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Organogenese direta de mesocotilos de arroz (Oryza sativa L.).

Introducao

As respostas in vitro da maioria dos cereais, veem sendo pesquisadas intensamente ja ha alguns anos. O arroz e uma das culturas mais estudadas, ja que e fonte importante de alimento para grande parte da populacao mundial (SAHRAWAT; CHAND, 2001). A tecnica de cultivo in vitro e de suma importancia, ja que e uma ferramenta para muitos trabalhos que envolvam biotecnologia, visto que tecnicas de regeneracao tornam-se indispensaveis para o sucesso em trabalhos que envolvam introducao de DNA exogeno (SALLAUD et al., 2003). Entretanto, a aplicacao dos cultivos in vitro em engenharia genetica depende da disponibilidade, repetibilidade e alta eficiencia dos sistemas de regeneracao de celulas, tecidos ou orgaos (SHARMA et al., 2007).

A capacidade de regeneracao de inumeros explantes tem sido investigada em arroz e outros cereais, envolvendo principalmente embrioes (AL-FORKAN et al., 2004; TINJUANGJUN et al., 2000), e tecidos basais (YOOKONGKAEW et al., 2007). Dentre estes explantes estao os embrioes imaturos (SALLAUD et al., 2003) que sao dependentes do ciclo da cultura para a sua obtencao, dificultando sua utilizacao o ano inteiro, tornando dificil ou as vezes, ate impossivel a realizacao de alguns estudos. Para superar este inconveniente, atualmente tem-se utilizado explantes oriundos da regiao basal e meristematica de apices caulinares obtidos a partir de sementes recem germinadas, que podem ser obtidos em qualquer epoca, sem a dependencia do ciclo da planta (TAVARES et al., 2004).

A regeneracao de plantas esta intimamente ligada ao uso de reguladores de crescimento no meio de cultura, e na grande maioria das vezes, quando o objetivo e a regeneracao de gemas e brotos e quebra da dominancia apical, utiliza-se uma citocinina (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). O Thidiazuron (TDZ) e um regulador de crescimento, utilizado inicialmente como um desfolhante em algodao (ARNDT et al, 1976 apud CHAUHAN et al., 2007), que tem sido utilizado positivamente na morfogenese in vitro (KHURANA et al., 2005). O TDZ e reportado como uma citocinina que facilita a proliferacao de multipolos brotos em algumas culturas (GAIRI; RASHID, 2004; SRIVATANAKUL et al., 2000), incluindo o arroz (YOOKONGKAEW et al., 2007) e outras especies como feijao (MOHAMED et al., 2006), cevada (SHARMA et al., 2005) e trigo (SHAN et al., 2000). Em trabalho realizado por Ganesham et al. (2003) foi evidenciado o efeito positivo do TDZ na regeneracao de brotacoes oriundas de embrioes maduros, porem a citocinina nao demonstrou efeito positivo na emissao de brotos oriundos de escutelos, ratificando a ocorrencia de respostas adversas dependendo do tipo de explante utilizado em trabalhos de regeneracao de plantas.

Este estudo tem por objetivo verificar o efeito deste regulador de crescimento sobre a taxa de regeneracao, atraves de organogenese direta, e comprimento das brotacoes a partir de mesocotilos de duas cultivares de arroz, visando sua utilizacao em trabalhos de transformacao genetica.

Material e metodos

Como material vegetal foram utilizadas duas cultivares de arroz, BRS Taim e BRS Querencia, oriundas da Embrapa Clima Temperado. Sementes destas cultivares, previamente descascadas, foram desinfestadas com alcool 70%, durante 3 min., solucao de hipoclorito de sodio 3% por 25 min., seguido de tres lavagens em agua destilada esteril.

Apos a desinfestacao, as sementes foram inoculadas, em meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) semi-solido acrescido de 7 g [L.sup.-1] de agar, suplementado com 2 mg [L.sup.-1] de ANA (acido a-naftalenoacetico) e mantidas no escuro, a temperatura de 25 [+ o -] 1[grados]C, por 3 a 4 dias. Apos a germinacao das sementes, as plantulas foram seccionadas, retirando-se os coleoptilos e as bases dos tecidos meristematicos, e isolando-se somente os mesocotilos com 0,3 a 0,5 cm de comprimento, os quais foram utilizados como explantes.

Para os experimentos de regeneracao os explantes foram inoculados em meio MS em frascos de vidro de 100 mL, contendo 100 mg [L.sup.-1] de mio-inositol, 30 g [L.sup.-1] de sacarose e Thidiazuron (TDZ) nas concentracoes 0, 2, 3, 4 e 5 mg [L.sup.-1]. O pH dos meios foi ajustado para 5,8 antes da adicao de 2 g [L.sup.-1] de gelrite (agente geleitificante) e posteriormente esterilizados em autoclave a 121[grados]C e 1,5 atm. Apos a inoculacao dos explantes nos meios de cultura, estes foram transferidos para sala de crescimento com temperatura de 25 [+ o -] 1 [degrees]C, fotoperiodo de 16h e densidade de fluxo de fotons de 42 [micron]mol [m.sup.-2] [s.sup.-1].

Sete a dez dias apos o inicio dos experimentos, quando se observava o desenvolvimento de uma unica brotacao, realizou-se o corte da regiao apical da mesma, deixando-se o explante com 0,5 a 1,0 cm de comprimento, possibilitando assim uma melhor multiplicacao das brotacoes basais. Quarenta e cinco dias apos a inoculacao dos mesocotilos nos diferentes meios de cultura foram realizadas as avaliacoes, sendo as brotacoes primarias, previamente separadas e cortadas na parte apical. Apos, estas foram novamente inoculadas em meio MS contendo 3 mg [L.sup.-1] de TDZ, nas mesmas condicoes de incubacao e procedimentos citados acima. No primeiro experimento, foi determinado o numero de brotacoes por explante inoculado, bem como o comprimento de cada brotacao, utilizando-se para tal fim uma regua milimetrada. Ja, para o segundo experimento foi avaliado apenas o numero de brotacoes originadas por broto primario. O delineamento foi inteiramente casualizado contendo quatro repeticoes e 10 plantas por parcela (frascos de vidro de 100 mL). Para interpretacao dos dados foi aplicado uma regressao polinomial para analise da regeneracao e comprimento das brotacoes, calculados por meio do programa estatistico SANEST.

Resultados e discussao

Conforme resultados obtidos, a regeneracao de brotacoes ocorreu atraves de organogenese direta dos mesocotilos, isto e, nao houve formacao de calo. Analisando-se a Tabela 1 verifica-se para a variavel regeneracao de brotos que apenas o fator doses de TDZ foi significativo. Ja com relacao ao comprimento dos brotos verificam-se diferencas estatisticas entre as doses de TDZ, bem como uma interacao entre estas e as cultivares estudadas.

A Figura 1 comprova que a taxa de regeneracao ajustou-se em uma regressao quadratica para as duas cultivares, sendo que a emissao dos brotos obteve seu ponto maximo na dose 3,58 mg [L.sup.-1], ocorrendo a partir desta concentracao uma queda na regeneracao de brotacoes.

[FIGURA 1 OMITIR]

A maior taxa de regeneracao da cultivar BRS Taim ocorreu com 3 mg [L.sup.1] , com media de 25,57 brotos por explante. Ja, para o cultivar BRS Querencia, o melhor comportamento com relacao a esta variavel foi obtido com 4 mg [L.sup.-1] do regulador, com 24,35 brotacoes/explante (Figura 2). Entretanto, para os dois genotipos nao ocorreu diferenca estatistica com relacao as doses do regulador, porem estas diferiram significativamente da testemunha (0 mg L -1).

A Figura 2 demonstra o comportamento das cultivares em relacao a variavel comprimento dos brotos, na qual os dados se ajustaram em regressoes quadraticas. As linhas de tendencia evidenciam que o comprimento de brotos foi drasticamente reduzido ja com 2 mg [L.sup.-1] do regulador de crescimento, ocorrendo uma diminuicao de 85,5% para BRS Taim e 93,7% para BRS Querencia, desta concentracao em relacao ao tratamento testemunha.

[FIGURA 2 OMITIR]

No entanto, a concentracao que mais afetou esta variavel foi com 4 mg [L.sup.-1], obtendo-se medias de 1,54 cm e 0,96 cm para as cultivares BRS Taim e BRS Querencia, respectivamente.

Os resultados obtidos discordam de Tavares et al. (2004), que trabalhando com mesocotilos como explante, relataram resultados negativos de regeneracao, quando utilizaram meio de cultura contendo TDZ, ANA, caseina, sorbitol e sacarose em regeneracao da cultivar de arroz BRS Taim. Porem, em trabalho realizado por Gairi e Rashid (2004) foi evidenciado que cariopses de arroz cultivadas em meio de cultura MS contendo ANA e subsequente passagem para MS com 10 [micron]M de TDZ, resultou em 50% de regeneracao de brotos. Harshavardhan et al. (2002) relataram que 1 mg [L.sup.-1] de TDZ, utilizado juntamente com BAP e ANA induziu a formacao de multiplos brotos em sorgo. Ja Kishore et al. (2006) relatam bons resultados de regeneracao na mesma cultura, empregando apenas 0,5 mg [L.sup.-1] de TDZ.

Alguns trabalhos sao reportados sobre o beneficio do TDZ na regeneracao de diferentes especies, porem quando usado associado a outro regulador de crescimento (GAIRI; RASHID 2004; SHARMA et al., 2005; SHARMA et al., 2007; CARAMORI et al., 2001). Entretanto, conforme dados deste estudo, obtiveram-se altos indices de regeneracao quando o TDZ foi usado isoladamente no meio de cultura, promovendo altas taxas de regeneracao por organogenese direta a partir de mesocotilos e sem formacao de calo (Figura 3).

Diferentemente dos dados deste estudo, muitos trabalhos com o uso do TDZ reportam resultados de regeneracao de gramineas via organogenese indireta, incluindo culturas como trigo, cevada e triticale (GANESHAN et al., 2006; SHAN et al., 2000; GANESHAN et al., 2003) e alguns em arroz (TAVARES et al., 2004).

O TDZ evidenciou uma maior taxa de regeneracao de brotacoes que o regulador de crescimento BAP (dados nao mostrados). No entanto, o efeito do regulador pode ser toxico para a regeneracao de brotos em doses elevadas. Os dados deste trabalho indicaram que o TDZ reduziu em 20 e 20,78% a regeneracao de brotos dos genotipos BRS Taim e BRS Querencia, respectivamente, quando utilizou-se concentracoes mais elevadas deste regulador de crescimento (4 e 5 mg [L.sup.-1]), denotando um efeito possivelmente toxico do mesmo (Figura 2). Isto pode ser confirmado em estudo realizado por Chauhan et al. (2007) quando concentracoes mais elevadas de TDZ tornaram-se deleterias para a regeneracao de embrioes imaturos de trigo. Em contrapartida, os autores afirmam ainda que o regulador em concentracoes menores pode potencializar a regeneracao de brotos.

Com relacao a reducao do comprimento das brotacoes, uma hipotese seria que, doses menores que 2 mg [L.sup.-1] pudessem reduzir esta porcentagem de inibicao da altura das brotacoes. Esses dados concordam com Perez e Kerbauy (2004) quando estes mencionam que, quando se usa uma citocinina, o hormonio de crescimento concentra-se nas gemas laterais, promovendo seu desenvolvimento e consequentemente reduzindo a dominancia apical.

[FIGURA 3 OMITIR]

No segundo experimento foi estudada a capacidade de regeneracao dos brotos primarios, oriundos dos mesocotilos. Sendo seus produtos de regeneracao denominados brotos de primeira passagem (BPP). Com relacao as doses do TDZ na regeneracao dos BPP, observou-se que ocorreu diferenca estatistica entre as cultivares e entre os tratamentos, ocorrendo, tambem, uma interacao entre esses fatores (Tabela 2).

A Figura 4 indica que o comportamento distinto das duas cultivares ajustou-se em duas regressoes cubicas. As curvas demonstraram que a regeneracao de BPP para as duas cultivares nao manteve um aumento constante de regeneracao, havendo uma queda significativa a partir do tratamento 4 mg [L.sup.-1], para as duas cultivares.

[FIGURA 4 OMITIR]

A concentracao 4 mg [L.sup.-1] originou os maiores resultados de emissao de BPP, com medias de 11,83 e 16,00 brotos para BRS Taim e BRS Querencia, respectivamente (Figura 4), a partir dai ocorre uma reducao nos resultados desta variavel. Husain et al. (2007) estudando o efeito do TDZ em uma especie florestal, concluiram que doses maiores que 0,4 mg [L.sup.-1] do regulador, reduzem em ate 40% sua regeneracao de brotos.

Um fator a ser mencionado, e a ocorrencia de explantes com brotos vitrificados e com as pontas enroladas nas duas etapas do experimento (dados nao apresentados), em todas as doses estudadas. Tambem ocorreram explantes com brotacoes, na sua grande maioria atrofiados, senescidos, aglomerados ou com aspecto de queima (Figura 3). Este efeito provavelmente seja consequencia de algum efeito fitotoxico da concentracao de TDZ no meio de cultura. O surgimento de vitrificacao com uso de TDZ tambem foi verificado por Chun-Lai et al. (2001) estudando seus efeitos na regeneracao de beterraba.

Este trabalho demonstrou que o uso de TDZ, favorece a regeneracao de brotos, porem, este pode ser nocivo aos explantes, quando manipulado em doses elevadas. Assim, estudos devem ser realizados para se estabelecer um protocolo de regeneracao que envolva doses do regulador de crescimento que nao afetem a qualidade dos explantes.

Conclusao

O TDZ e eficiente na regeneracao de brotos a partir de mesocotilos de sementes recem germinadas das cultivares BRS Taim e BRS Querencia, embora induza, com o aumento das concentracoes utilizadas, brotacoes vitrificadas.

DOI: 10.4025/actasciagron.v32i3.3443

Received on May 19, 2008. Accepted on August 29, 2008.

Referencias

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Maristela dos Santos Rey (1) *, Daiane Schmidt de Pinho (2), Anieb Prestes Vieira (3), Eugenia Jacira Bolacel Braga (4), Carlos Roberto Pierobom (1) e Jose Antonio Peters (4)

(1) Programa de Pos-graduacao em Fitossanidade, Universidade Federal de Pelotas, Caixa Postal 354, 96010-900, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil. (2) Programa de Pos-graduacao em Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil. (3) Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil. (4) Departamento de Botanica, Instituto de Biologia, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil. (5) Programa de Pos-graduacao em Fisiologia Vegetal, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil. * Autorpara correspondencia. E-mail: maris_rey@yahoo.com.br
Tabela 1. Quadro da analise da variancia para as variaveis
numero e comprimento de brotacoes de arroz, cv. BRS Taim e
BRS Querencia, oriundas de mesocotilos cultivados in vitro em
meios com diferentes concentracoes de thidiazuron. Pelotas,

Estado do Rio Grande do Sul, 2008.

                                     Probabilidade > F

Causas da variacao            Num. de brotos   Comp. De brotos

BRS Taim/BRS Querencia            0,1226           0,09788
TDZ                             0,00001 **       0,00001 **
BRS Taim/BRS Querencia * TDZ     0,21967         0,00002 **
Media geral                       17,88             5,72
C.V.                             25,915%           21,603%

** Diferenca significativa (< 0,05%).

Tabela 2. Quadro da analise da variancia da variavel numero de
brotos de primeira passagem das cultivares BRS Taim e BRS
Querencia sob efeito do uso do regulador de crescimento TDZ.

Pelotas, Estado do Rio Grande do Sul, 2008.

Probabilidade > F
Causas da variacao                Numero de BPP

BRS Taim/BRS Querencia             0,02516 **
TDZ                                0,00001 **
BRS Taim/BRS Querencia * TDZ       0,00058 **
Media geral                          8,218
C.V.                               20,856%

** Diferenca Significativa (< 0,05%).
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Title Annotation:texto en portugues
Author:dos Santos Rey, Maristela; Schmidt de Pinho, Daiane; Prestes Vieira, Anieb; Bolacel Braga, Eugenia J
Publication:Acta Scientiarum Agronomy (UEM)
Date:Jul 1, 2010
Words:3466
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