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Oxidacao Eletroquimica de Anlodipino e Hidroclorotiazida Sobre o Eletrodo de Diamante Dopado com Boro: Potencialidade de Determinacao Simultanea em Urina.

1. INTRODUCAO

O besilato de anlodipino (ANL) e hidroclorotiazida (HCZ) sao agentes anti-hipertensivos indicados e utilizados pelos pacientes hipertensivos em estagios da doenca considerados moderados ou graves. O ANL e um bloqueador do canal de calcio e a HCZ tem acao diuretica, aumentando a eliminacao de liquidos pela urina, que tambem pode aumentar ou potencializar a acao de outros compostos anti-hipertensivos. Ambos analitos sao metabolizados no figado, sendo em media excretado na urina em uma quantidade de 10% da dose consumida na forma inalterada [1]. A Agencia Mundial Antidoping--AMA (World Anti-Doping Agency) apresenta a HCZ como substancia proibida em praticas esportivas. Neste contexto, torna-se importante o desenvolvimento de um procedimento analitico visando um controle destes compostos em amostras biologicas, como testes para identificacao de doping [2].

Existem diversos metodos analiticos descritos na literatura para a determinacao simultanea de varios anti-hipertensivos, no qual utilizam a cromatografia [3, 4], a espectrofotometria [3, 5] e a voltametria [6-8]. Dentre esses, a voltametria e bastante atrativa, devido ao seu baixo custo, rapidez de aquisicao de resultados, facil manuseio, alem de dispensar o uso de reagentes organicos, de media ou alta toxicidade. Essas tecnicas mensuram apenas as moleculas eletroativas de maneira muito sensivel e especifica, diminuindo o efeito de possiveis interferentes nao eletroativos, tornando o tratamento da amostra mais facil e com uma alta repetibilidade e exatidao, fornecendo ainda, dados para a interpretacao do comportamento eletroquimico do sistema. Recentemente, nosso grupo reportou a determinacao simultanea de alguns anti-hipertensivos em formulacoes farmaceuticas empregando o eletrodo de diamante dopado com boro (EDDB) ou o eletrodo de pasta de nanotubos de carbono [6-8]. O EDDB e um material sintetizado que possui otimas propriedades para sua aplicacao na eletroanalise. Esse eletrodo surge como alternativa frente aos eletrodos convencionais por apresentar vantagens fisicas e quimicas, como ampla janela de potencial de trabalho (-1,5 V ate 2,5 V vs Ag/AgCl KCl 3,0 mol [L.sup.-1]), baixa e estavel corrente de fundo, fraca adsorcao de moleculas, alta estabilidade fisica e termica, nao necessita de modificacao de sua superficie e ainda, apresenta repetibilidade e reprodutibilidade nos dados obtidos [9-11]. Cabe ressaltar que nao ha algum metodo voltametrico descrito na literatura para a determinacao simultanea de ANL e HCZ em amostras biologicas.

Dessa forma, nesse trabalho e relatada a potencialidade do EDDB em conjunto com a voltametria de onda quadrada (VOQ) para o desenvolvimento de um procedimento analitico para a determinacao simultanea de ANL e HCZ em amostra de urina, para identificacao de possivel doping em atletas.

2. MATERIAL E METODOS

Todas as solucoes empregadas nos experimentos foram preparadas a partir de reagentes comerciais de grau analitico, sendo preparadas com agua destilada e deionizada, purificada em um sistema Milli-Q (Millipore[R]). Os reagentes empregados foram anlodipino (como besilato) e hidroclorotiazida (Sigma-Aldrich); acido fosforico, acido fosforico e metanol (Merck); acido acetico, hidroxido de sodio e acido borico (Synth).

Solucoes estoque de ANL e HCZ foram preparadas diariamente em metanol na concentracao de 1,0 x [10.sup.-2] mol [L.sup.-1]. Adequadas diluicoes foram feitas a partir dessas solucoes diretamente no eletrolito suporte. O tampao BR, que foi selecionado como eletrolito suporte, foi preparado pela mistura do acido acetico, fosforico e borico na concentracao de 0,04 mol [L.sup.-1], sendo o pH ajustado por adicao de hidroxido de sodio 2,0 mol [L.sup.-1].

As medidas voltametricas foram realizadas em um potenciostato/galvanostato PalmSens PC gerenciado pelo programa PalmSens PC. Para os experimentos voltametricos foi utilizada uma celula de vidro de compartimento unico de 15 mL equipada com uma tampa de Teflon[R], contendo orificios para o posicionamento de tres eletrodos (trabalho, referencia e auxiliar). Como eletrodos de referencia e auxiliar foram usados Ag/AgCl (KCl 3,0 mol [L.sup.-1]) e uma placa de platina de 0,5 cm de largura e 1 cm de comprimento, respectivamente. O eletrodo de trabalho utilizado nas medidas voltametricas foi o EDDB (dopado com 8000 ppm de boro) com area geometrica de 0,25 [cm.sup.2], fabricado pelo Centre Suisse de Electronique et de Microtechnique AS (CSEM), em Neuchatel, Suica. Antes dos experimentos, o EDDB foi pre-tratado anodica e catodicamente em uma solucao de [H.sub.2]S[O.sub.4] 0,5 mol [L.sup.-1], por aplicacao de 0,5 A [cm.sup.-2] durante 30 s, e posterior aplicacao de -0,5 A [cm.sup.-2] durante 120 s, em um potencio stato Microquimica MQPG-01. Dessa forma, a superficie do EDDB foi predominantemente terminada em hidrogenio [9].

As medidas de pH das solucoes empregadas nesse trabalho foram feitas utilizando-se um pHmetro Hanna Instruments, modelo HI-221 e um eletrodo de vidro combinado com um eletrodo de referencia externa de Ag/AgCl (KCl 3,0 mol [L.sup.-1]).

As curvas analiticas simultaneas foram obtidas pela adicao de aliquotas das solucoes padrao de ANL 1,0 x [10.sup.-4] mol [L.sup.-1] e HCZ 1,0 x [10.sup.-3] mol [L.sup.-1] a celula eletroquimica contendo 10 mL de solucao tampao BR (pH 5,0). Os voltamogramas de onda quadrada foram obtidos apos cada aliquota adicionada. O limite de deteccao (LD) foi calculado a partir da relacao LD = 3SB/b, onde SB corresponde ao desvio padrao da media aritmetica de 10 brancos e b e o valor do coeficiente angular da respectiva curva analitica [13].

3. RESULTADOS E DISCUSSAO

Investigacao do comportamento voltametrico do ANL e HCZ no EDDB

A Figura 1 apresenta o voltamograma obtido para ANL e HCZ empregando-se o EDDB pre-tratado catodicamente. E possivel observar a presenca de dois processos de oxidacao bem definidos em 0,781 V (ANL) e 1,14 V (HCZ), em que nao e observado algum pico de reducao na varredura reversa, indicando que ambos processos sao irreversiveis. A diferenca entre os potenciais de oxidacao de ambos anti-hipertensivos permite propor um procedimento voltametrico para a determinacao simultanea de ANL e HCZ.

Efeito do tipo de pre-tratamento do EDDB na resposta voltametrica simultanea de ANL e HCZ

O efeito do tipo de pre-tratamento (anodico e catodico) do EDDB na resposta voltametrica simultanea de ANL e HCZ tambem foi investigado. Independente do tipo de pre-tratamento, foi observado processo de oxidacao para ANL e HCZ. Entretanto, o EDDB pre-tratado catodicamente apresentou maior magnitude de corrente para ambos anti-hipertensivos do que aquela observada quando o eletrodo foi pretratado anodicamente, em uma proporcao de 5,0% para ANL e de 375% para HCZ, selecionando assim, este tipo de pre-tratamento para a determinacao simultanea de ANL e HCZ. Este pre-tratamento foi realizado uma vez a cada dia de trabalho, sendo precedido de um pre-tratamento anodico de 30 s com a finalidade de garantir resultados reprodutiveis. Esse comportamento indica que o eletrodo com terminacoes em hidrogenio proporciona maior eletroatividade para ambos anti-hipertensivos do que o eletrodo com terminacoes em oxigenio, como tambem observado por outros autores [7,9].

Efeito do eletrolito suporte e velocidade de varredura

A influencia do pH tambem foi investigado na oxidacao simultanea de ANL 1,0 x [10.sup.-6] mol [L.sup.-1] e HCZ 1,0 x [10.sup.-5] mol [L.sup.-1] sobre o EDDB no intervalo de 2,0 a 9,0. Os resultados indicaram que o potencial de oxidacao de ANL e HCZ sao influenciados pela variacao do pH do meio, no qual ha um deslocamento de potencial para valores menos positivos com o aumento do pH, principalmente para a HCZ. Para valores de pH superiores ou iguais a 10,0 nao foram observados algum processo de oxidacao para a HCZ sobre o EDDB. O maior valor de intensidade de corrente para ANL e HCZ foi obtido em valores de pH iguais a 4,0 e 2,0, respectivamente. Entretanto, foi selecionado o pH 5,0 para dar sequencia a determinacao simultanea, uma vez que foi obtido melhor repetibilidade entre as medidas nesse valor de pH.

Neste mesmo valor de pH, as respostas voltametricas de ANL e HCZ foram comparadas em diferentes eletrolitos suporte, como tampao fosfato, acetato e BR. Os resultados obtidos em solucao tampao BR apresentaram maior intensidade de corrente, principalmente para HCZ, alem de melhor repetibilidade. Nao foi observado deslocamento de potencial nesses eletrolitos testados. A solucao tampao BR (pH 5,0) foi entao selecionada para a determinacao simultanea de ANL e HCZ.

O efeito da velocidade de varredura na oxidacao do ANL e HCZ foi investigado no intervalo de 5 a 200 mV [s.sup.-1]. Observa-se que a corrente de pico de ambos anti-hipertensivos aumenta e desloca para valores de potenciais mais positivos com o aumento da velocidade, indicando irreversibilidade do sistema [14]. A existencia de uma linearidade entre as correntes de pico anodico e a raiz quadrada da velocidade de varredura indica que na reacao de oxidacao de ANL e HCZ ha predominancia de um processo controlado por difusao. Alem do mais, o grafico do logaritmo da intensidade de corrente de pico em funcao do logaritmo da velocidade de varredura apresentou comportamento linear com inclinacao proxima a do previsto na literatura (0,50) para processo controlado por difusao das especies [14].

Obtencao de curvas analiticas e aplicacao do metodo proposto

A voltametria de onda quadrada foi utilizada para a determinacao simultanea de ANL e HCZ em urina sintetica. Essa tecnica se mostra muito sensivel, alcancando baixos limites de deteccao, alem de possibilitar uma analise mais rapida dos dados [15]. Assim, os parametros instrumentais dessa tecnica foram investigados, no qual os valores foram: 10 - 80 mV para amplitude de pulso (a), 10 - 70 Hz para frequencia e 1 - 4 mV para incremento de varredura (AEs). Os valores selecionados foram a = 40 mV, f= 30 Hz e [DELTA][E.sub.s] = 2 mV.

Nas condicoes otimizadas, foram construidas curvas analiticas para a determinacao simultanea de ANL e HCZ por meio de adicao de aliquotas de solucao padrao dos anti-hipertensivos em 10 mL de solucao tampao BR (pH 5,0). A Figura 2 apresenta os voltamogramas de onda quadrada obtidos para ANL e HCZ. A resposta obtida para cada curva analitica apresentou boa linearidade e sensibilidade. As curvas analiticas para a determinacao simultanea de ANL e HCZ foram obtidas na faixa de concentracao de ANL 1,0 x [10.sup.-7] - 2,1 x [10.sup.-6] mol [L.sup.-1] e de HCZ 2,0 x [10.sup.-6] 2,2 x [10.sup.-5] mol [L.sup.-1]. As curvas analiticas correspondentes sao:

[I.sub.ANL] ([micro]A) = 0,055 + 1,7 x [10.sup.5] [c (mol [L.sup.-1])] (r = 0,995) [I.sub.HCZ] ([micro]A) = -0,19 + 7,2 x [10.sup.4] [c (mol [L.sup.-1])] (r = 0,997)

Os valores de LD calculados para ANL e HCZ foram de 5,6 x [10.sup.-8] mol [L.sup.-1] e 1,6 x [10.sup.-7] mol [L.sup.-1], respectivamente.

A repetibilidade intra-dia da magnitude do pico de corrente foi obtido em medicoes (n = 10) de 5,0 x [10.sup.-7] mol [L.sup.-1] de ANL e 4,0 x [10.sup.-6] mol [L.sup.-1] de HCZ em solucao tampao BR (pH 5,0). Quando esses valores foram comparados foi possivel obter um desvio padrao relativo (DPR) das medidas, de 2,0% e 1,7% para ANL e HCZ, respectivamente, mostrando a boa repetibilidade intra-dia do metodo proposto. A repetibilidade inter-dia da magnitude da corrente tambem foi feita para n = 10. Os resultados obtidos de DPR foram de 4,2% e 5,7% para ANL e HCZ, respectivamente, indicando que o metodo proposto resulta em uma adequada repetibilidade inter-dia.

O metodo proposto foi testado na determinacao simultanea de ambos anti-hipertensivos em urina sintetica, em dois valores de concentracao para cada um dos analitos. A Tabela 1 apresenta os resultados para a analise da amostra de urina sintetica, em termos de percentagem de recuperacao. Este valor e a concentracao da amostra determinada a partir das curvas analiticas, convertido a uma percentagem. Foram obtidos bons resultados para a recuperacao de ANL e HCZ na amostra de urina sintetica utilizada, mostrando a potencialidade do uso do EDDB em conjunto com a VOQ para a deteccao e determinacao de ambos anti-hipertensivos em baixas concentracoes. Alem disso, alguns outros compostos, como dopamina, ureia, acido urico, cafeina e acido ascorbico foram testados como possiveis interferentes na determinacao de ambos anti-hipertensivos em amostra de urina. Verificou-se que esses compostos oxidam-se na superficie do EDDB em valores de potenciais menores que aqueles observados para o ANL. A cafeina oxida-se em valor mais positivo de potencial (maior que aquele observado para a HCZ), o que indica que eles nao interferem na determinacao simultanea de ANL e HCZ. Em concentracoes de acido urico na ordem de 100 vezes maior do que a de ANL pode haver interferencia, nao sendo possivel a determinacao simultanea de ANL e HCZ em amostras reais.

O perfil voltametrico de ANL e HCZ tambem foi obtido em uma amostra de urina humana (individuo saudavel e nao fumante) (Figura 3). Neste experimento uma aliquota de 100 [micro]L de urina foi adicionada diretamente na celula eletroquimica contendo 10 mL de solucao tampao BR (pH 5,0). Pode-se observar apenas um pico em torno de 0,5 V, que corresponde ao processo de oxidacao do acido urico. Valores de recuperacao de 91,4% e 92,0% foram obtidos respectivamente para ANL e HCZ nessa amostra de urina humana, indicando que nao houve interferencia significativa da matriz da amostra, desde que nao haja concentracoes elevadas de acido urico. Svorc et al. [11] tambem realizou determinacoes individuais de ANL em amostras de urina humana empregando o EDDB, demonstrando a viabilidade de se empregar este eletrodo e tecnica em amostras biologicas, desde que nao haja elevada concentracao de acido urico nestes tipos de amostras, como tambem observado neste trabalho.

4. CONCLUSAO

Levando em consideracao os resultados alcancados nesse trabalho, o EDDB pre-tratado catodicamente em conjunto com a VOQ apresentam potencialidade para a determinacao simultanea de ANL e HCZ em amostras de urina para testes de doping em atletas. O metodo proposto e simples e de relativo baixo custo, sem demandar elevado tempo de analise ou de uso de reagentes que apresentam algum grau de toxicidade.

5. AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao CNPq, CAPES, Fundacao Araucaria do Parana e UEL pelo apoio financeiro. Os autores tambem agradecem ao Prof. Luiz Henrique Dall'Antonia pela disponibilizacao dos potenciostatos para as medidas eletroquimicas.

6. REFERENCIAS E NOTAS

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[2] Prohibited List, https://www.wada-ama.org/en/what-wedo/prohibited-list, acesso em 12/11/2014.

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[7] Eisele, A. P. P.; Mansano, G. R.; Oliveira, F. M.; Casarin, J.; Tarley, C. R. T.; Sartori, E. R. J. Electroanal. Chem. 2014, 752, 46. [CrossRef]

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[15] Skoog, D. A.; West, D. M.; Holler, F. J.; Crouch, S. R. Fundamentos de Quimica Analitica. 8 ed, Thomson, Sao Paulo, 2007.

Guilherme Roberto Mansano, Elen Romao Sartori *

Departamento de Quimica, Universidade Estadual de Londrina (UEL), Rodovia Celso Garcia Cid, PR 445 Km 380, CEP: 86057-970, Londrina--PR, Brasil.

Article history: Received: 17 November 2014; revised: 25 February 2015; accepted: 26 February 2015. Available online: 22 March 2015. DOI: http://dx.doi.org/10.17807/orbital.v7i1.673

* Corresponding author. E-mail: elensartori@uel.br

Caption: Figura 1. Voltamogramas ciclicos obtidos em solucao tampao BR (pH 5,0) sem adicao (a) e com adicao (b) de ANL 1,9 x [10.sup.-5] mol [L.sup.-1] (A) e HCZ 9,7 x [10.sup.-5] mol [L.sup.-1] (B), utilizando-se o EDDB pre-tratado catodicamente a 40 mV [s.sup.-1].

Caption: Figura 2. Voltamogramas de onda quadrada para a oxidacao de ANL e HCZ em um EDDB pre-tratado catodicamente em solucao tampao BR (pH 5,0). Faixa linear de (2-8) 1,0 x [10.sup.-7] - 2,1 x [10.sup.-6] mol [L.sup.-1] para ANL e (2-8) 2,0 x [10.sup.-6] - 2,2 x [10.sup.-5] mol [L.sup.-1] para HCZ. Inserido: curvas analiticas de ANL e HCZ. Parametros da VOQ: f = 30 Hz, a = 40 mV, [DELTA][E.sub.s] = 2 mV.

Caption: Figura 3. Voltamogramas de onda quadrada obtidos para a oxidacao de ANL e HCZ em uma amostra de urina humana empregando um EDDB pre-tratado catodicamente. Eletrolito suporte: tampao BR (pH 5,0). Parametros da VOQ: f = 30 Hz, a = 40 mV, [DELTA][E.sub.s] = 2 mV.
Tabela 1. Resultados obtidos para adicao e recuperacao simultanea de
ANL e HCZ em amostras de urina sintetica.

Analito   Concentracao (x [10.sup.-6] mol [L.sup.-1])  Recuperacao (%)

          Adicionado            Encontrado (a)

ANL       0,12                  0,11 [+ or -] 0,01     91,7
HCZ       3,0                   2,9 [+ or -] 0,3       96,7
ANL       0,20                  0,19 [+ or -] 0,05     95,0
HCZ       4,0                   3,9 [+ or -] 0,2       97,5

(a) Media de 3 medidas.
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Title Annotation:Short Communication
Author:Mansano, Guilherme Roberto; Sartori, Elen Romao
Publication:Orbital: The Electronic Journal of Chemistry
Date:Jan 1, 2015
Words:3020
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