellatus asociados a E. globulus se presenta en la Figura 1. Se observa una gran cantidad de bandas de proteinas en la zona comprendida entre 20 a 120 kDa, con excepcion de los huevos, los que presentaron un numero bajo y de pequena intensidad de proteinas. Las proteinas se hicieron mas numerosas a medida que los insectos se desarrollan. La composicion proteica de las pupas fue similar a la de las larvas, probablemente porque se trato de pupas recien formadas. Sin embargo, los perfiles de las larvas y adultos tuvieron grandes diferencias.

Perfiles electroforeticos de G. scutellatus alimentados con tres especies de eucalipto. Las larvas de G. scutellatus estan compuestas por un numero mayor de proteinas marcadoras que los adultos, independientemente de la alimentacion recibida, lo que indica que la composicion proteica de los insectos varia con su estado de desarrollo (Fig. 2). El mayor numero de PM en las larvas puede estar relacionado con los cambios en el insecto debido a su metamorfosis; sin embargo, el numero de proteinas de las larvas en E. globulus fue casi el mismo que el de los adultos, haciendo pensar que el aumento de las bandas en las larvas alimentadas con E. robusta y E. camaldulensis esta mas relacionado con la alimentacion que recibieron los insectos que con su metamorfosis.

La composicion proteica de las larvas alimentadas con E. globulus no difirio de la de los adultos alimentados con esta misma especie ([Chi.sup.2] calculado = 0,24, g. 1. = l, P = 0,05). Por otra parte, la composicion proteica de las larvas difirio de la de los adultos cuando los insectos se alimentaron con E. robusta y E. camaldulensis ([Chi.sup.2] calculado = 6,72, g. 1. = 1, P = 0,05), dado el mayor numero de proteinas exclusivas de las larvas frente al de los adultos (Figura 2). Esto parece indicar que las larvas de G. scutellatus son mas susceptibles a los cambios en su alimentacion, y modifican en mayor grado su composicion proteica por este factor.

[FIGURA 1 OMITIR]

En la Figura 2 se presentan las bandas de las proteinas que tuvieron variaciones en funcion de la alimentacion recibida, notandose que en los extractos de larvas hubo mayores cambios en proteinas que en los de adultos. Es importante resaltar que las bandas uno y dos se presentaron solo en adultos y las bandas tres, cinco y seis solo en larvas, independientemente de la alimentacion, por lo que serian utiles tanto para identificar el estado de desarrollo de un insecto en funcion de su alimentacion como para disenar tacticas de tipo genetico dentro del manejo integrado de plagas.

Como se menciono, las larvas de G. scutellatus alimentadas con E. robusta y E. camaldulensis parecieron ser mas susceptibles al cambio de alimentacion que los adultos, ya que solo en los extractos de larvas de estas dos especies se presentaron seis PM (proteinas siete, 21,23, 29, 31 y 32) (Fig. 2), causando que la composicion proteica de las larvas y adultos haya sido diferente. El analisis de conglomerados indico que existen diferencias entre las PM de G. scutellatus. Las PM de las larvas alimentadas por E. camaldulensis y E. robusta son mas cercanas y las mas alejadas son las de E. globulus. Las PM de los adultos alimentados con las tres especies de eucalipto se agruparon en otro conglomerado (Fig. 3).

Por otra parte, segun la cantidad de proteinas de las bandas se encontro que tanto el nivel de desarrollo del insecto (factor estado) como la alimentacion recibida (factor especie) influyeron en el area de las PM (F = 8,599; g. 1. = 2; P < 0,05). Las PM de las larvas presentaron un area mayor que las correspondientes a los adultos, lo que se debe a que las larvas tuvieron mas cambios en su composicion proteica. Respecto a las especies, las larvas alimentadas con E. robusta presentaron la mayor cantidad de proteinas, con una media diferente a la de las alimentadas con las otras dos especies de eucalipto bajo estudio; las diferencias de las larvas alimentadas con E. robusta se relacionan con la cantidad de proteinas que vario en las alimentadas sobre esta especie, especialmente en los extractos asociados a larvas. Hubo diferencias en las PM, en funcion tanto del estado de desarrollo (larva o adulto) como de la alimentacion recibida por los insectos, y las mayores modificaciones ocurrieron producto de la alimentacion con E. robusta ([Chi.sup.2] calculado = 5,23, g. 1. = 1, P = 0,05; F = 8,0; g. 1. = 2; P < 0,05).

Como se observa en la Figura 2, los adultos alimentados con E. robusta tuvieron los mayores cambios en composicion proteica, mientras que los alimentados con E. globulus y E. camaldulensis presentaron una variabilidad mucho menor. De las proteinas que variaron, tres se presentaron solo en E. robusta (proteinas 20, 26 y 34), una aparecio solamente en E. globulus (16), y una fue exclusiva de E. camaldulensis (24); estas proteinas serian utiles en la identificacion de adultos a nivel proteico, permitiendo discriminar que tipo de alimentacion han recibido. Las proteinas 26 y 33, exclusivas de E. robusta, podrian usarse para inferir los cambios en la composicion quimica de las larvas y adultos de G. scutellatus causados por su alimentacion sobre las plantas de esta especie.

La ausencia de las proteinas 14 (E. camaldulensis), 17 (E. globulus), 25 (E. globulus) y 27 (E. camaldulensis) en adultos (Fig. 2) es tambien un indicador de los cambios bioquimicos del insecto a causa de su alimentacion, y al igual que las proteinas que se presentan exclusivamente en un extracto, podrian usarse en su identificacion.

[FIGURA 2 OMITIR]

La distribucion proteica de los adultos en funcion de la alimentacion recibida no fue diferente ([Chi.sup.2] calculado = 5,23, g. 1. = 2, P = 0,05), lo que se debe a que el 37,5% de las proteinas difirio entre los extractos. Cuando la prueba se aplico solo a las PM, se encontraron diferencias entre los extractos ([Chi.sup.2] calculado = 14,24, g. 1. = 2, P = 0,05), las que se relacionan con el numero de proteinas que vario en los adultos alimentados con E. robusta, ya que los extractos provenientes de los insectos alimentados con las otras dos especies tuvieron la misma cantidad de PM.

Al observar la participacion porcentual de las proteinas respecto al area relativa de los geles (Fig. 4), la proteina uno, proveniente de los extractos de larvas, presento el area mayor (14,47%), seguida de las proteinas 23 (9,65%) y 30 (8,79%). Estas bandas se presentaron en todos los extractos, independientemente de la alimentacion. Las bandas restantes tuvieron cantidades de proteinas inferiores a 5%. Otro hecho importante es que las PM de las larvas tuvieron areas similares a las que no lo fueron, con porcentajes que oscilan desde 1,38% en la banda 11 hasta 4,19% en la 27. Esto indica que a pesar que no estuvieron presentes en todas las especies, la cantidad de proteinas en estas bandas no fue despreciable.

El area de las proteinas de las larvas difirio significativamente y la interaccion entre las proteinas y las especies tambien fue significativa; sin embargo, no hubo diferencias en el area cuando el factor evaluado fue la especie objeto de alimento de las larvas (F = 12,53; g. 1. = 2; P < 0,05). En los adultos, la banda 23 tuvo la mayor cantidad de proteinas (22,06%), seguida de la banda dos (8,74%), la 24 (7,24%) y la cuatro (7,15%). Respecto de las PM de los adultos, la que obtuvo el porcentaje mayor fue la banda 21 (5,73%). Las PM restantes tuvieron valores similares a las que no presentaron variaciones, lo que indica que su participacion en los geles no fue despreciable.

[FIGURA 3 OMITIR]

Segun el analisis de variacion para los extractos de adultos hubo una diferencia significativa entre las proteinas (F = 28,35; g. 1. = 2; P < 0,05), relacionada con su posicion en el gel (masa molar), y una interaccion entre las proteinas y las especies. Estos resultados son equivalentes a los obtenidos en los extractos proteicos de las larvas. Por otra parte, hubo diferencia en las PM de los adultos de G. scutellatus producto de su alimentacion (F = 16,87; g. 1. = 2; P < 0,05). Las diferencias en este factor se debieron a la mayor variacion en la composicion proteica de los adultos cuando se alimentaron con E. robusta, ya que las otras dos especies tuvieron el mismo numero de PM.

La presencia o ausencia de bandas en los extractos proteicos de G. scutellatus puede deberse a la composicion quimica de las hojas, lo que hace que el insecto reaccione ante la alimentacion recibida (Dermott et al. 1996). En este sentido, la constitucion de los aceites esenciales en las especies de Eucalyptus puede causar diferencias en la susceptibilidad al dano de un insecto en particular, las que pueden verse reflejadas en la composicion quimica de los insectos (Floyd y Foley 2001). Kessler y Baldwin (2002) indican que la funcion de los metabolitos secundarios de las plantas es actuar especificamente contra la infestacion de insectos, haciendo que se reduzca su dano. Por lo tanto, estos elementos podrian estar influyendo tambien en la composicion proteica encontrada en los extractos.

Conclusiones

Este estudio contribuye al Manejo Integrado de Plagas de este insecto, a traves del conocimiento de la composicion de las proteinas de G. scutellatus alimentados con diferentes especies de eucalipto, obteniendo proteinas marcadoras para las larvas y adultos. Estas proteinas estan asociadas posiblemente con patrones metabolicos relacionados con el consumo de las plantas hospederas. Los cambios en la dieta del insecto podrian estar asociados con las proteinas marcadoras, indicando una habilidad diferente de G. scutellatus para poder usar las plantas hospederas.

[FIGURA 4 OMITIR]

Agradecimientos

Los autores agradecen al Proyecto DID 1-02/6-2 <<Resistencia de distintas especies de Eucalyptus spp. frente al ataque del gorgojo del eucalipto (Gonipterus scutellatus, Coleoptera: Curculionidae)>>, financiado por la Direccion de Investigacion de la Universidad de Chile.

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AMANDA HUERTA F. (1) *, ITALO CHIFFELLE G. (2) , MARYI SERRANO G. (1) , TATIANA VASQUEZ T. (1)

(1) * Correspondencia: Dra. Amanda Huerta, Departamento de Silvicultura, Facultad de Ciencias Forestales, Universidad de Chile. Av. Santa Rosa 11315, La Pintana. Casilla 9206. Santiago-Chile. ahuerta@uchile.cl, ahuertaf@gmail.com

(2) Departamento de Agroindustria y Enologia, Facultad de Ciencias Agronomicas, Universidad de Chile. Av. Santa Rosa 11315, La Pintana. Casilla 1004. Santiago-Chile. ichiffel@uchile.cl

Recibido: 9-sep-2006 * Aceptado: 8-oct-2007
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Author:Huerta T., Amanda; Chiffelle G., Italo; Serrano G., Maryi; Vasquez T., Tatiana
Publication:Revista Colombiana de Entomologia
Date:Jul 1, 2007
Words:4748
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