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PRUEBAS DE IDENTIDAD Y PATERNIDAD EN GANADO BRAHMAN REGISTRADO DE COSTA RICA.

Identity and parentage testing in registered Brahman cattle of Costa Rica.

INTRODUCCION

El hato bovino costarricense esta compuesto por 1 278 817 animales, de los cuales un 42,1% se clasifica como ganado de carne (INEC 2015). En los sistemas de ganado de carne el tipo racial predominante es el cebu y la raza mas comun es la Brahman (CORFOGA 2012). La raza Brahman predomina en el 39,7% de las fincas ganaderas del pais (CORFOGA 2012).

Debido a la importancia de esta raza, desde hace varios anos se creo el Programa Nacional de Evaluacion y Mejoramiento Genetico de la raza Brahman en Costa Rica, que tiene por objetivo identificar y promover el uso de los animales geneticamente superiores (Cruz Mendez 2015), ya que como etapa previa a la implementacion de planes de mejora genetica, es importante conocer la integridad de la informacion genealogica presente en las explotaciones ganaderas (Dominguez et al. 2012, Cruz Mendez 2015).

El analisis de ADN basado en marcadores microsatelite de tipo STR ha constituido el sistema internacional estandar de verificacion de identidad y parentesco en diferentes especies, bajo los lineamientos sugeridos por la Sociedad Internacional para la Genetica Animal (ISAG 2014). Recientemente los marcadores de tipo SNP son tambien utilizados con exito para este fin (ISAG 2014).

Para fines de verificacion de identidad, la utilidad de un conjunto de marcadores microsatelite puede medirse mediante la probabilidad de identidad combinada, que se define como la probabilidad de que 2 individuos seleccionados aleatoriamente dentro de una poblacion presenten genotipos identicos para los loci en cuestion (Waits et al. 2001). Esta probabilidad depende del numero de alelos y la distribucion de frecuencia de estos alelos en la poblacion bajo estudio (Ichikawa et al. 2001, Curi y Lopes 2002). En pruebas de verificacion de identidad, generalmente se requiere que los marcadores utilizados provean en probabilidad de identidad combinada menor que 0,00001.

En relacion con el analisis de paternidad, se utilizan diferentes enfoques estadisticos (Jones et al. 2010). Entre los 2 enfoques mas utilizados en la practica estan el de "principio de exclusion" y el de "indices de verosimilitud".

En el enfoque basado en exclusion los genotipos de los padres candidatos se comparan con el genotipo de la progenie y se tiene en cuenta el genotipo del otro progenitor, si esta disponible. Los padres candidatos se excluyen como padres si se producen discordancia en al menos 2 loci (Jones et al. 2010). El poder especifico de cada microsatelite para excluir un individuo dentro de un conjunto aleatorio de padres potenciales se mide en terminos de su probabilidad de exclusion (Ichikawa et al. 2001). Se requiere que el conjunto de microsatelites utilizado garantice una probabilidad de exclusion combinada mayor de 99,9%.

En el segundo enfoque para cada padre seleccionado y cada locus, se calcula la razon de verosimilitud (likelihood ratio- LR, Jones et al. 2010), que indica la posibilidad que tiene el individuo de ser el padre o no. El logaritmo natural del producto de las LR obtenidas para todos los loci (Score LOD) es una medida que permite comparar entre varios padres potenciales.

El presente estudio tiene por objetivo implementar el uso de pruebas de ADN por microsatelites con fines de identificacion y verificacion de paternidad en ganado bovino registrado de raza Brahman en Costa Rica.

MATERIALES Y METODOS

Procedencia y procesamiento de las muestras

Para el calculo de los parametros geneticos poblacionales, se conto con un total de 950 muestras de pelo de animales Brahman (7 sementales, 788 vacas, 155 crias) registrados en la Asociacion de Criadores de Ganado Cebu de Costa Rica. Estas muestras fueron recolectadas durante 2015 y 2016, y procedieron de 13 hatos voluntarios entre los 17 participantes en el Programa Nacional de Evaluacion Genetica de la raza Brahman (Cruz Mendez 2015).

El material de muestreo consistio en foliculos pilosos de la raiz de la cola del bovino, arrancados manualmente mediante un solo movimiento rapido y continuo a contrapelo, se siguieron las recomendaciones de Cordero et al. (2013). Se corroboro que las muestras fueran de pelo seco, libre de excrementos y orina. Estas muestras fueron colocadas en sobres individuales con la informacion del animal y el hato de procedencia.

La extraccion del ADN fue realizada en el Laboratorio de Bioseguridad del LANASEVE del Servicio Nacional de Salud Animal del estado (SENASA); se seleccionaron aproximadamente 30 pelos de la cola con foliculo, segun el procedimiento descrito por Cordero et al. (2013).

La amplificacion de ADN por PCR se realizo utilizando el kit Thermo Scientific[TM] Bovine Genotypes Panel 3.1. Este kit incluyo un total de 18 marcadores, 12 de los cuales corresponden a los recomendados por ISAG (FAO 2011) para uso en pruebas de parentesco en bovinos (BM1818, ETH10, TGLA122, BM2113, SPS115, BM1824, INRA023, TGLA126, TGLA53, ETH3, ETH225, TGLA227). El kit incluyo otros 6 marcadores adicionales (CSSM66, ILSTS006, CSRM60, SPS113, MGTG4B y RM067). El cromosoma de localizacion de cada marcador, el rango del tamano de los alelos y la secuencia de los cebadores que los delimitan se detallan en Campos (2017).

Los productos de la amplificacion fueron sometidos a electroforesis capilar al utilizar un analizador genetico ABI 3130, segun el procedimiento descrito por Cordero et al. (2013). Los polimorfismos de los microsatelites fueron discriminados de acuerdo con sus patrones de fluorescencia y tamano. Los datos se visualizaron e identificaron mediante el software GeneMapper v3.0 (Applied Byosistems 2002).

Estimacion de parametros geneticos poblacionales

Los perfiles geneticos obtenidos en el paso anterior fueron analizados mediante el programa Cervus (Marshall et al. 1998, Kalinowski et al. 2007) y se obtuvieron los siguientes parametros geneticos poblacionales: el numero total de alelos por marcador (Na), el numero efectivo de alelos (Ne = 1/[suma][p.sup.2], con p = frecuencias alelicas por marcador), la heterocigosidad observada (Ho, obtenida como la proporcion de individuos heterocigoticos en la muestra), la heterocigosidad esperada (He = 1 - [[suma].sup.n.sub.i] = 1 [P.sup.2.sub.1]); el indice de fijacion (F = 1 - Ho/He), y el contenido de informacion polimorfica (CIP = 1 - [[suma].sup.n.sub.i] = 1 [P.sup.2.sub.1] - ([[suma].sup.n.sub.i] = 1 [[suma].sup.n.sub.j] = i = 1 2[p.sup.2.sub.i][p.sup.2.sub.j]) Ademas, se evaluo la hipotesis de equilibrio Hardy-Weinberg al utilizar la prueba Chi-cuadrado y se obtuvo un estimado de la frecuencia de alelos nulos (Summers y Amos 1997).

Probabilidades de identidad y exclusion

Para evaluar la eficiencia del set de marcadores como herramienta para pruebas de verificacion de identidad y paternidad en la poblacion Brahman local, se obtuvieron estimados de Probabilidad de Identidad (PI y [PI.sub.SIBS]) para cada locus mediante el modulo de identidad del programa Cervus (Marshall et al. 1998, Kalinowski et al. 2007). PI se obtiene a partir de la formula segun Waits et al. 2001

PI = [n.suma de (i=1)] [([p.sup.2.sub.i]).sup.2] + [n.suma de (i=1)] [n.suma de (j=i+1)] [(2 [p.sub.i] [p.sub.j]).sup.2]

Se interpreta como la probabilidad de que 2 individuos seleccionados aleatoriamente en la poblacion presenten genotipos identicos para un locus.

[PI.sub.SIBS] se obtiene como:

[PI.sub.SIBS] = 0,25 + (0,5 [n.suma de (i=1)] [p.sup.2.sub.i]) + 0,5 [([n.suma de (i=1)] [p.sup.2.sub.i]).sup.2]] - (0,25 [n.suma de (i=1)] [p.sup.4.sub.i])

Se interpreta como la probabilidad de que 2 hermanos completos seleccionados en la poblacion presenten genotipos identicos para un locus. PISIBS es un estimado mas conservador recomendado en poblaciones consanguineas o con desviaciones marcadas del equilibrio Hardy Weinberg.

La Probabilidad de Identidad Combinada (PIC) para el set de marcadores se calculo como el producto de las PI especificas de cada marcador.

Seguidamente, se calculo la probabilidad de exclusion (Jamieson y Taylor 1997), definida como la probabilidad de que un individuo seleccionado aleatoriamente de la poblacion sea excluido como potencial padre de una cria. Esta probabilidad se obtuvo para los siguientes 3 casos de evaluacion de paternidad:

a) [PE.sub.1P]: Un padre candidato, otro padre conocido, calculado como

[PE.sub.1P] = 1 - 2 [suma] [p.sup.2.sub.i] + [suma] [p.sup.3.sub.i] + 2 [suma] [p.sup.4.sub.i] - 3 [suma] [p.sup.5.sub.i] - 2[([suma] [p.sup.2.sub.i]).sup.2] + 3 [suma] [p.sup.2.sub.i] [suma] [p.sup.3.sub.i],

b) [PE.sub.2P]: Un padre candidato, otro padre desconocido, obtenido como:

[PE.sub.2P] = 1 - 4 [suma] [p.sup.2.sub.i] + 2 [([suma] [p.sup.2.sub.i]).sup.2] + 4[suma] [p.sup.3.sub.i] - 3 [suma] [p.sup.4.sub.i],

c) [PE.sub.PP]: Par de padres candidatos:

[PE.sub.PP] = 1 + 4 [suma] [p.sup.4.sub.i] + 4 [suma] [p.sup.5.sub.i] - 3 [suma] [p.sup.6.sub.i] - 8 [([suma] [p.sup.2.sub.i]).sup.2] + 8 ([suma] [p.sup.2.sub.i])([suma] [p.sup.3.sub.i]) + 2 [([suma] [p.sup.3.sub.i]).sup.2].

El calculo de Probabilidades de Exclusion Combinadas (PEC) para el set completo de marcadores se realizo mediante la formula:

[expresion matematica irreproducible].

Verificacion de paternidad en 3 hatos

Una vez confirmada la eficiencia del set de marcadores, se realizo una evaluacion de la integridad de las paternidades reportadas en 3 de los hatos, segun anuencia de sus propietarios, para lo cual se conto con los perfiles geneticos de 155 crias, entre las cuales 118 contaron con el perfil genetico de ambos padres, 19 contaron solo con el perfil genetico de sus madres y los 18 restantes contaron solo con el perfil de genetico de sus padres. Para estos casos, los perfiles geneticos fueron comparados mediante el modulo Par de Padres con Sexo Conocido del programa Cervus (Marshall et al. 1998, Kalinowski et al. 2007) y se contabilizaron los casos de discordancias de genotipo entre progenie vs. padres candidatos.

Para cada padre candidato y cada locus se obtuvo un estimado de la razon de verosimilitud LR = x/p, donde x es la probabilidad de transmision del alelo obligado (1 para homocigotas y 0,5 para heterocigotas) y p es la frecuencia de la variante alelica respectiva. La existencia de padres conocidos permitio la identificacion de los alelos obligados. LR se interpreta como cuantas veces mas (o menos) posibilidad tiene el padre candidato de ser el verdadero padre de la cria que de no serlo. LR se ajusto, ademas, por la tasa de error de genotipado, estimada a partir del analisis de discordancias padres vs. progenie.

Finalmente, se calculo el Score LOD, calculado como el logaritmo natural del producto de las LR de todos los loci. Este score permite discriminar entre varios padres potenciales, aun en presencia de errores de genotipado. Los Score LOD fueron cotejados contra distribuciones de probabilidad obtenidas a partir de simulacion por remuestreo (Boostrapping), con el fin de determinar el nivel de confianza logrado en la asignacion de las paternidades. Se asumieron parametros de simulacion en funcion de las caracteristicas de la poblacion analizada, entre ellos: tasa de error de genotipado: 7%, madres candidatas: 118, padres candidatos: 7, porcentaje de padres y madres genotipados: 75%, parentesco entre padres verdaderos: 3%, proporcion de la poblacion consanguinea: 10%. El tamano de progenie simulada fue de 100000 individuos, segun lo sugerido por Marshall et al. (1998) y Kalinowski et al. (2007). Se obtuvieron los valores criticos de LOD para rechazo de paternidad con niveles de 95 y 99% de confianza y se compararon los porcentajes de rechazo de paternidad de los 3 hatos mediante prueba de chi-cuadrado y comparaciones pareadas de proporciones.

RESULTADOS Y DISCUSION

Parametros de diversidad alelica

El promedio de alelos observados por marcador fue de 11,5 (Cuadro 1), el cual oscila entre 6 (BM1824, ETH10) y 17 (SPS113). Muchos alelos se presentaron en frecuencias muy bajas (<1%), por lo que el promedio efectivo de alelos por marcador fue de solo 3,76. El numero de alelos observados es menor al reportado por estudios similares, por ejemplo 14,2 (Hernandez et al. 2009), 13,9 (Gomez et al. 2013) o 12 (Martinez et al. 2015). Esto se debe probablemente a los mayores tamanos de muestra utilizados en dichos estudios, lo que permitio identificar alelos suplementarios, y tambien, a la mayor heterogeneidad racial de dichas poblaciones, ya que incluyeron animales no registrados de poblaciones comerciales.

La heterosis observada fue menor que la esperada para casi todos los marcadores, con excepcion de INRA23 y SPS115 (Cuadro 1). Los promedios de heterosis observada y esperada fueron de 0,67 y 0,70, respectivamente. Las desviaciones (Ho-He) oscilaron entre 0 (TGLA122) y 0,13 (TGLA126). El indice de fijacion (F) oscilo entre -0,02 (INRA23 y SPS115) y 0,16 (ILSTS006), con un promedio 0,04. Esto sugiere una tendencia a la consanguinidad en la poblacion analizada, lo cual es de esperar en una poblacion de animales registrados altamente emparentados, sometidos a seleccion y con apareamientos dirigidos (Cervini et al. 2006, Gomez et al. 2013). Es probable que estas mismas razones causaran que la prueba de equilibrio Hardy-Weinberg fuera significativa para 9 de los 18 marcadores (Cuadro 1).

Todos los marcadores utilizados estuvieron en la categoria de altamente informativos (CIP>0,5), a excepcion del marcador ETH225 (CIP=0,44), considerado medianamente informativo (Cuadro 1). Los demas marcadores se encontraron en el rango de CIP entre 0,53 (BM1824) y 0,88 (TGLA122), con un promedio de 0,66. Estudios previos en animales de registro reportaron promedios de CIP muy similares, tales como 0,64 (Cervini et al. 2006), 0,66 (Hernandez et al. 2009) o 0,65 (Gomez et al. 2013). Otros estudios en poblaciones comerciales reportaron valores superiores, tales como 0,70 (Carolino et al. 2009), 0,72 (Stevanovic et al. 2010) o 0,75 (Martinez et al. 2015). Esto puede ir ligado a la mayor heterogeneidad racial presente en dichas poblaciones.

La frecuencia promedio de alelos nulos fue de 0,02 (Cuadro 1), con los valores mas altos para BM1818 (7%) y ILSTS006 (9%). De acuerdo con Cervini et al. (2006), altas frecuencias (>5%) de alelos nulos pueden causar tambien una deficiencia de heterocigosidad y desviaciones aparentes del equilibrio de Hardy-Weinberg en los loci. Asimismo, en las pruebas de parentesco pueden dar origen a falsos negativos en la asignacion de padres y madres.

Probabilidades de identidad y exclusion

Mediante el uso combinado de los 18 marcadores se obtuvieron valores de PIC de 2,4 x [10.sup.17] y 2,6 x [10.sup.-7] (Cuadro 1). Los loci con mayor poder discriminatorio, o sea menor PI, fueron TGLA122 y TGL126, que a su vez fueron los que presentaron mayor heterocigosidad y CIP. Por el contrario, el locus de menor poder discriminatorio fue ETH225, para el cual existio un alelo altamente predominante con frecuencia de 0,70. Es importante senalar que la informatividad de un marcador puede variar en funcion de la raza. En un estudio previo a nivel local, que incluyo diversos tipos raciales (Cordero et al. 2015), el marcador ETH225 mostro una distribucion mas homogenea de sus alelos, con un valor de 0,29 para el alelo mas frecuente y un valor de CIP de 0,79, muy superior al 0,44 obtenido en el presente estudio.

En cuanto a las probabilidades de exclusion, los resultados indicaron que los loci con mayor poder de exclusion fueron nuevamente TGLA122 y TGL126, y el de menor poder el ETH225 (Cuadro 1). Las probabilidades de exclusion combinadas fueron en todos los casos mayores a 0,999, por lo que son consideradas satisfactorias para pruebas de paternidad.

En un estudio previo a nivel local se reporto una PEC de 0,999 con el uso de 18 marcadores en animales comerciales de diferentes caracteristicas raciales (Cordero et al. 2013). Otros estudios similares en la raza Brahman reportan valores semejantes, tales como 0,999 (Riojas et al. 2009) y 0,993 (Gomez et al. 2013), con el uso de 11 y 8 marcadores, respectivamente. Algunos estudios en otras razas reportaron valores de PEC que variaron de 0,842 a 0,999 al utilizar entre 6 a 10 marcadores microsatelite (Baron et al. 2002, Curi y Lopes 2002, Visscher et al. 2002, Carolino et al. 2009). En todos los estudios se reitera la importancia del uso de los marcadores con mayor poder discriminatorio, ya que al descartar marcadores de baja informatividad, se puede aumentar la PEC con un menor numero de marcadores. En el caso especifico del presente estudio, el marcador ETH225 fue de poca utilidad por su bajo poder discriminatorio.

Analisis de discordancias por locus

En el analisis de discordancias por locus se observo que un 66% (38/58) y un 50% (24/48), de los genotipos discordantes en madres y padres reportados, respectivamente, podrian ser atribuidos a alelos nulos (Cuadro 2). La tasa promedio de error de genotipado fue alta (10,8 y 9%), no obstante, es probable que este sea un valor sobreestimado, ya que en su calculo se asume que los padres conocidos han sido identificados con 100% de certeza (Marshall et al. 1998, Kalinowski et al. 2007). Algunos loci presentaron estimados de tasas de error de genotipado [mayor que o igual a] 15%, tales como: BM1818, ETH225, ETH3, TGLA227, y TGLA53. Las variables tasas de error de genotipado entre loci sugieren que puede haber un subconjunto de loci que no se puede genotipar con fiabilidad, o que pueden tener alelos nulos segregandose en frecuencias moderadas o altas (Marshall et al. 1998, Kalinowski et al. 2007). En estos casos, una alternativa es omitir del analisis de parentesco estos loci (Marshall et al. 1998, Kalinowski et al. 2007).

Las tasas de error para ambos casos, padre o madre conocida, fueron distintas para algunos loci (BM1818, ETH225, ETH3, MGTG4B, RM067, TGLA227). Esto podria deberse a la gran diferencia entre el numero de padres (n=7) y madres (n=137) incluidos en el presente estudio, asi como a la gran heterogeneidad en las distribuciones alelicas de distintos loci. Por otra parte, la estimacion de la tasa de error de genotipado puede verse sesgada por falta de independencia (Marshall et al. 1998, Kalinowski et al. 2007). Una causa obvia de no independencia ocurre cuando existe descendencia multiple de un mismo padre, hecho que sucedio en el presente estudio con los sementales.

Analisis de paternidad por exclusion

El analisis de paternidad por exclusion permitio identificar un 58% de perfiles perfectamente compatibles en el caso de madre vs. progenie y 65% en el caso de padre vs. progenie (Cuadro 3). En el caso de trios (padre vs. madre vs. progenie) solo un 35% de los casos presento compatibilidad perfecta. Es importante notar que la mayoria de discordancias involucraron solo 1 o 2 loci. Se aprecia nuevamente que un gran numero de estas discordancias podrian ser atribuidas a alelos nulos. Los estudios de exclusion requieren al menos 2 loci discordantes entre el candidato y la descendencia para dar cuenta de los errores de tipificacion o mutaciones (Jones et al. 2010). En presencia de altas tasas de error y alelos nulos, los casos de una o 2 discordancias probablemente son casos de paternidades correctas, donde las discordancias son causadas por los factores mencionados. Por el contrario, los casos con 3 o mas discordancias es mas probable que se deban a paternidades incorrectamente reportadas o errores en la identificacion de las muestras, ya sea a nivel de campo o en el proceso de laboratorio (Marshall et al. 1998, Kalinowski et al. 2007).

Al aplicar el criterio de exclusion basado en al menos 2 loci discordantes (Jones et al. 2010), los porcentajes de rechazo de paternidad en el presente estudio fueron altos, con valores de 18,2% en las madres, 14,0% en los padres y 34,6% en los trios. Los resultados reportados por estudios similares son variables. Carolino et al. (2009) reportaron paternidades erroneas, con discordancia en 2 o mas loci, de 14% en madres y 7% en padres. Se han reportado tasas mas altas de paternidades erroneas en ganado Gyr de Brasil (Curi y Lopes 2002), con 27,5% de rechazo en las paternidades (padre vs progenie vs. madre). Baron et al. (2002), reportaron una tasa de identificacion erronea (padre vs. progenie) de 36% y 22% en al menos 1 o 2 marcadores, respectivamente. Por otra parte, Rehout et al. (2006) reportaron porcentajes de paternidad erronea en ganado Holstein de 10,7%.

Existen varios factores que pueden causar discordancia entre perfiles geneticos de padres y progenie, entre los que se mencionan: el registro inadecuado de los animales al momento de la paricion, la identificacion incorrecta del semen, mal control visual de montas o inseminacion artificial y la mala asignacion de padres por uso de multiples toros en grupos de cria (Baron et al. 2002, Carolino et al. 2009).

Analisis de paternidad por indices de verosimilitud

En el analisis basado en indices de verosimilitud se observo que los promedios de score LOD disminuyeron conforme aumento el numero de loci discordantes, hasta tomar valores negativos (Cuadro 3). Un valor negativo significa que la probabilidad de paternidad incorrecta es mayor que la de paternidad correcta. En el caso de los padres 3 discordancias fueron suficientes para producir LOD negativos, mientras que en las madres el numero requerido fue de 4 y en los trios se incremento hasta 8. Esto refleja que el principio de exclusion basado en al menos 2 loci discordantes puede ser insuficiente en algunos casos de discriminacion de paternidad.

La evaluacion de paternidades mediante valores criticos de LOD mostro que, aun con un nivel de confianza de 95%, existio un alto porcentaje de paternidades rechazadas (Cuadro 4), es decir, probablemente incorrectas. El porcentaje de paternidades rechazadas en madres (24,1%) practicamente duplico el de los padres (12,5%). En el caso de las madres, el criterio de rechazo de paternidad basado en valores criticos de LOD (24,1% de rechazo, confianza 95%) resulto ser mas estricto que el basado en el criterio de exclusion (18,2% de rechazo, [mayor que o igual a] 2 discordancias). Se detectaron 10 casos de incongruencias entre ambos metodos, de los cuales 9 correspondieron a situaciones donde se acepto la maternidad cuando se utilizo el criterio de exclusion, mientras que se rechazo al utilizar el valor critico de LOD (95%). Estas diferencias se deben a que el principio de exclusion no toma en cuenta las frecuencias de los alelos discordantes, los errores de genotipado o la probabilidad de transmision de los alelos obligados.

En el caso de los padres ambos criterios produjeron resultados muy similares (14% vs. 12,5% de rechazo), con solo 2 casos de resultados incongruentes, ambos rechazados por el principio de exclusion y aceptados por el criterio LOD. En los trios se observo que el criterio basado en exclusion fue mas estricto (34,6% rechazo) que el basado en valores criticos de LOD (26,3% rechazo, 95% confianza). Se identificaron 18 casos incongruentes, de los cuales 14 se rechazaron mediante el criterio de exclusion, mientras que se aceptaron al utilizar el valor critico de LOD (95%).

El analisis de paternidades rechazadas por hato, basado en valores criticos LOD, demostro que el hato 1 presento menores porcentajes de rechazo (Cuadro 5). La mayor proporcion de rechazos en los casos madre vs. progenie se dieron en el hato 3, mientras que en los casos padre vs. progenie el mayor problema se presento en el hato 2. Para los trios las diferencias no fueron significativas, pero la tasa de rechazo tendio a ser mayor en los hatos 2 y 3. En el hato 2 la proporcion de casos rechazados es alta tanto en madres como padres, mientras que en los hatos 1 y 3 el problema solo se observa en las madres. Un estudio similar en 4 hatos de ganado Boran (Kios et al. 2012) reporto bajas tasas de rechazo, entre 0 y 5%, para los casos madre vs. progenie, mientras que en los casos padre vs. progenie las tasas de rechazo variaron desde 4,3 hasta 80%.

En el presente estudio, las diferencias observadas entre hatos pueden estar ligadas a distintos niveles de eficiencia y rigurosidad tanto en el control de los apareamientos como en la toma de los registros. En el caso del hato 1, se comprobo que existe un mayor nivel de supervision, lo que es consistente con los menores porcentajes de paternidades rechazadas. En el hato 2 se comprobo que el nivel de supervision es menor, el manejo del hato es mas extensivo y se utiliza la monta natural en la mayoria de los apareamientos. Esto puede explicar los altos porcentajes de rechazo en padres vs. progenie, probablemente asociados a la falta de control al reportar los padres o al momento de las montas.

Por ultimo, se comprobo que el hato 3, aunque cuenta con profesionales a cargo, tiene una menor supervision y orden en el manejo de los registros. Ademas, en este hato existe un lote de vacas que presentan problemas para la obtencion de pedigries de sus crias por falta de actualizacion de la informacion en la asociacion.

En conclusion, los resultados obtenidos reflejan que el set de marcadores utilizado provee una capacidad discriminatoria satisfactoria para fines de verificacion de identidad y parentesco. La verificacion de paternidad mediante criterios de exclusion basados en un minimo de 2 loci discordantes puede ser insuficiente en algunos casos, ya que no considera la frecuencia de los alelos implicados en la poblacion. En este sentido, los indices de verosimilitud tienen mayor poder discriminatorio, puesto que consideran las frecuencias alelicas y las probabilidades de transmision, al ser mas utiles sobre todo cuando se trata de excluir entre varios padres potenciales. Los resultados hacen ver, ademas, la necesidad de implementar en los hatos mejores mecanismos de control en los apareamientos y en la toma de registros genealogicos.

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Jorge Campos *, Bernardo Vargas (1)/*, Jorge Camacho *, Argerie Cruz **

Recibido: 03/07/17 Aceptado: 13/09/17

(1) Autor para correspondencia. Correo electronico: bernardo.vargas.leiton@una.cr

* Universidad Nacional, Posgrado Regional en Ciencias Veterinarias Tropicales, Costa Rica.

** Instituto Nacional de Innovacion y Transferencia en Tecnologia Agropecuaria, Costa Rica.
Cuadro 1. Parametros de diversidad alelica (Na,Ho,He,F,CIP) (1),
frecuencia estimada de alelos nulos (f-Nul), valor de significancia
de la prueba Hardy-Weinberg (2), probabilidades de identidad
([PI/PI.sub.SIBS]) (3) y probabilidades de exclusion ([PE.sub.1P]
[PE.sub.2P] y [PE.sub.PP]) (4) para cada uno de los 18 marcadores
microsatelite en una muestra de 950 individuos de la poblacion de
ganado Brahman registrado de Costa Rica.

Locus        Na     Ho     He       F    CIP    f-Nul   HW

BM1818       11    0,68   0,77   0,13    0,74   0,07    ***
BM1824        6    0,58   0,61   0,04    0,53   0,02    NS
BM2113       12    0,74   0,75   0,01    0,72   0,00     *
CSRM60       13    0,65   0,69   0,06    0,67   0,03    ***
CSSM66        9    0,71   0,74   0,04    0,71   0,02    NS
ETH10         6    0,65   0,66   0,02    0,60   0,01    NS
ETH225       11    0,46   0,48   0,03    0,44   0,01    ***
ETH3         12    0,59   0,62   0,05    0,54   0,03    NS
ILSTS006     14    0,55   0,65   0,16    0,60   0,09    ***
INRA23       11    0,80   0,78   -0,02   0,75   -0,01   NS
MGTG4B       11    0,77   0,78   0,00    0,75   0,00    NS
RM067         8    0,51   0,57   0,10    0,53   0,05    ***
SPS113       17    0,68   0,71   0,04    0,67   0,02    **
SPS115       13    0,76   0,74   -0,02   0,70   -0,01   NS
TGLA122      16    0,89   0,89   0,00    0,88   0,00    NS
TGLA126      12    0,79   0,82   0,04    0,80   0,02     *
TGLA227       9    0,62   0,65   0,04    0,59   0,02    NS
TGLA53       16    0,64   0,69   0,08    0,65   0,04    ***
Promedio    11,5   0,67   0,70   0,04    0,66   0,02
Combinada

Locus                      PI       [PI.sub.SIBS]    [PE.sub.1P]

BM1818                   0,08                0,38          0,57
BM1824                   0,23                0,51          0,33
BM2113                   0,09                0,40          0,56
CSRM60                   0,12                0,43          0,49
CSSM66                   0,10                0,40          0,53
ETH10                    0,17                0,46          0,40
ETH225                   0,31                0,59          0,27
ETH3                     0,22                0,50          0,35
ILSTS006                 0,17                0,47          0,41
INRA23                   0,08                0,38          0,59
MGTG4B                   0,08                0,38          0,58
RM067                    0,23                0,52          0,35
SPS113                   0,12                0,43          0,49
SPS115                   0,11                0,41          0,52
TGLA122                  0,02                0,31          0,77
TGLA126                  0,05                0,35          0,65
TGLA227                  0,18                0,47          0,39
TGLA53                   0,14                0,44          0,46
Promedio
Combinada   2,4 x [10.sup.-17]   2,6 x [10.sup.-7]      > 0,999

Locus       [PE.sub.2P]   [PE.sub.PP]

BM1818            0,39          0,76
BM1824            0,19          0,49
BM2113            0,37          0,76
CSRM60            0,30          0,70
CSSM66            0,35          0,72
ETH10             0,24          0,58
ETH225            0,12          0,43
ETH3              0,21          0,51
ILSTS006          0,25          0,59
INRA23            0,41          0,79
MGTG4B            0,40          0,78
RM067             0,18          0,53
SPS113            0,31          0,69
SPS115            0,34          0,71
TGLA122           0,63          0,92
TGLA126           0,48          0,83
TGLA227           0,23          0,57
TGLA53            0,29          0,65
Promedio
Combinada      > 0,999       > 0,999

(1) Na= Numero total de alelos, Ho= Heterocigosis observada, He=
Heterocigosis esperada, F= Indice de fijacion, CIP=contenido de
Informacion Polimorfica.

(2) Significancia estadistica: NS=no significativo, * p<0,05, **
p<0,01, *** p<0,001.

(3) PI= Probabilidad de Identidad entre individuos seleccionados
aleatoriamente, [PI.sub.SIBS] = Probabilidad de Identidad entre
hermanos completos (no gemelos)

(4) [PE.sub.1P] = Probabilidad de exclusion de paternidad, un padre
candidato y otro padre conocido, [PE.sub.2P] = Probabilidad de
exclusion de paternidad, un padre candidato y otro padre desconocido,
[PE.sub.PP] = Probabilidad de exclusion de paternidad, padre y madre
candidatos.

Cuadro 2. Numero de discordancias entre genotipos de padres conocidos
vs. progenie, con estimado de alelos nulos y porcentaje de error de
genotipado, en funcion de cada locus.

Locus         Madre conocida vs. progenie (n = 137)

               Casos        Alelos      % Error de
            discordantes   Nulos (1)   Genotipado (2)

BM1818           22           12           20,5%
BM1824           3             0            5,6%
BM2113           9             2            8,9%
CSRM60           5             1            6,0%
CSSM66           9             0            9,4%
ETH10            5             1            7,6%
ETH225           5             2           15,1%
ETH3             10            1           17,7%
ILSTS006         8             4           11,9%
INRA23           9             0            8,0%
MGTG4B           11            1           10,0%
RM067            7             4           14,3%
SPS113           7             2            8,2%
SPS115           7             0            7,5%
TGLA122          9             0            5,2%
TGLA126          10            0            7,6%
TGLA227          10            5           15,9%
TGLA53           12            3           15,0%
Sumatoria       158           38
Promedio                                   10,8%

Locus       Padre conocido vs. progenie (n = 136)

               Casos       Alelos   % Error de
            discordantes   Nulos    Genotipado

BM1818           8           3         7,5%
BM1824           0           0         0,0%
BM2113           11          0        10,9%
CSRM60           7           2         8,5%
CSSM66           6           0         6,3%
ETH10            8           1        12,3%
ETH225           9           7        27,4%
ETH3             4           1         7,1%
ILSTS006         3           0         4,5%
INRA23           5           1         4,5%
MGTG4B           5           0         4,6%
RM067            14          9        28,8%
SPS113           10          0        11,8%
SPS115           3           0         3,2%
TGLA122          9           0         5,2%
TGLA126          10          0         7,7%
TGLA227          3           0         4,8%
TGLA53           5           0         6,3%
Sumatoria       120          24
Promedio                               9,0%

(1) Alelos Nulos: estimado a partir de las discordancias de genotipo
entre padres y progenie, en las cuales ambos son homocigotas para
diferentes alelos, lo que sugiere la existencia de un alelo nulo.

(2) Tasa de Error de Genotipado: razon de discordancias en el locus
respectivo dividido entre el numero total de discordancias, ajustado
por la probabilidad de exclusion del locus respectivo ([PE.sub.2P] en
Cuadro 3).

Cuadro 3. Numero y porcentaje de casos discordantes entre genotipos de
padres conocidos vs. progenie, con estimado de Score LOD promedio y
numero atribuible a alelos nulos (1), en funcion del numero de loci
discordantes.

Loci         Pares Madre conocida vs.        Pares Padre conocido vs
Disc.            Progenie (n=137)                Progenie (n=136)

        casos     %     Nulo     LOD    Casos     %     Nulo     LOD

0        79     57,7%           11,0     88     64,7%            10
1        33     24,1%    21      8,7     29     21,3%    16      7,1
2         4     2,9%      1      5,4      4     2,9%      1      0,1
3         5     3,6%      4      1,4      2     1,5%      2     -0,9
4         2     1,5%      0     -2,0      4     2,9%      1     -5,0
5         5     3,6%      4     -5,7      2     1,5%      0     -9,4
6         2     1,5%      1     -9,0      3     2,2%      0     -9,1
7         2     1,5%      2     -13,3     1     0,7%      1     -13,1
8         3     2,2%      3     -14,5     1     0,7%      1     -12,2
9         1     0,7%      2     -14,4     2     1,5%      2     -16,1
>9        1     0,7%      0     -16,1     0     0,0%      0      --

Loci     Trios Padre vs. Madre
Disc.    vs. Progenie (n=118)

        casos     %      LOD

0        41     34,7%   25,6
1        36     30,5%   22,1
2        13     11,0%   19,2
3         5     4,2%    18,5
4         3     2,5%    14,5
5         1     0,8%     8,9
6         4     3,4%     5,6
7         2     1,7%     2,5
8         2     1,7%    -4,3
9         2     1,7%    -7,5
>9        9     7,6%    -18,4

(1) Alelos Nulos: estimado a partir de las discordancias de genotipo
entre padres y progenie, en las cuales ambos son homocigotas para
diferentes alelos, lo que sugiere la existencia de un alelo nulo.

Cuadro 4. Numero de paternidades asignadas con 99% y 95% de confianza
y rechazadas con 95% confianza con base en valores criticos de score
de verosimilitud (LOD).

Candidato        Paternidad asignada   Paternidad asignada  Paternidad
                   (99% Confianza)       (95% confianza)    Rechazada
                                                               (95%
                                                            Confianza)

                Casos   LOD Critico   Casos   LOD Critico     N (%)

Madre (n=137)    98        7,12       98+6       5,42       33 (24,1%)
Padre (n=136)    110       4,20       110+9      1,22       17 (12,5%)
Trios (n=118)    78        18,67      78+9       16,13      31 (26,3%)

Cuadro 5. Numero de paternidades reportadas (N Rep), rechazadas (N
Rec) y porcentaje de rechazo (% Rec) segun hato de procedencia de las
muestras.

Hato                Pares                         Pares
              Madre vs. Progenie            Padre vs. Progenie

       N Rep.   N Rec.   % Rec (1)    N Rec.   N Rec.   % Rec (1)

1        45       7      15,6% (a)      46       0       0,0% (a)
2        59       13     22,0% (ab)     50       15     30,0% (b)
3        33       13     39,4% (b)      40       2       5,0% (a)

Hato               Trios
        Padre vs. Madre vs. Progenie

       N Rep.   N Rec.   % Rec (1)

1        41       8      19,5% (a)
2        44       14     31,8% (a)
3        33       9      27,3% (a)

(1) Porcentajes de rechazo de distintos hatos que comparten una misma
letra no difieren significativamente (p>0,05).
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Author:Campos, Jorge; Vargas, Bernardo; Camacho, Jorge; Cruz, Argerie
Publication:Agronomia Costarricense
Date:Jan 1, 2018
Words:7103
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