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Optimized extraction and partial purification of S. Cerevisiae invertase from peach puree/Extraccion optimizada y purificacion parcial de invertasa aislada de S. Cerevisiae en pure de durazno.

Introduccion

El durazno (Prunus persica (L.) Batsch) esta entre las diez frutas mas producidas del mundo, con un volumen superior a 20 millones de toneladas. Los mayores productores son China, Italia y Espana. Brasil ocupa el 12[degrees] lugar en la produccion mundial, con aproximadamente 218 mil toneladas en un area plantada de 18 mil hectareas. Dentro de las variedades usadas para industrializacion se encuentra la Jubileu, destacada por su bajo potencial de oscurecimiento enzimatico y sus atributos sensoriales que son favorables para la elaboracion de pure, nectares y jugos (TORALLES et al., 2006; SAINZ e FERRI, 2015; IBGE, 2015; FAOSTAT, 2016).

Han sido identificados mas de 160 tipos de microorganismos en diferentes etapas del procesamiento de pulpas de duraznos, destacandose la levadura Saccharomyces cerevisiae con potencial fermentativo y resistencia termica significativa (LOPES et al., 2014; FERREIRA et al., 2016).

Las enzimas obtenidas a partir de estas levaduras han sido bastante estudiadas, incluyendo lafrutohidrolasa frutofuranosidasa (EC 3.2.1.26), conocida como invertasa, que cataliza la hidrolisis de la sacarosa produciendo una mezcla de glucosa y fructosa llamada azucar invertido, usada en la industria de alimentos y farmaceutica (BAYRAMOGLU, et al., 2017). Ademas de estas levaduras, sobre todo en la especie Saccharomyces cerevisiae, las invertasas son tambien encontradas en invertebrados, vertebrados, algas verdes, bacterias, vegetales y hongos (OLIVEIRA, et al. 2006; GOULART et al., 2013; FERRIERI et al. 2015). En S. cerevisiae fueron identificadas dos formas diferentes de invertasa: una no glicosilada, que se encuentra en el citoplasma, y otra localizada en el espacio periplasmatico, que es glicosilada, y se encuentra ligada a la pared celular de la levadura, siendo la forma extracelular la predominante (CANTARELLA et al., 2003; BOFO et al., 2005). La levadura Candida utilis tambien presenta esas dos formas (GUIMARAES et al., 2007).

La actividad optima de las invertasas generalmente se encuentra en un pH entre 4,6 y 5,0 y una temperatura entre 35[degrees]C y 50[degrees]C, con concentracion de substrato en media de 120 mM no meio reacional. Por encima de esta concentracion la solucion de sacarosa aumenta su viscosidad, reduciendo la actividad enzimatica en presencia de agua (SANTOS, 2010; TORALLES et al., 2014; LIU et al. 2015).

Numerosos trabajos han sido citados sobre levaduras productoras de invertasa utilizando fermentacion discontinua (FL) y sacarosa o melaza como principal fuente de carbono (MUKHERJEE et al., 2005; SHANKAR, et al., 2014), sin embargo, una tecnica que viene siendo utilizada es la fermentacion en estado solido (FES), que consiste en el cultivo de micro-organismos sobre y en el interior de particulas porosas humedas. Al comparar la FES con la FL, el primer metodo muestra ventajas, toda vez que presenta menor represion catabolica, alta productividad y concentracion de la enzima. Sin embargo, a escala de laboratorio, se viene utilizando la fermentacion discontinua en estado liquido para obtencion de biomasa, con potencial para produccion de invertasa (ALEGRE et al., 2009; GHASEMI et al., 2014; FERREIRA et al., 2016).

Al final de la fermentacion, las diferentes formas de invertasa necesitan ser extraidas (ANDJELKOVIC et al., 2010; SHANKAR et al., 2014). La autolisis es un proceso de extraccion bastante utilizado que, resumidamente, consiste en la ruptura y degradacion de las estructuras celulares por actividad de enzimas degradativas, principalmente, las endo- y exo-[beta]-(1,3) glucanasas. El proceso de auto digestion puede ser iniciado por la aplicacion de condiciones controladas de pH, temperatura, velocidades de agitacion, potencial osmotico entre otros, que pueden provocar muerte celular sin inactivar tales enzimas. Una serie de desordenes ocurren dentro de las celulas, resultando en la solubilizacion de los componentes celulares y en la desintegracion de la membrana celular; asi, los componentes solubles, donde se encuentra la invertasa, se permean al medio extracelular (TENKANEN et al., 2003; WANG y LI, 2013). La literatura pertinente no relata la interaccion de esas variables para evaluar la extraccion de invertasa de levadura de durazno por autolisis.

Posterior a la extraccion, la enzima se encuentra libre pero glicosilada, y dependiendo de su aplicacion, se necesitan operaciones de purificacion antes del estudio de su cinetica completa ya sea en la forma libre o inmovilizada. Las tecnicas de precipitacion con solvente seguido de separacion en columnas cromatograficas son bastante citadas para preparar la enzima principalmente para caracterizar las isoenzimas de invertasa y su inmovilizacion (GUIMARAES et al. 2007; VEANA et al., 2011; ANDJELKOVIC, et al., 2015).

En este trabajo se estudio el efecto combinado de la concentracion de NaHC[O.sub.3] (50-350 mM) y de la velocidad de agitacion (50-350 rpm) en el proceso de extraccion de la invertasa de S. cerevisiae aislada de pure de durazno (ISc), usando MSR, asi como las condiciones optimas para la extraccion de invertasa y obtencion de un extracto parcialmente purificado usando ILC como testigo.

Materiales Y Metodos

Micro-organismo y su cultivo

El micro-organismo usado en este experimento fue aislado a partir de pure de durazno a 22 [degrees] Brix suministrado por Lopes et al. (2014) e identificado como Saccharomyces cerevisiae por el sistema API 20C AUX, con un 95% de exactitud y perfil numerico 2040032 (FERREIRA et al., 2016). Las colonias fueron mantenidas en placas de agar de dextrosa de papa (PDA), pH 5 y contadas como descrito por Siqueira (1995), despues de 5 dias de incubacion a 25[degrees]C. En el pure el recuento inicial de las colonias fue de 22x[10.sup.2] UFC.[mL.sup.-1]. El crecimiento de la levadura fue conducido usando cultivo en batch con 20 g de colonias en PDA, 20 g.[L.sup.-1] de glucosa, (N[H.sub.4])2S[O.sub.4] 1 g.[L.sup.-1]; K[H.sub.2]P[O.sub.4] 2 g.[L.sup.-1]; MgS[O.sub.4].7[H.sub.2]O 0,5 g.[L.sup.-1]; FeS[O.sub.4] 0,5 g.[L.sup.-1] y peptona 5 g.[L.sup.-1] sobre agitacion de 150 rpm orbital a 30[degrees]C durante 24 horas. Posteriormente, fue realizada una nueva inoculacion usando las levaduras identificadas e aisladas como S. cerevisiae, con un recuento inicial de cerca de 106 UFC. [mL.sup.-1]. Estas levaduras fueron almacenadas a 4[degrees]C para subsiguiente extraccion de la enzima.

Determinacion azucares reductores

Los azucares reductores (AR) fueron determinados por el metodo colorimetrico de la glucosa usando 1 mL de acido 3,5-dinitrosalicilico (DNS, Sigma Aldrich Chemie GmbH, Alemanha), 1 mL de medio reactivo y 1 mL de agua, seguido de bano-maria en ebullicion durante 5 minutos. Para el blanco fue utilizado agua destilada en lugar del medio reactivo. La transmitancia resultante de esa reaccion fue medida a 490 nm, utilizando un espectrofotometro AJX-1000 UV/VIS. La masa de glucosa en el medio reactivo fue determinada a traves de la curva patron de glucosa como descrito por Toralles et al. (2014).

Actividad de la invertasa

La actividad enzimatica de la invertasa fue determinada por reaccion de los azucares reductores con DNS. La transmitancia resultante de esa reaccion fue medida a 490 nm, utilizando un espectrofotometro AJX-1000 UV/VIS. El medio reactivo contenia 1,0 mL de tampon Mcllvaine pH 5.0; 1,0 mL de solucion de sacarosa como substrato y 1,0 mL de extracto enzimatico. La mezcla reactiva final contenia 40 mM de substrato. La reaccion fue conducida en pH 5,0 a 25[degrees]C. Luego, fue cuantificado el valor de AR. En el blanco, fue utilizado 1,0 mL de agua des-ionizada en reemplazo del substrato en la mezcla reactiva. La actividad enzimatica fue calculada en la parte linear de la curva. Una unidad de actividad fue definida como la cantidad de enzima que causa el incremento de 1 [micro]g glucosa.[min.sup.-1]. El valor de proteinas fue determinado por el metodo Lowry, utilizando BSA como patron (Acros, New Jersey, USA).

Efecto de la concentracion de bicarbonato de sodio y velocidad de agitacion en la extraccion de la invertasa.

Para analizar el efecto combinado de la concentracion de NaHC[O.sub.3] (X1) y de la velocidad de agitacion (X2), en la extraccion de la enzima, se adapto un diseno rotacional compuesto central (GACULA, 2008) para dos variables y cinco niveles (Tabla 1). Los extractos brutos fueron obtenidos usando un metodo de extraccion con bicarbonato de sodio conocido como autolisis. Para cada 100 g de biomasa bruta o liofilizada, fueron utilizados 300 mL de solucion en diferentes concentraciones de NaHCO3 y velocidad de agitacion (Tabla 1).

La extraccion fue realizada en shaker Quimis por 24 horas a 40[degrees]C. Luego, se centrifugo la muestra a 2025 x g durante 10 minutos para obtener el liquido sobrenadante que corresponde al extracto enzimatico bruto que, fue almacenado a 20[degrees]C. En el extracto centrifugado fue determinado el valor de actividad de la invertase como fue descrito previamente. Para la levadura usada como testigo fue aplicado el mismo procedimiento.

El diseno experimental fue configurado con cuatro puntos axiales, cuatro puntos cubicos, tres puntos centrales (Tabla 1). Todos los ensayos fueron repetidos 3 veces. Una funcion de forma polinomica de segundo orden (Ecuacion 1) fue ajustada a los datos experimentales:

[mathematical expression not reproducible] (1)

donde: [Y.sub.i] = variable respuesta; [X.sub.i] ou [X.sub.j] = variable entrada; [b.sub.0] = punto central del sistema; [b.sub.i] = coeficiente linear; [b.sub.ii] = coeficiente cuadratico e [b.sub.ij] = coeficiente interactivo. La variable respuesta fue definida en terminos de actividad relativa (AR %) en relacion a la maxima actividad encontrada para Isc y usado como criterio de extraccion por autolisis de la invertasa libre.

El punto estacionario fue determinado a traves de la ecuacion:

Xs = -1/2 [B.sup.-1] x b (2)

donde: [X.sub.S]= es el punto estacionario; b= es un vector (k x 1) dos coeficientes de regresion de primera orden y B= es una matriz simetrica del punto central (k x k). En la diagonal, se encuentran los coeficientes de regresion de segunda orden y fuera de la diagonal los coeficientes de interaccion.

Un analisis canonico fue realizado con el objetivo de facilitar la interpretacion de los resultados del punto estacionario y definir si es un punto de maximo, minimo o silla, usando el siguiente modelo:

[mathematical expression not reproducible] (3)

[Y.sub.S] = es la respuesta del punto estacionario; [w.sub.i] = son las variables independientes transformadas y [[lambda].sub.i] = son auto valores de la matriz B.

Purificacion del extracto bruto por precipitacion

La recuperacion de la invertasa fue realizada a traves de la precipitacion con solvente organico etanol y acetona. El solvente frio fue adicionado al extracto bruto en una proporcion de 3:1. Esta mezcla fue mantenida sobre refrigeracion por 15 min y posterior a este periodo de tiempo fue centrifugada por 10 min a 2025 x g. El precipitado obtenido fue secado, luego suspendido en agua destilada. Las proteinas solubles y la actividad enzimatica fueron determinadas como fue descrito previamente.

Analisis estadistico

El Software Statistica fue utilizado para calcular los coeficientes de regresion no linear, coeficiente de determinacion y analisis de variancia (ANOVA), asi como para generar los graficos en dos y tres dimensiones. Los intervalos de confianza de los coeficientes fueron calculados multiplicando o error estandar por Student-t ([t.sub.n-2]), ajustado a los grados de libertad (p<0,05).

Resultados y discusion

Efecto combinado de la concentracion de NaHC[O.sub.3] y de la velocidad de agitacion en la extraccion de invertasa

En la Tabla 2, se muestra el delineamiento experimental con las condiciones aplicadas y los resultados obtenidos en la extraccion de la invertasa de S. cerevisiae de pure de durazno (ISc), en terminos de porcentaje de actividad relativa (% AR). En el ensayo 5, con una concentracion de 200 mM de NaHC[O.sub.3] y 200 rpm, fue donde se observo mayor extraccion por autolisis con una %AR de 100% que corresponde a una actividad especifica 14,7 U.[mg.sup.-1] en pH 5, a 25[degrees]C y 10 minutos de reaccion. Los ensayos 2, 6, 7 y 8 no difieren del ensayo 5 con un nivel de significancia de 5%, siendo que los ensayos 6 y 7 son repeticiones del punto central. Cuando se comparan los ensayos 2 y 8, con condiciones experimentales casi inversas, se hace evidente la dependencia por el efecto combinado de ambas variables: concentracion de NaHC[O.sub.3] y velocidad de agitacion.

El ajuste de un modelo polinomico de segunda orden, Ecuacion 1, al conjunto de valores experimentales presentados en la tabla 2 indicaron el efecto lineal, cuadratico e interactivo de las concentraciones de bicarbonato de sodio (NaHC[O.sub.3]) ([X.sub.1]) y velocidad de agitacion orbital ([X.sub.2]) en la extraccion de invertasa se presentan en la Tabla 3. El modelo desarrollado por la Ecuacion 1, cuyo coeficiente de determinacion (R2) de 0,80, fue estadisticamente significativo para regresion (p [less than or equal to] 0,05), Tabla 4.

El efecto interactivo de las concentraciones de NaHC[O.sub.3] y de la velocidad de agitacion en la extraccion de invertasa por autolisis evaluado a traves de su actividad se demuestra en la Figura 1. Este tipo de informacion es de gran valor para la optimizacion del proceso de extraccion de invertasa. El rango de concentracion de NaHC[O.sub.3] y velocidad de agitacion, respectivamente, donde ocurrio el maximo de extraccion de invertasa, se encuentra entre 175-225 mM y 175-225 rpm (Figura 1).

La literatura no relata la interaccion de esas variables para evaluar la extraccion de ISc, por lo tanto, no se pueden realizar las comparaciones con la misma. Por otra parte, la metodologia de Cunha y Vitolo (1984), evaluando las variables (agitacion, concentracion y temperatura) de forma independiente, proponen como condicion ideal de autolisis 200 rpm, 150 mM de NaHC[O.sub.3] a 45[degrees]C para invertasa de levadura de pan. En estas condiciones fue encontrada un % AR alrededor de 20% para invertasa ISc.

Toralles et al. (2014) encontraron actividad optima para invertasa de levadura de durazno de 8,86 U.[mg.sup.-1] equivalente al 60 % del ensayo 5 en este trabajo usando un pH 5, 25[degrees]C y 10 minutos. En aquella ocasion los autores no tenian como aislar e identificar las levaduras presentes en el pure de durazno y usaron una tecnica de extraccion con NaHC[O.sub.3] a 100 mM, 200 rpm y 45[degrees]C. Andjelkovic et al. (2010), utilizando 120 mM de NaHC[O.sub.3] durante 4 dias a temperatura ambiente, encontraron una actividad menor para extracto bruto de invertasa de pan a 25[degrees]C, pH 4,5 y 5 minutos de reaccion.

Localizacion del punto estacionario y analisis canonico

El modelo ajustado de la ecuacion 1 es

[mathematical expression not reproducible]

Para el modelo arriba, el punto estacionario, determinado a traves de la ecuacion 2.3 esta dado por:

[mathematical expression not reproducible]

En terminos de variables naturales, el punto estacionario esta dado por:

[X.sub.1] = -0,20.100+200 = 180

X2 = -0,18.100+200 = 182

donde [X.sub.1] es la concentracion de NaHC[O.sub.3y] [X.sub.2] es la velocidad de agitacion orbital en el shaker.

Para expresar el modelo ajustado en la forma canonica, primero, se tiene que encontrar los auto valores que son las raices del determinante en la ecuacion B-[lambda]l:

[mathematical expression not reproducible]

Las raices de esta ecuacion son iguales a: [[lambda].sub.1] = -10,33 e [[lambda].sub.2] = -33,41. Como todas las raices caracteristicas tienen signo negativo, se puede decir que el punto estacionario se trata de un punto de maxima extraccion, con una actividad de 15,8 [+ or -] 1,63 U.[mg.sup.-1]. A un nivel de confianza de 95%, usando el test t, fue aceptada la hipotesis que la actividad del ensayo 5 es igual al punto de maxima extraccion. Por otro lado, las diferencias entre las condiciones experimentales del ensayo 5 (200mM y 200 rpm) y de punto estacionario (180 mM y 182 rpm) fueron maximo de 10%. Tales resultados estan de acuerdo con el rango optimo de extraccion observado en la Figura 1.

Comparacion entre los extractos liofilizados, no liofilizados y purificados

Realizando un estudio comparativo entre el extracto bruto obtenido por autolisis de S. cerevisiae de pure de durazno (ISc) no-liofilizado y liofilizado, Figura 2, ambos con una concentracion de cerca de 1,0 mg.[mL.sup.-1] de proteina y en las condiciones del ensayo 5, se observo un aumento de cerca de dos veces en la actividad de la ISc liofilizada (33,2 U.[mg.sup.-1]). Para invertasa de levadura comercial (ILC)--testigo--procedente de una autolisis a 100 mM de NaHC[O.sub.3], 200 rpm e 45[degrees]C, se encontro 216,8 U.[mg.sup.-1] en la misma concentracion de proteina. Santos (2010), trabajando con invertasa de levadura comercial, usando un proceso de extraccion con sucesivas maceraciones en medio etereo, encontro 14,93 [micro]moles.[min.sup.-1].[mg.sup.-1] que corresponde cerca de diez veces el valor encontrado en este estudio. El autor trabajo en condiciones reactivas diferentes para temperatura y tiempo, respectivamente, 50[degrees]C y 30 minutos. En este trabajo la reaccion fue conducida a 25[degrees]C y 10 minutos. La mejor explicacion para esta diferencia es la dependencia de la actividad de invertasa con la temperatura como citado por Cantarella et al., (2003).

Purificacion de la invertasa

De acuerdo a estudios preliminares, los extractos no purificados de invertasa libre de ISc presentaron optima actividad tanto para extracto bruto, con una actividad especifica de 32,6 U.[mg.sup.-1], como en la dilucion 50% v/v con 36,2 U.[mg.sup.-1]. Para levadura comercial (ILC)--testigo--en la dilucion al 10% (216,8 U.[mg.sup.-1]). Se escogio la mayor dilucion para los ensayos de purificacion por optimizacion de la muestra.

Con respecto a la purificacion de las invertasas ILC y ISc, en la Tabla 5 se presentan los resultados obtenidos a traves de la purificacion con etanol y acetona para la recuperacion de las invertasas por precipitacion, usando una proporcion de 3:1 (solvente: extracto bruto). Los resultados obtenidos pertenecen a las diluciones escogidas en el item anterior.

Comparando el extracto bruto de ISc a 50% en volumen (con actividad especifica de 36,2 U.[mg.sup.-1]), con las precipitaciones realizadas con acetona y etanol, se encontraron factores de purificacion de 2,1 veces (89,9%) para el etanol y 3,0 veces (86,1%) para la acetona, siendo las actividades especificas de 74,8 e 108,4 U.[mg.sup.-1] respectivamente.

Para el testigo ILC, con extracto diluido a 10% en volumen, el etanol tambien fue mas efectivo, con una actividad de 275,6 U.[mg.sup.-1] y un factor de recuperacion de 1,3 y un rendimiento de cerca de 70%. En ambos casos la diferencia fue significativa (Tabla 5). Andjelkovic et al. (2010), trabajando con extracto bruto de invertasa de levadura de pan, obtuvieron un rendimiento de 79,2 % para etanol, que corresponde cerca de 10% inferior de la recuperacion de la ISc.

Conclusiones

La funcion polinomica de segundo orden explico la extraccion de la invertasa libre obtenida por autolisis de Saccharomyces cerevisiae de pure de durazno cv. Jubileu (ISc) con una varianza explicada en media de 80%. El efecto interactivo de la concentracion de NaHC[O.sub.3]([X.sub.1]) y velocidad de agitacion ([X.sub.2]) en el proceso de extraccion indico un efecto linear y cuadratico. El punto estacionario es un punto de maxima extraccion de la ISc en 182 rpm y 180 mM de NaHC[O.sub.3] difiriendo del punto central en menos de 10%. Esa diferencia en las condiciones operacionales de extraccion no afecta la actividad enzimatica.

La recuperacion de la actividad de la ISc fue superior a la de la ILC con ambos agentes precipitantes, siendo que el etanol fue mas efectivo que la acetona.

Finalmente, se puede afirmar que el NaHC[O.sub.3] es un agente de autolisis efectivo y su utilizacion es una buena alternativa en la extraccion de invertasa, principalmente si es combinado con la velocidad adecuada de agitacion en el shaker y liofilizacion de la levadura.

DOI: http://dx.doi.org/10.1590/0100-29452018489

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Marcela Vega Ferreira (1), Aline Farias Rossler (2), Ricardo Peraca Toralles (3), Walter Augusto Ruiz (4), Cesar Valmor Rombaldi (5)

Corresponding author: E-mail: marchii20@yahoo.es

Received: January 05, 2016.

Accepted: April 18, 2017.

(1) Magister en Ciencia y Tecnologia de Alimentos, Estudiante Universidade Federal de Pelotas-RS, Brasil. E-mail: marchii20@yahoo.es.

(2) Estudiante de Ingenieria Quimica, Instituto Federal Sul rio-grandense-RS. Brasil. E-mail: alinerossler@yahoo.com.br

(3) Doctor en Ciencias, Profesor del Instituto Federal Sul-rio-grandense-RS. Brasil. E-mail: toralles@pelotas.ifsul.edu.br

(4) Doctor en Ciencia de Alimentos, Profesor de la Universidade Federal do Rio Grande-RS. Brasil. E-mail: dqmwar@furg.br

(5) Doctor en Biologia molecular y vegetal, Profesor de la Universidade Federal de Pelotas-RS. Brasil. E-mail: cesarvrf@ufpel.edu.br

Caption: Figura 1--Superficie de respuesta para efecto interactivo de NaHC[O.sub.3] (X1) y de la velocidad de agitacion (X2) en el proceso de extraccion de invertasa (ILD) obtenida por autolisis de S. cerevisiae de pure de durazno (ISc) de la cv. Jubileu. La AR de 100% a 25[degrees]C y pH 5 igual a 14,7 U.[mg.sup.-1].

Caption: Figura 2--Comparacion entre los extractos no purificado de invertasas ISc no-liofilizada, lLSc liofilizada e ILC. Valor de proteina de 1 mg. [mL.sup.-1].
Tabla 1--Codificacion de las variables usadas en el diseno
experimental.

Codigo del    Concentracion de     Velocidad agitacion
nivel           NaHC[O.sub.3]           ([X.sub.2])
                 ([X.sub.1])
                     (mM)                  (rpm)

-1,414                50                    50
-1                   100                    100
0                    200                    200
1                    300                    300
1,414                350                    350

Tabla 2-Matriz del diseno experimental con los valores
codificados, los valores naturales y la respuesta.

Ensayo   Variables Codificadas  Variables naturales

         X1         X2          X1 (mM)    X2(rpm)   [Y.sup.a]

1        -1         -1          100        100       38,2 b
2        + 1        -1          300        100       98,5 a
3        -1         +1          100        300       32,0 b
4        +1         +1          300        300       0,0 c
5        0          0           200        200       100 a
6        0          0           200        200       97,8 a
7        0          0           200        200       99,3 a
8        -1,414     0           50         200       99,3 a
9        0          +1,414      200        350       0,0 c
10       +1,414     0           350        200       0,0 c
11       0          -1,414      200        50        24,3b

(1) Ya= valor medio de la variable respuesta en terminos de actividad
relativa (%AR), siendo que 100% de AR corresponde a una actividad de
14,7 Ux[mg.sup.-1] en pH 5 a 25[degrees]C. Valores medios seguidos de
la misma letra minuscula en la columna no difieren estadisticamente
por el test de Tukey.

Tabla 3--Coeficientes de regresion no lineal y de
determinacion (R2) del modelo matematico de segunda-orden
para extraccion de invertasa de pure de durazno cv. Jubileua.

      Coeficientes               Valores (b)

 Intercepto ([b.sub.o])     91,5 [+ or -] 3,44 **
       [b.sub.1]           -12,4 [+ or -] 2,10 **
       [b.sub.2]           -16,9 [+ or -] 2,10 **
       [b.sub.11]          -21,1 [+ or -] 2,50 **
       [b.sub.22]          -36,4 [+ or -] 2,50 **
       [b.sub.12]          -21,3 [+ or -] 3,00 **
       [R.sup.2]                    0,80

(a) Y=[b.sub.o] + [b.sub.1][X.sub.1] + [b.sub.2][X.sub.2] +
[b.sub.3][X.sub.3] + [b.sub.11][X.sub.1.sup.2] + [b.sub.22]
[X.sub.2.sup.2] + [b.sub.12][X.sub.1], [X.sub.2]; donde
[X.sub.1] = concentracion NaHC[O.sub.3] e [X.sub.2]= velocidad
de agitacion. Significativo (p < 0,01). (b) Valores [+ or -]
intervalo de confianza a p = 0,05. ** Significativo
(p[pounds sterling] 0,01)

Tabla 4--Analisis de varianza para el ajuste de un modelo de segunda
orden a los datos experimentales.

Origen de la    Modelo: Y = [b.sub.0] + [SIGMA] [b.sub.i][X.sub.i] +
variacion              [SIGMA] [b.sub.i,i] [X.sub.i.sup.2] +
                        [SIGMA][b.sub.i,j][X.sub.i][X.sub.j]

                  Suma       Grados de      Media      [F.sub.cal]
                cuadratica   libertad     cuadratica
                   (SC)         (GL)         (MC)

Modelo           46022,69        5         9204,54        22,9
Linear           10543,61        2
Cuadratico       30012,11        2
Interaciones     5466,97         1
Residuo          10864.59        27         402,39
Total            51346,33        33

F (5;27)=2,57 (valor tabulado)

Tabla 5--Actividad de los extractos de invertasa libre de
levadura comercial (ILC), de S. cerevisiae de pure de
durazno (ISc) purificados con solventes organicos.

                               ILC

           Actividad especifica    Recuperacion
             (U.[mg.sup.-1])                %

EB *       216,8 [+ or -] 16,3b    1,0     100
Acetona    201,0 [+ or -] 2,0 b   0,93    72,1
Etanol     275,6 [+ or -] 24,6a    1,3    69,5

                                  ISc

            Actividad especifica      Recuperacion
                  (U.mg-1)                     %

EB *         36,2 [+ or -] 1,9c       1,0     100
Acetona      74,8 [+ or -] 9,1 b      2,1    89,9
Etanol      108,4 [+ or -] 12, 9a     3,0    86,0

* EB es el extracto al 10% en volumen para ILC y 50% para ISc.
Valores medios seguidos de la misma letra minuscula en la
columna no difieren estadisticamente por el test de Tukey
(p<0,05).
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Author:Ferreira, Marcela Vega; Rossler, Aline Farias; Toralles, Ricardo Peraca; Ruiz, Walter Augusto; Romba
Publication:Revista Brasileira de Fruticultura
Date:Jun 1, 2018
Words:5172
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