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Optimizacion de una metodologia para el aislamiento y deteccion molecular de huevos de Toxocara canis en muestras de suelo.

Optimization a Methodology for the Isolation and the Molecular Detection of Toxocara canis Eggs in Soil Samples

1 Introduccion

Toxocara canis es un ascarido que parasita al sistema digestivo de los perros constituyendose en uno de los endoparasitos mas prevalentes en la poblacion canina, a nivel mundial [1]. Desde el punto de vista epidemiologico, T. canis es de importancia zoonotica por ser el agente causante de la toxocariosis humana, una enfermedad considerada un problema de salud publica en varios paises [2].

Las manifestaciones clinicas mas frecuentes asociadas con la infeccion por Toxocara canis se clasifican de acuerdo a los organos afectados. Se conocen dos sindromes principales: larva migrans visceral (VLM), que abarca las enfermedades asociadas con los organos mayores (rinones, bazo, cerebro) y larva migrans ocular (OLM), en el que la patologia y los efectos en el hospedador se limitan al ojo y el nervio optico [3, 4]. Sindromes menos graves se han descrito, como toxocariasis encubierta y toxocariasis comun [2]. La infeccion por T. canis, en los hospedadores naturales (perros) ocurre por la ingesta de huevos embrionados viables desde el suelo, o pueden adquirirse por via transplacentaria. En el huesped paratenico (seres humanos), la infeccion es dependiente de la contaminacion del medio ambiente con huevos infectantes presentes en las heces depositadas por los canidos [5, 6].

A pesar del aumento de la poblacion canina en Colombia, son pocas las investigaciones sobre la contaminacion ambiental por huevos de T. canis en areas de acceso publico. Uno de los problemas de estos estudios radica en que los metodos para el aislamiento y deteccion de los huevos del parasito, desde el suelo, son dispendiosos y dificiles de realizar cuando se trata de un gran numero de muestras [7]. Adicionalmente, la microscopia optica, que es el metodo tradicional para la identificacion de parasitos en muestras de suelo, es considerada poco eficiente para diferenciar entre los huevos de Toxocara y de otros ascaridos, debido a su alta similitud morfologica [8]. Por lo anterior, se han desarrollado algunos metodos moleculares para la identificacion precisa y el diagnostico de estos nematodos, utilizando marcadores ribosomales y mitocondriales. No obstante, una de las limitantes de estos metodos es la estandarizacion de un protocolo de preparacion de la muestra que sea rapido, economico y confiable, para la obtencion de un ADN de alta calidad y en cantidades adecuadas para su aplicacion en las pruebas moleculares [9].

El proposito de esta investigacion fue optimizar una metodologia para el aislamiento y deteccion de huevos de T. canis en muestras de suelo, mediante amplificacion del transcrito interno (ITS-2) del ADN ribosomal (ADNr) del parasito.

2 Materiales y metodos

2.1 Tipo de estudio

Para establecer la metodologia mas eficiente para el aislamiento y la deteccion de huevos de T. canis en muestras de suelo, se realizo un estudio analitico experimental.

2.2 Muestras

Se recolectaron muestras de suelo en el parque Sagrado Corazon de Jesus de la ciudad de Barranquilla, departamento de Atlantico (10[grados]59'36"N y 74[grados]49'5"W), durante el mes de diciembre de 2013 (Figura 1). El calculo del tamano de la muestra se baso en funcion del area verde aproximada del parque (1,3 hectareas), recolectandose una muestra cada 100 [m.sup.2] para un total de 13 muestras. Para la recoleccion del suelo se realizo un muestreo aleatorio estratificado, definiendose como unidad de muestreo el volumen de suelo resultante de recoger con una pala una parte de este, constituida por un area de 10 cm de largo x 10 cm de ancho x 3 cm de profundidad. Las muestras recogidas se guardaron en bolsas plasticas, las cuales fueron selladas y almacenadas a 4[grados]C.

[FIGURA 1 OMITIR]

2.3 Aislamiento de huevos de Toxocara sp desde el suelo

Las muestras de suelo fueron cernidas a traves de un tamiz de 4 mm, para eliminar hierbas y otro material particulado. La separacion de los huevos del Toxocara sp se realizo mediante centrifugacion/floculacion utilizando las siguientes soluciones: MgS[O.sub.4] (r = 1,2 g/mL), ZnS[O.sub.4] (r = 1,18 g/mL), NaCl (r = 1,18 g/mL) y solucion modificada de Sheather (azucar granulada, agua destilada y 1% de formaldehido) (r = 1,27 g/mL).

La centrifugacion/floculacion se realizo de acuerdo a la metodologia descrita por Dryden y colaboradores en 2005 [10], con algunas modificaciones. Brevemente, una muestra de 50 g de suelo se lavo con 60 mL de solucion salina (NaCl 0,9 % p/v) y se filtro a traves de gasa esteril; el residuo obtenido se descarto y el sobrenadante se distribuyo en tubos de 15 mL que fueron centrifugados por 5 min a 1500 x g. El sedimento se separo y se lavo varias veces hasta que el sobrenadante quedo transparente. Seguido, se le adiciono la solucion de flotacion. La mezcla se agito y se centrifugo por 5 min a 2000 x g. Los huevos de parasitos que quedaron en la superficie del liquido fueron recuperados mediante aspiracion con una pipeta Pasteur y se lavaron con solucion salina usando la siguiente relacion: 1 mL de suspension de huevos mas 14 mL de solucion salina (1:15, v/v). La mezcla se centrifugo por 5 min a 2000 x g, el sobrenadante se descarto y el sedimento conteniendo los huevos se mezclo con 1 mL de solucion salina. La presencia de huevos de Toxocara sp en esta suspension se confirmo por microscopia.

2.4 Extraccion de ADN

Esta etapa involucro la ruptura de la cubierta de los huevos de T. canis, extraccion y analisis espectrofometrico del ADN. Para debilitar y/o eliminar la cubierta del huevo del parasito se utilizo choque termico [11] asi: la muestra se congelo a -80[grados]C por 10 min e inmediatamente se calento a 100[grados]C por 2 min. El ciclo de congelacion/calentamiento se repitio cuatro veces. Posteriormente, un volumen de 100 [micron]L de la suspension anterior se extrajo con buffer de lisis compuesto por NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, Tris-HCl 10 mM, Triton 100 al 2%, SDS 0,5 % y proteinasa K (30 [micron]L). Las muestras se centrifugaron por 3 min a 10000 x g. El ADN se extrajo con 250 [micron]L de la mezcla fenol/cloroformo/alcohol isoamilico (25:24:1), seguido de precipitacion con etanol absoluto frio. El ADN precipitado se diluyo con 50 [micron]L de buffer TE (Tris-EDTA) 1X. La calidad y cantidad del ADN obtenido se determino mediante analisis espectrofotometrico (relacion absorbancia 260/280), empleando un equipo NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, West Palm Beach, EE.UU).

2.5 Amplificacion (PCR-ITS-2) de T. canis

Se selecciono el segundo espaciador del transcrito interno del ADNr de T. canis como marcador molecular para la identificacion del parasito, usando la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR-ITS-2). Se utilizaron iniciadores especie-especificos, disenados para las regiones 5,8s y 28s del ADNr, los cuales fueron descritos previamente (12): sentido NC13: 5 cents-ATCGATGAAGAACGCAGC-3 cents; antisentido NC2: 5 cents-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3 cents. El tamano esperado para el fragmento amplificado fue de 533 pb. La composicion de la mezcla de reaccion de PCR fue: 12,5 [micron]L de Master Mix PCR 100 2X (Corpogen), compuesta por 20 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 100 mM de KCl, 3,0 mM de Mg[Cl.sub.2] y 400 mM de cada dNTPs; 2,5 [micron]L de cada primer (100 pmol); 5 [micron]L ADN (10-50 ng); 2u de Taq polimerasa y 2,5 [micron]L de agua libre de ADNsa y ARNsa. Las condiciones de amplificacion fueron: desnaturalizacion inicial a 94[grados]C por 3 min; 35 ciclos de 94[grados]C 1 min, 55[grados]C 1 min y 72[grados]C 1 min; extension final a 72[grados]C por 5 min en un equipo MJ Research PTC-200 Thermal Cyclera. El control positivo de la reaccion de PCR fue ADN de huevos de T. canis, obtenido previamente. El control negativo fue agua libre de ADNasa y ARNasa.

La deteccion de los productos de PCR se realizo mediante electroforesis en geles de agarosa al 1,5 % p/v, en un equipo horizontal Mini-Sub Cell GT[TM] BioRad. La corrida electroforetica se realizo a 100 voltios durante 60 min, utilizando buffer TBE 1X. Los geles de agarosa se tineron con solucion de Bromuro de Etidio (10 mg/mL) y se visualizaron en un Fotodocumentador Gel Doc-It2 310a con luz UV. El tamano del producto de PCR se calculo usando como referencia un marcador de peso molecular (Ladder 100 pb).

2.6 Secuenciacion

Uno de los amplificados que mostro buena resolucion en la electroforesis fue analizado mediante la tecnica de secuenciacion por extension del iniciador, en ambos sentidos, con el equipo 3730XL DNA Analyzer (Applied Biosystems[TM]), usando el kit comercial BigDye[R] Terminator (Applied Biosystems[TM]) y los iniciadores NC13 y NC2. Las secuencias consensos se derivaron de las obtenidas de cada hebra de ADN, utilizando el programa MEGA 5.05. Con la herramienta BLASTN (http://www.blast.ncbi.nlm.nih. gov) se determino el porcentaje de similitud de las secuencias obtenidas con respecto a las reportadas en la base de datos del Genbank.

2.7 Analisis de los resultados

La eficiencia de cada solucion de floculacion para aislar los huevos de T. canis desde suelo, se determino en funcion de la concentracion y la pureza del ADN extraido. Los datos obtenidos se sometieron, inicialmente a un analisis de varianza (ANOVA). Los analisis entre grupos fueron hechos con el test de comparaciones multiples de Tukey, un valor de p < 0,05 fue considerado estadisticamente significativo. Todas las pruebas se realizaron con el paquete estadistico SPSS version 21.0 para Windows (SPSS, Inc., Chicago).

3 Resultados

3.1 Aislamiento de huevos de Toxocara sp desde el suelo

Los resultados indican que la solucion modificada de Sheather (r= 1,27 g/mL) y la solucion de Mg[Cl.sub.2] (r= 1,20 g/mL) fueron las mejores para la separacion de huevos de T. canis desde el suelo analizado, lo cual fue evidenciado por la concentracion y pureza del ADN obtenido. El valor de la media de la concentracion de ADN de las 13 muestras de suelo, incluidas en el estudio, se presenta en la Tabla 1.

El analisis de varianza indica que existe diferencia estadisticamente significativa entre las concentraciones de ADN extraidas, sugiriendo que la solucion de flotacion influye en la recuperacion de los huevos de parasitos desde el suelo (p < 0,05). La prueba de comparacion multiple entre medias (test de Tukey) sugiere que las concentraciones de ADN obtenidas con la solucion modificada de Sheather (r= 1,27 g/mL) son estadisticamente diferentes a las obtenidas con las otras soluciones. En cuanto a la variable pureza del ADN, no se observo diferencia significativa entre las soluciones de flotacion ensayadas (Tabla 2).

En este estudio solo se visualizaron los huevos de Toxocara spp., en el suelo tratado con solucion modificada de Sheather. Por microscopia, 5 de 13 muestras (38,5%) fueron positivas, lo que sugiere una mayor eficiencia de esta solucion. El aislamiento de huevos y larvas del T. canis, desde muestras ambientales, es uno de los pasos fundamentales en la evaluacion de la contaminacion por geohelmintos de importancia zoonotica. La bibliografia reporta una gran variedad de metodologias que comparan tecnicas de recuperacion de los huevos de Toxocara desde suelo. Sin embargo, los resultados que se describen son muy variables [13, 14]. Actualmente se reconoce que existen muchos factores que influyen de manera directa en la tasa de recuperacion de huevos de Toxocara. Algunos de los mas relevantes son: el tipo de suelo, el tamizado de pre-tratamiento, el lavado y resuspension de sedimentos, y la densidad especifica de las soluciones de flotacion [10, 15, 16].

Varios estudios coinciden en que la solucion de floculacion de los huevos del parasito es un factor determinante en las evaluaciones de contaminacion por geohelmintos en muestras de campo. Ruiz de Ybanez y col., en 2000 [15] describieron tasas de recuperacion de T. canis entre 3,21% a 99,98 %, al emplear la solucion modificada de Sheather (r entre 1,20 y 1,27 g/mL). Estos investigadores, y otros mas, tambien describieron tasas menores de recuperacion de huevos de Toxocara, usando soluciones de floculacion compuestas por NaCl (r= 1,209 g/mL) y ZnS[O.sub.4] (r= 1,09 a 1,27 g/mL) [17, 18].

3.2 Amplificacion (PCR-ITS-2) de T. canis

La reaccion de PCR permitio confirmar la identidad del ADN extraido desde la suspension de huevos de Toxocara separados con la solucion modificada de Sheather, obteniendose amplificados del tamano esperado (533 pb). Siete (53,84%) de las 13 muestras de suelo recolectadas en el Parque Sagrado Corazon de Jesus de la ciudad de Barranquilla fueron positivas para T. canis (Figura 2).

[FIGURA 2 OMITIR]

Se observo que el porcentaje de muestras positivas por PCR fue mayor al obtenido en la evaluacion microscopia (38,5%). Esta diferencia podria explicarse por la alta sensibilidad de la PCR, la cual es capaz de detectar hasta 2 parasitos por muestra (dato no mostrado). Adicionalmente, el resultado de la secuenciacion de nucleotidos, de uno de los amplificados, mostro un porcentaje de similitud del 99% con el 1TS2 del ADNr de T. canis (GenBank: AB110032.1) (Figura 3).

[FIGURA 3 OMITIR]

La contaminacion del suelo por formas infectantes del nematodo T. canis ha sido descrita en parques publicos de algunos paises en Europa [19, 20], Asia [21, 22] y America Latina [23, 24, 25, 26]. En la mayoria de estas investigaciones, la metodologia usada para deteccion de T. canis involucro un paso inicial de aislamiento de los huevos por la tecnica de flotacion, seguido de identificacion por microscopia con base a caracteres morfologicos y tamano tipico.

En Colombia, la contaminacion con huevos de Toxocara y otros parasitos zoonoticos fue descrita en parques de la localidad de Suba, Bogota [27] y en el municipio de Bucaramanga, Santander [28]. En ambos estudios se empleo la tecnica de flotacion para el aislamiento de los huevos del Toxocara, seguido de identificacion por microscopia, reportandose porcentajes de positividad del 0,90% y 3,77%, respectivamente. Estos resultados podrian estar subestimando la frecuencia real de este parasito en el suelo de parques publicos, como lo sugiere el alto porcentaje de cachorros infectados con T. canis, reportados en Bogota, durante 1987-1988 (43,6%) y en el ano 2000 (66,7%) [29, 30]. A pesar de que la microscopia es considerada la prueba de oro para la identificacion de huevos de Toxocara spp en suelo, desde hace algunos anos se estan empleando tecnicas alternativas mas sensibles y especificas como la PCR. Un estudio publicado recientemente por Khademvatana y colaboradores (2014), describe una mayor eficiencia de la tecnica PCR-ITS-2 para la deteccion de huevos de T. canis en muestras de suelo colectadas en plazas, calles, parques publicos, y vertederos de basura de la poblacion de Ahvaz, en el suroeste de Iran. En este estudio los huevos de Toxocara fueron aislados por floculacion con solucion de NaN[O.sub.3] (r= 1,3 g/mL) y el ADN usado para la PCR fue extraido con el estuche comercial QIAamp DNA Mini, previa digestion con proteinasa K [21]. Nuestro estudio presenta una estrategia similar, sin embargo, la extraccion del ADN se realizo con un buffer de lisis, lo cual disminuiria los costos al aplicarse este procedimiento en estudios epidemiologicos, donde se procesa un gran volumen de muestras.

4 Conclusion

A pesar de que el tamano de la muestra en el presente estudio fue bajo (N = 13), se observo que la estrategia de aislamiento de los huevos del parasito por floculacion con solucion modificada de Sheather y posterior amplificacion del transcrito interno (ITS-2) del ADN ribosomal (ADNr) de T. canis (PCR-ITS-2), es una metodologia eficiente para evaluar la contaminacion de suelo por huevos de este nematodo. Esta metodologia podria aplicarse en estudios epidemiologicos que evaluen el riesgo de Toxocariasis en la poblacion susceptible que acude a los parques publicos en Colombia.

Dary Luz Mendoza Meza

Universidad del Atlantico

Humberto Maldonado Santana

Universidad del Atlantico

Recived: October 31, 2014

Accepted: February 23, 2015

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Direccion de los autores

Dary Luz Mendoza Meza Programa de Quimica, Universidad del Atlantico, Barranquilla--Colombia darymendoza@mail.uniatlantico.edu.co

Humberto Maldonado Santana Programa de Biologia, Universidad del Atlantico, Barranquilla--Colombia maldonadohjs@gmail.com
Tabla 1. Concentracion y pureza del ADN de huevos de parasitos
recuperados del suelo.

Solucion de    Densidad     [ADN] ng/[micron]L     Pureza (A260/280)
Flotacion      ([rho])

NaCl             1,18     177,47 [+ o -] 199,21    1,75 [+ o -] 0,199
MgS[O.sub.4]     1,20     389,10 [+ o -] 167,08    1,94 [+ o -] 0,181
ZnS[O.sub.4]     1,18      101,30 [+ o -] 43,66    1,65 [+ o -] 0,031
Sheather         1,27     1692,75 [+ o -] 279,05   1,96 [+ o -] 0,068

* N = 13 muestras de suelo.

Tabla 2. Resultados del test de comparacion de Tukey para
la concentracion y pureza del ADN.

Solucion de Flotacion        Concentracion       Pureza
                            (ng/[micron]L)     (A260/280)

                           Subconjunto        Subconjunto

                           1        2         1       2

DHS de     ZnS[O.sub.4]    101,30             1,655
  Tukey    NaCl            177,47             1,755   1,755
  (a, b)   MgS[O.sub.4]    389,10             1,940   1,940
           Sheather                 1692,75           1,960
           Significancia   0,202    1         0,058   0,209

Se muestran las medias de los grupos de subconjuntos homogeneos.

(a.) Usa el tamano muestral de la media armonica = 4,0

(b.) Alfa = 0,05.
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Author:Mendoza Meza, Dary Luz; Maldonado Santana, Humberto
Publication:Revista de Ciencias
Date:Aug 1, 2015
Words:4169
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