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Obtencion de escopolamina en biorreactor a partir de cultivos de raices de Brugmansia candida.

Resumen

Teniendo en cuenta la importancia farmacologica de los alcaloides del tropano y la posibilidad de producirlos a partir de cultivos de tejidos de vegetales de especies como la Brugmansia candida, en este trabajo se evaluo la produccion de uno de estos alcaloides a partir del cultivo de raices adventicias en biorreactor. Para ello se desarrollo un sistema de reaccion compuesto por dos unidades, una de crecimiento y otra de acondicionamiento del medio, y se evaluo la produccion de biomasa y de este alcaloide luego de 21 dias de cultivo, obteniendo como resultado 9,5 mg de escopolamina/g de raices secas, resultado mayor al obtenido anteriormente en cultivos de raices de este tipo en matraces de Erlenmeyer (6 mg/g de raices secas), e incluso superior a lo reportado para cultivos de raices transformadas de B. candida mediante biorreactor. Respecto a la biomasa, se obtuvo un indice de crecimiento de 1,58, similar al de 1,4 obtenido en matraces de Erlenmeyer, lo que sugiere que el cambio de escala no afecto de manera negativa la produccion de biomasa.

Palabras clave: biorreactor, cultivos de raices, alcaloides del tropano, escopolamina, Brugmansia candida.

Scopolamine production from Brugmansia candida roots culture using a bioreactor

Abstract

Given the pharmacological importance of tropane alkaloids and the possibilityof producing them from plant tissue cultures of plant species such as Brugmansia candida, the main goal of the present paper was to evaluate the alkaloid production of root cultures developed ina bioreactor. We set up a bioreaction system consisting of two units, one for biomass growth and the other one for liquid medium conditioning. After 21 days of culture, biomass and scopolamine production were evaluated, resulting in the extraction of 9.5 mg of scopolamine/g of dry roots. This value was higher than the one obtained in a previous culture in Erlenmeyer flasks (6mg/g of dry roots) and higher than the scopolamine extracted from hairy roots cultures using a bioreactor reported in other studies. Regarding biomass, the growth index (GI) was 1.58, similar to the GI obtained with cultures in Erlenmeyer flasks (GI 1.4), which suggests that scaling up the process did not affect biomass production negatively.

Key words: Bioreactor, roots culture, tropane alkaloids, scopolamine, Brugmansia candida.

Introduccion

La Brugmansia candida es una especie conocida por su capacidad para producir un grupo de alcaloides entre los que se incluyen la escopolamina, la anisodamina y la hiosciamina, compuestos con una amplia gama de aplicaciones en medicina como agentes anticolinergicos, antiespasmodicos, midriaticos y sedantes (Cardillo, A., Otalvaro, A., Busto, V., Talou, J., Velasquez, M., Giulietti, A., 2010).

En estudios anteriores se establecio que estos alcaloides se sintetizaban en las raices de la planta y que luego viajaban a traves de su xilema hasta las hojas (Wink, 1987). Esta es la razon por la cual, en la actualidad, la produccion masiva de estos alcaloides se hace a traves de la extraccion de toneladas de hojas de cultivos de plantas que ya han alcanzado la madurez. En Australia, por ejemplo, se cultivan hibridos de B. candida para producir hojas jovenes cuyo contenido de escopolamina es equivalente al 0,34 % de su masa, y la produccion promedio en un cultivo no fertilizado es de 4.360 kg de hojas secas por hectarea y por ano, lo que se traduce en una produccion de 14,8 kg de escopolamina por hectarea cultivada y por ano (Griffin & Lin, 2000). Sin embargo, debido a las caracteristicas desfavorables de los cultivos agronomicos, continuamente se buscan alternativas para su produccion que resulten mas ventajosas. Entre ellas, el cultivo in vitro de raices se presenta como una buena opcion (Garcia, L. A., Perea., M., Reguero, M. T., 1993; Pitta-Alvarez, S. I., 1998; Nino, J., Gallego, C. M., Correa, Y. M., Mosquera, O. M., 2003; Mahagamasekera, M. G. P., Doran, P. M., 1998; Gontier, E., Clement, A., Tran, T. L. M., Gravot, A., Lievre, K., Guekert, A., Bourgaud, F., 2002). Hasta ahora, estos cultivos se han desarrollado en bancos, y la produccion de los compuestos por esta via es todavia muy limitada. Pineros, 2005, realizo estudios sobre la produccion in vitro de escopolamina en cultivos de raices de B. candida enmatraces de Erlenmeyer (250 mi),y logro producir un maximo de escopolamina de 6 mg/g de raices secas.

En trabajos anteriores de cultivo de raices de B. candida, se ha observado que en matraces de Erlenmeyer la produccion de biomasa se incrementa cuando existe agitacion, sin embargo, este mismo factor afecta negativamente la produccion de alcaloides. Los valores reportados de la produccion de escopolamina a los 20 dias de cultivo son de 0,4 y 0,780 mg/g de raiz humeda en cultivos con agitacion y sin esta, respectivamente (Pitta-Alvarez, S., 1998; Pitta-Alvarez, S., Giulietti, A.M., 2001).

Puesto que usado para este fin el cultivo in vitro de raices convencional presenta algunas desventajas como la velocidad lenta de produccion de biomasa, la necesidad de auxinas para promover el crecimiento de las raices (que en algunos casos provoca ladisminucion en el contenido de alcaloides), y la dificultad para mantener la estabilidad del cultivo y de la produccion de metabolitos secundarios, se ha reconocido el potencial que representa el cultivo de raices transformadas como herramienta para la obtencion de productos vegetales sintetizados en la raiz (Flores, H. E., Filner, P. 1985; Hamill, J. D., Parr, A. J., Robins, R. J., Rhodes, M. J. C., 1986; Kamada, H., Okamura, N., Satake, M., Harada, H., Shimomura, K., 1986).

Sin embargo, en un estudio anterior llevado a cabo con raices transformadas para la obtencion de alcaloides del tropano en biorreactor, la produccion de escopolamina fue menor a la obtenida en matraces de Erlenmeyer con raices no transformadas que ya se menciono (0,05 mg/g de raices secas) (Cardillo, A., Otalvaro, A., Busto, V., Talou, J., Velasquez, M., Giulietti, A., 2010). Esto sugiere que, entre otros factores, el proceso de transformacion puede afectar negativamente la produccion de escopolamina en este caso particular.

Asimismo, trabajos como el de Carrizo, C., Pitta-Alvarez S., Kogan, M., Giulietti, A., Tomaro, M., (2001) han reportado que, ademas de los alcaloides esperados (escopolamina, hiosciamina y anisodamina), en estos cultivos de raices transformadas de B. candida se detecta la presencia de otras sustancias como la cadaverina. Esta sustancia, que no se hace presente en la totalidad de los tejidos de la planta y se obtiene unicamente en respuesta a un factor de estres, es una poliamina que tambien ha sido detectada en el genero Datura.

De otro lado, cuando se busca llevar los procesos que han sido viables enmatraces de Erlenmeyer a una escala de produccion mayor pasando al biorreactor, es necesario considerar que se presentan ciertas limitaciones, principalmente asociadas a problemas de transferencia de masa (oxigeno, nutrientes, etc.), y a la homogeneidad de las celulas del cultivo. Estos inconvenientes pueden conducir a la generacion de estres y, en algunos casos, a la lisis celular, ocasionando la perdida del cultivo (Wyslouzil, B. E., Whipple, M., Chatterjee, C., Walcerz, D. B., Weathers, P. J., Hart, D. P., 1997. Kino-Oka, M., Hitaka, Y., Taya, M., Tone, S., 1999). Ademas, la produccion de metabolitos en biorreactor esta sujeta a ciertos factores, entre los que se encuentran la adicion de reguladores del crecimiento, especialmente auxinas y citocianinas, que inducen la indiferenciacion celular y promueven la proliferacion in vitro; las variaciones en la concentracion de nutrientes del medio, que dependen de los objetivos del cultivo; la adicion de 'elicitores'; el estres fisico o quimico que puede inducir la liberacion de metabolitos; los factores fisicos que incluyen la luz, la temperatura, el pH del medio, la aireacion, la densidad celular y factores biologicos tales como las mutaciones y demas alteraciones geneticas inducidas que pueden modificar el cultivo y sus productos derivados. Tambien se debe considerar la configuracion del biorreactor, de modo que esta sea la mas adecuada para la produccion del metabolito deseado, para lo cual se deben analizar los modelos reportados (de tipo airlift, de columna simple, de columna de burbujeo, de niebla, de tanque agitado, etc.), y las caracteristicas del crecimiento del cultivo de acuerdo a sus necesidades particulares (Green & Thomas, 1996;Chatterjee, et al., 1997; Jung, et al., 1998; Mahagamasekera & Doran, 1998; Kino-Oka, et al., 1999; Hitaka, et al., 2000; Doran, 1997; Takahashi, et al., 2001; Weathers & Kim, 2001; Zobayed & Saxena, 2003; Huang, et al., 2004; Suresh, et al., 2004; Zobayed, et al., 2004; Suresh, et ai, 2005, Luczkiewicz & Kokotkiewicz, 2005, Martin & Vermette, 2005, Savitha, et al., 2005, Guillon, et al., 2006).

Por esta razon, en este estudio se pretendio hacer un acercamiento al incremento de la produccion de alcaloides del tropano, especificamente de escopolamina, en un biorreactor a partir de cultivos de raices no transformadas de B. candida, con el objeto de establecer su potencial para crecer y producir el metabolito en tales condiciones.

Materiales y metodos

Material vegetal

Se emplearon semillas de B. candida recolectadas en el campus de la Universidad Nacional de Colombia. El arbol del que provenia el material esta inventariado en el Herbario Nacional del Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia bajo el codigo 223783.

Obtencion de raices esteriles normales de B. candida

Esta etapa involucro varios procesos: la desinfeccion de los frutos y de los embriones de B. candida siguiendo el procedimiento descrito por Pineros, 2005, y la siembra de los embriones en 15 mi de medio B5 (Gamborg, et al., 1969) con suplemento de 20 g/1 de sacarosa, sin hormonas vegetales y con agar en una proporcion de 10 g/1. Este procedimiento se llevo a cabo en frascos de 50 mi con cubiertas de papel de aluminio. En cada frasco se plantaron entre dos y tres embriones. La incubacion se hizoa temperatura ambiente y en condiciones de oscuridad.

A continuacion se describe la operacion del sistema de biorreaccion en el cual se desarrollo el cultivo de las raices por duplicado.

Preparacion de los inoculos de raices normales de B. candida usados en el sistema de biorreaccion

Los inoculos usados en el sistema de biorreaccion correspondian a las raices esteriles (de 1,5 a 2 cm) obtenidas en los frascos con medio solido en donde se cultivaron los embriones durante 30 dias. Para preparar el inoculo, se hizo el corte de las raices desde los embriones y la separacion de los segmentos de tallo en la camara de flujo laminar. El material se reunio en un recipiente esteril y se registro el peso fresco total que representaba la masa de inoculo.

Adaptacion del sistema de biorreaccion para el cultivo de raices normales de B. candida

Se utilizo un sistema de dos unidades (reservorio y unidad de crecimiento) adaptado para el cultivo de las raices normales de B. candida. En el reservorio se mantenia el medio de cultivo y se realizaba el registro de las condiciones de pH, de temperatura y el oxigeno disuelto proveniente del medio. En un futuro, el uso de esta unidad permitira implementar sistemas con reemplazo de medio para facilitar la extraccion del producto o para controlar accidentes debidos a la contaminacion. Se conto con un reactor Applikon[R] Z61101C006 de 3,2 1 de capacidad (H/D=1,9) para el reservorio, el cual se acondiciono instalando en su interior un sistema de control de temperatura por medio de un intercambiador de calor, asi como sensores de temperatura y de pH, una sonda para la toma de muestras, un sistema de agitacion (turbina Rushton) y una sonda para la salida constante de medio hacia la unidad de crecimiento. Cada cinco dias se verificaba el contenido de azucares, nitrogeno y alcaloides en el medio de cultivo y se retiraban 20 mi de este. Para todos los ensayos, la unidad se cargo inicialmente con 2 mi de medio de cultivo previamente esterilizados.

El sistema de biorreaccion completo contaba, ademas, con una unidad de crecimiento compuesta por un recipiente de vidrio de doble fondo que permitia la circulacion de agua para mantener constante la temperatura en su interior y una malla de acero inoxidable que actuaba como soporte de las raices. Esta malla tenia una amplitud de poro de 1 mm y se ubico a 5 cm de la tapa y a 18 cm del fondo de la unidad de crecimiento, con el fin de dar espacio al desarrollo completo de las raices, las cuales alcanzan una elongacion maxima de 20 cm durante el periodo de cultivo segun lo reportado por Pineros, 2005.

En la unidad de crecimiento se coloco una boquilla para el suministro del medio. La distancia entre la malla y la tapa, asi como el diseno de la boquilla, garantizaron que la aspersion fuera homogenea sobre toda el area de la malla y cubriera completamente la masa de raices. Ademas de la boquilla para la entrada del medio, la tapa de esta unidad tenia dos puertos, uno donde se instalo una sonda para la salida del medio desde la unidad de crecimiento hacia el reservorio, y otro acondicionado con un filtro de 0,22 [micron]m para la salida del aire que ingresaba a la unidad.

El aire empleado para el crecimiento provenia de un aireador y era conducido a traves de mangueras de silicona a una unidad de humidificacion antes de su ingreso al proceso; el flujo de aire empleado fue de 0,47 1/min (correspondientes a 0,24 vvm). La unidad de crecimiento se cubrio para oscurecer su interior, ya que cuando los cultivos se desarrollaban en presencia de la luz, el crecimiento de las raices se daba de forma paralela al desarrollo de segmentos de tallo.

Operacion del sistema de biorreaccion para el crecimiento de raices no transformadas de B. candida

Despues de inocular la unidad de crecimiento colocando las raices (3,0 g de raices frescas/1) sobre la malla de acero inoxidable, se anadieron 0,5 g/1 de ampicilina y 0,5 ml/lde nistatina (100.000 Ul/ml) al medio de cultivo que se encontraba en el reservorio para controlar posibles contaminaciones. En cuanto a las condiciones del ensayo, luego de anadir el antibiotico y el antimicotico, el pH del medio de cultivo fue de 7,0. Para evitar la deshidratacion y la perdida de viabilidad de las raices, el flujo de aire y de medio debia iniciarse rapidamente. El flujo de medio que entraba a la unidad de crecimiento se mantuvo en 0,30 ml/s, mientras que el flujo de medio que salia de la unidad se estabilizo en 0,39 ml/s; estos flujos se ajustaron para evitar que el medio se acumulara en la unidad de crecimiento y asi garantizar su continuo movimiento entre las dos unidades. Ademas, la operacion en el sistema de biorreaccion se desarrollo de modo que el aire se mezclara con el medio de cultivo en la boquilla de ingreso a la unidad de crecimiento, generando burbujas muy finas de medio que facilitaban su aspersion uniforme sobre las raices.

Seguimiento del cultivo de las raices no transformadas de B. candida en el reactor

Las condiciones en la unidad de reservorio, es decir el pH y la temperatura del medio, se registraban a diario. Cada cinco dias se tomaba una muestra del medio de cultivo para determinar la concentracion de alcaloides y azucares.

Procedimiento de 'elicitacion' de las raices no transformadas de B. candida en el sistema de biorreaccion

De acuerdo con los desarrollos obtenidos por Pineros, 2005, quien establecio las ventajas del uso de sulfato de cobre como elicitor, se aplico esta sustancia al medio de cultivo en la dosis indicada (0,2 mM) en el dia 21 del cultivo, manteniendo las mismas condiciones del periodo de crecimiento. El elicitor se dejo actuar durante 24 horas, al cabo de las cuales se daba por terminado el ensayo. En este momento se detenian las bombas y el suministro de aire y se procedia a abrir ambas unidades, se recogia una ultima muestra del medio liquido y se recolectaban las raices.

Determinaciones analiticas

Determinacion de peso fresco. El peso fresco de las raices (PF) se determino luego de filtrar el medio de cultivo, lavar las raices con abundante agua y secarlas de forma rapida con papel absorbente.

Determinacion del peso seco. El peso seco de las raices (PS) se determino luego de secarlas en una estufa a 80 [grados]C hasta obtener un peso constante (Perry, 1981).

Determinacion de la humedad. La humedad se determino usando la informacion del peso fresco (PF) y el peso seco (PS).

Extraccion del alcaloide

Para cuantificar la escopolamina presente tanto en las raices como en el medio de cultivo, se hizo necesaria su extraccion aplicando los protocolos empleados por Pineros, 2005. Para las raices, el proceso consistio en la extraccion solido-liquido de 0,5 g de raices con 40 mi de una solucion compuesta por cloroformo, metanol y amoniaco (15:5:1) a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100 r.p.m durante 72 horas. A continuacion se mezclaba la solucion resultante con 50 mi de agua y 25 mi de cloroformo en un embudo de decantacion del que se recuperaba la fase organica, lacual se sometia a evaporacion con aire y resuspension en la fase movil para la cuantificacion del alcaloide. Dicha cuantificacion se realizo por cromatografia liquida de alta eficacia (CLAE) con el metodo descrito por Pineros, 2005. La escopolamina se identifico tomando como base el tiempo de retencion del estandar (-) escopolamina HBr trihidratada (Sigma Aldrich) y se cuantifico por medio de una curva de calibracion. Para este ensayo se conto con un equipo Waters[R] (Milford, MA, Estados Unidos) que contaba con un detector de absorbancia UV 486 programado a 210 nm. El software para el analisis de los datos usado fue el Millenium 2000 de Waters (Milford, MA, Estados Unidos). Para el analisis del alcaloide se uso como fase movil una mezcla que contenia 10% en volumen de acetonitrilo, 89% de una solucion de 50 mM de K[H.sub.2]P[O.sub.4] y 1% de trietanolamina, y se trabajo con cromatografia isocratica. El pH de la fase movil se ajusto en 3,5 empleando acido fosforico y flujo de 1 ml/minuto. La columna empleada para la separacion fue una C18 en fase reversa (Chromolith performance RP-18e de 100 mm de longitud y 4,6 mm de diametro interno, Merck KG A 64271, Darmstadt, Alemania). Todas las pruebas se desarrollaron a temperatura ambiente y se establecio un tiempo de analisis de 15 minutos para cada una; la inyeccion en el equipo fue manual y su volumen fue de 20 mi. Las muestras inyectadas correspondieron a los extractos obtenidos disueltos de nuevo en la fase movil.El tiempo de retencion para la escopolamina se determino en 4,8 [+ o -] 0,5 minutos.

Determinacion de azucares por cromatografia liquida de alta eficacia

La determinacion se hizo cuantificando la cantidad de sacarosa, de glucosa y de fructosa presente en el medio de cultivo durante el tiempo de cultivo. Los azucares se identificaron con base en los tiempos de retencion de los estandares de sacarosa, glucosa y fructosa (Sigma Aldrich) y la cuantificacion se llevo a cabo por medio de una curva de calibracion. Para la realizacion de este ensayo se conto con un equipo Waters [R] (Milford, MA, Estados Unidos) equipado con un detector de indice de refraccion IR 410. Los datos se analizaron con el software Millenium 2000 de Waters[R] (Milford, MA, Estados Unidos). Para este analisis se uso como fase movil agua desionizada a un flujo volumetrico de 0,5 ml/min. La columna empleada para la separacion fue una Sugar-Pak[TM] de 300 mm de longitud y 6,5 mm de diametro. Todos los analisis se desarrollaron a una temperatura de 84 [grados]C. El tiempo de cada analisis se establecio en 15 minutos. Los tiempos aproximados de retencion para los tres azucares evaluados fueron los siguientes: sacarosa, 7,49 [+ o -] 0,2 minutos, glucosa, 9,46 [+ o -] 0,09 minutos y fructosa, 11,8 [+ o -]0,04 minutos.

Determinacion por espectrofotometria del nitrogeno presente en el medio de cultivo

Esta determinacion se realizo solamente en uno de los ensayos y buscaba caracterizar el consumo de nutrientes, especificamente de las fuentes de nitrogeno, a lo largo del tiempo de crecimiento de las raices. Se uso un espectrofotometro NANOCOLOR[R] 500 D (Macherey Nagel) a 365 nm despues de que las muestras se pusieran en contacto con 2,6-dimetil fenol mezclado con acido sulfurico/acido fosforico, segun lo descrito para la determinacion de nitratos en el Test 1-65 del catalogo del equipo empleado.

Resultados y discusion

Operacion del biorreactor

En cuanto a la configuracion de las dos unidades empleadas para el cultivo, se presentaron inconvenientes a la hora de evacuar el aire suministrado en la unidad de crecimiento, yaque esta contaba unicamente con una salida, la cual se vio afectada por la caida de la presion a traves de un filtro de 0,20 [micron]m, lo que ocasiono problemas por el incremento de la presion en el sistema. Para superar estos inconvenientes fue necesario cambiar el filtro por lo menos una vez durante el cultivo para evitar que se taponara, e instalar otras salidas en el biorreactor para facilitar la evacuacion del aire de exceso. En el laboratorio se usaron mangueras de silicona para el transporte del medio entre las dos unidades. La fragilidad de dichas mangueras, y el continuo desgaste al que se ven sometidas por la accion de las bombas peristalticas, hace pensar que se deben considerar otro tipo de duetos para el transporte del medio entre las unidades si se quiere llegar a una escala superior de produccion.

Es importante destacar que cuando se anadio el sulfato de cobre durante el ultimo dia del ensayo, el pH disminuyo de manera considerable.

En cuanto a los resultados relativos al cambio en la concentracion de azucares en el medio a lo largo del cultivo, se evidencio que el mayor consumo de azucares se presento durante los 12 primeros dias, al cabo de los cuales esta variable tendio a estabilizarse, pasando de los 20 g/1 iniciales a una concentracion de azucares aproximada de 12 g/1; durante este tiempo se observo un consumo aproximado del 40%, lo que coincide con los consumos presentados por Pineros, 2005, para cultivos de raices no transformadas de B. candida en matraces de Erlenmeyer y con los resultados de Cardillo, A., Otalvaro, A., Busto, V., Talou, J., Velasquez, M., Giulietti, A., 2010 para cultivos de raices transformadas de esta misma especie en biorreactor.

Respecto al crecimiento de las raices, se conto con un inoculo de 5,95 [+ o -] 0,07 g y a los 21 dias de cultivo se llego a una masa final de 15,36 [+ o -] 1,33 g (Figura 1).Estos pesos corresponden a raices frescas. La humedad de las raices fue de 92,5 [+ o -] 0,7 %. Con esta informacion se determino el indice de crecimiento de las raices de acuerdo con la ecuacion.

IC = (15,36 - 5,95)/5,95 IC = 1,58

En este caso, el indice de crecimiento fue de 1,58, que es un valor mayor al obtenido en las raices evaluadas en la curva de crecimiento cuando el cultivo se hizo en matraces de Erlenmeyer de 125 mi, en las cuales se alcanzo un indice de crecimiento de 1,4 (Otalvaro, 2009).

Carrillo, et al., 2010, encontraron que en un cultivo de raices transformadas de B. candida desarrollado en un sistema de biorraccion por inmersion con mallas de soporte, el indice de crecimiento fue de 3,93, valor muy superior al reportado en este trabajo, lo que ratifica que la transformacion de las raices fomenta su crecimiento (Veena & Taylor, 2007).

Analisis cuantitativo de escopolamina por cromatografia liquida de alta eficacia

Se analizaron las muestras del medio de cultivo tomadas en los dias 4, 8, 12, 16, 20 y 21 para determinar el contenido de escopolamina. En ninguna de las muestras se observo la presencia del metabolito en cantidades detectables (nivel de deteccion minimo: 0,01 mg de escopolamina/ml). Estos resultados indican que no hubo liberacion del alcaloide al medio de cultivo o que, si la hubo, se encontraba por debajo de los limites de deteccion del metodo empleado. Con estos resultados se confirmo el hecho presentado por otros investigadores en el sentido de que la presencia del metabolito en el mediono se evidencia en cultivos que no han sido expuestos a un agente elicitor (Pineros, 2005; Liu, et al., 2003).

La aplicacion de 0,2 mm de sulfato de cobre con el proposito inicial de favorecer la liberacion del metabolito al medio bajo las condiciones experimentales probadas, no arrojo un resultado positivo. Esta situacion pudo deberse a que el contacto entre el elicitor y la masa de raices generado por la aspersion no fue suficiente, como si lo fue para las unidades experimentales de menor volumen y cultivos sumergidos, donde la probabilidad de interaccion entre la biomasa y el compuesto elicitor es mucho mayor y donde el estres mecanico tambien actua como precursor de la liberacion del metabolito al medio de cultivo (Dornenburg, H., Knorr, D., 1995).

En cuanto a la escopolamina extraida de las raices, se determino un valor de 9,5 [+ o -] 3,04 mg/g de raices secas, equivalente a 0,73 [+ o -] 0,23 mg/g de raices humedas; dicho resultado es mayor que el valor promedio encontrado por Pineros, 2005, deo mg/g de raices secas reportado para cultivos en matraces de Erlenmeyer. Sin embargo, el valor fue menor al maximo reportado por Grajales, 2008, al evaluar tres tratamientos en los cuales se aplicaba L-arginina en concentraciones de 10, 100 y 1.000 mg/lcomo precursora de la escopolamina en el medio de cultivo de Schenk y Hilderandt, obteniendose un rendimiento de 10,134 mg/g con el tratamiento 3 (1.000 mg/L de L-arginina) en el dia 15 del cultivo.

De otro lado, en el trabajo de Cardillo, et al., 2010, sobre el cultivo de raices transformadas en biorreactor, los autores reportan una produccion del metabolito de 0,05[+ o -] 0,01 mg/g de raices secas. Como se observa, este valor es inferior al obtenido en este trabajo empleando raices no transformadas, lo que permite evidenciar que la produccion del metabolito de interes en biorreactor puede haberse visto afectada, entre otros factores, por el proceso de transformacion de las raices (Bonhomme, et al., 2000; Bulgakov, V. P, et al., 2002; Bulgakov, V. P, et al., 2004; Bulgakov, V. P., 2008).

Por otra parte, en el trabajo desarrollado por Otalvaro, 2009, con raices transformadas de B. candida clon Arg3 (descrito en Cardillo, et al., 2010) y en el mismo sistema de biorreacion de dos unidades empleado en este trabajo, se encontro un indice de crecimiento de 1 y una produccion de escopolamina de 0,07 mg/g de raices frescas. Se observa de nuevo aqui una baja produccion del alcaloide utilizando el clon transformado (Ramirez & Suarez, 1993; Cardillo, et al., 2010).

Conclusiones

Es posible producir escopolamina en biorreactor a partir de cultivos de raices no transformadas de B. candida con rendimientos en cuanto a indice de crecimiento y concentracion de alcaloide similares a los obtenidos en cultivos desarrollados en matraces de Erlenemeyer, lo que evidencia la capacidad de escalar la produccion.

Ademas, al comparar los resultados obtenidos con otros reportados para cultivos de raices transformadas de la misma especie, se observo que, aunque el proceso de transformacion de dichas raices promueve la generacion de biomasa, puede estar afectando de manera negativa la sintesis de escopolamina en las raices.

Se evidencio, asimismo, que en biorreactor y bajo las condiciones evaluadas en este trabajo, la elicitacion con sulfato de cobre no producia el efecto esperado en cuanto a la liberacion de escopolamina al medio de cultivo. Para futuros estudios se recomienda probar otros elicitores, como la L-arginina, que han demostrado tener un efecto positivo como precursores de la escopolamina en cultivos de raices no transformadas.

Conflicto de interes

Los autores declaran que no tienen ningun conflicto de interes.

Bibliografia

Bulgakov, V. P. 2008. Functions of rol genes in plant secondary metabolism. Biotechnology Advances 26: 318-324.

Bulgakov, V. P., Tchernoded, G. K., Mischenko, N. P., Khodakovskaya, M. V., Glazunov, V. P., Radchenko, S. V., Zvereva, E. V., Fedoreyev, S. A., Zhuravlev, Y. N. 2002. Effect of salicylic acid, methyl jasmonate, ethephon and cantharidin on anthraquinone production by Rubiacordifolia callus cultures transformed with the rolB and rolC genes. Journal of Biotechnology 97: 213-221.

Bulgakov, V. P., Tchernoded, G. K., Mischenko, N. P., Shkryl, Y. N., Fedoreyev, S. A., Zhuravlev, Y. N. 2004. The rolB and rolC genes activate synthesis of anthraquinones in Rubiacordifolia cells by mechanism independent ofoctadecanoid signaling pathway. Plant Science 166: 1069-1075.

Bonhomme, V., Laurain-Mattar, D., Lacoux, J., Fliniaux, M. A., Jacquin-Dubreuil, A. 2000. Tropane alkaloid production by hairy roots of Atropa belladonna obtained after transformation with Agrobacterium rhizogenes 15834 and Agrobacterium tumefaciens containing rolA, B, C genes only. Journal of Biotechnology 81: 151-158.

Cardillo, A.B.; Otalvaro, A.M.; Busto, V.D.; Talou, J.R.; Velasquez, L.M.E.; Giulietti, A.M. 2010. Brugmansia candida hairy root cultures in bioreactors as an anisodamine production system. Process Biochemistry 45 (9): 1577-1581.

Chatterjee, C., Correll, M. J., Weathers, P. J., Wyslouzil, B. E., Walcerz, D. B. 1997. Simplified acoustic window mist bioreactor. Biotechnology Techniques 11: 155-158.

Doran, P. M. 1997. Hairy roots: Culture and applications, CRC Press. Amsterdam

Dornenburg, H., Knorr, D. 1995. Strategies for the improvement of secondary metabolite production in plant cell cultures. Enzyme and Microbiology Technology 17(8):674-684.

Flores, H. E., Filner, P. 1985. Metabolic relationships of putrescine, GABA and alkaloids in cell and root cultures of Solanaceae. En: Newman, K. H., Barz, W.,Reinhard, E. eds, Primary and secondary metabolism of plant cell cultures. Springer-Verlag, New York, p. 174-185.

Garcia, L. A., Perea., M., Reguero, M. T. 1993. Brugmansia: una especie promisoriapara la produccion de alcaloides del tropano. Revista Colombiana de Ciencias Quimico-Farmaceuticas 21:5.

Gontier, E., Clement, A., Tran, T. L. M., Gravot, A., Lievre, K., Guckert, A., Bourgaud, F. 2002. Hydroponic combined with natural or forced root permeabilization: A promising technique for plant secondary metabolite production. Plant Science (Limerick), 163: 723-732.

Grajales, E. 2008. Elicitacion de raices normales cultivadas in vitro de Brugmansia Candida (Solanaceae) con precursores de alcaloides del tropano. Tesis. Facultad de Tecnologias, Universidad Tecnologica de Pereira, Pereira.

Green, K. D., Thomas, N. H. 1996. An integrated "Root tube" bioreactor/separator for transformed root cultures. Journal of Fermentation and Bioengineering 81: 453-457.

Griffin, W. J., Lin, G. D. 2000. Chemotaxonomy and geographical distribution of tropane alkaloids.Phytochemistry 53: 623-637.

Guillon, S., Tremouillaux-Guiller, J., Pati, P. K., Rideau, M., Gantet, P. 2006. Hairy root research: Recent scenario and exciting prospects.Current Opinion in Plant Biology 9: 341-346.

Hamill, J. D., Parr, A. J., Robins, R. J., Rhodes, M. J. C. 1986. Secondary product formation by cultures of Beta vulgaris and Nicotianarustica transformed with Agrobacterium rhizogenes. Plant Cell Reports 5: 111-114.

Hitaka, Y., Takahashi, Y., Kino-oka, M., Taya, M., Tone, S. 2000. Culture of red beet hairy roots by considering variation in sensitivity of tip meristems to hydraulic stress. Biochemical Engineering Journal 6: 1-6.

Huang, S. Y., Hung, C. H., Chou, S. N. 2004. Innovative strategies for operation of mist trickling reactors for enhanced hairy root proliferation and secondary metabolite productivity. Enzyme and Microbial Technology 35: 22-32.

Jung, K. H., Kwak, S. S., Liu, J. R. 1998. Procedure for biomass estimation considering the change in biomass volume during high-density culture of hairy roots. Journal of Fermentation and Bioengineering 85: 454-457.

Kamada, H., Okamura, N., Satake, M., Harada, H., Shimomura, K. 1986. Alkaloid production by hairy root cultures in Atropa belladonna. Plant Cell Reports 5: 239-242.

Kino-Oka, M., Hitaka, Y., Taya, M., Tone, S. 1999. High-density culture of red beet hairy roots by considering medium flow condition in a bioreactor. Chemical Engineering Science 54, 3179-3186.

Liu, C. Z., Guo, C., Wang, Y. C., Ouyang, E 2003. Comparison of various bioreactors on growth and artemisinin biosynthesis of Artemisia annua L. shoot cultures. Process Biochemistry 39: 45-49.

Luczkiewicz, M., Kokotkiewicz, A. 2005. Co-cultures of shoots and hairy roots of Genistatinctoria L. for synthesis and biotransformation of large amounts of phytoestrogens. Plant Science 169: 862-871.

Mahagamasekera, M. G. P., Doran, P. M. 1998. Intergeneric coculture of genetically transformed organs for the production of scopolamine. Phytochemistry 47: 17-25.

Martin, Y., Vermette, P. 2005. Bioreactors for tissue mass culture: Design, characterization, and recent advances. Biomaterials 26: 7481-7503.

Nino, J., Gallego, C. M., Correa, Y. M., Mosquera, O. M. 2003. Production of scopolamine by normal root cultures of Brugmansia candida. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 74:289-291.

Otalvaro A. 2009. Evaluacion de un sistema de biorreaccion para la produccion de escopolamina por cultivo de raices de Brugmansia candida. Tesis de Doctorado. Departamento de Ingenieria Quimica y Ambiental, Universidad Nacional de Colombia, Bogota.

Perry, D. A. 1981. Handbook of vigour test methods. International Seed Testing Association. Zurich, Switzerland, p. 72

Pineros, Y. 2005. Produccion de escopolamina e hiosciamina mediante cultivo in vitro de raices de Brugmansia candida. Tesis de Maestria. Departamento de Ingenieria Quimica y Ambiental, Universidad Nacional de Colombia, Bogota.

Pitta-Alvarez, S.I. 1998. Produccion in vitro de alcaloides del tropano empleando raices transformadas de Brugmansia candida. Tesis. Departamento de Microbiologia, Inmunologia y Biotecnologia, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, p. 214.

Pitta-Alvarez, S. I., Giulietti, A. M. 2001. Hairy roots of Brugmansia candida that grow without agitation: Biotechnological implications, Biotechnology progress 17(4): 661-664.

Ramirez, Y., Suarez, W. 1993. Contribucion al estudio del genero Brugmansia mediante el cultivo de tejidos vegetales in vitro II. Tesis. Facultad de Ciencias, Departamento de Farmacia, Universidad Nacional de Colombia, Bogota.

Savitha, B. C., Thimmaraju, R., Bhagyalakshmi, N., Ravishankar, G. A. 2006. Different biotic and abiotic elicitors influence betalain production in hairy root cultures of Beta vidgaris in shake-flask and bioreactor. Process Biochemistry 41: 50-60.

Suresh, B., Thimmaraju, R., Bhagyalakshmi, N., Ravishankar, G. A. 2004. Polyamine and methyl jasmonate-influenced enhancement of betalain production in hairy root cultures of Beta vulgaris grown in a bubble column reactor and studies on efflux of pigments. Process Biochemistry 39: 2091-2096.

Suresh, B., Bais, H. P., Raghavarao, K., Ravishankar, G. A., Ghildyal, N. P. 2005 Comparative evaluation of bioreactor design using Tagetespatula L. hairy roots as a model system. Process Biochemistry 40: 1509-1515.

Takahashi, Y., Hitaka, Y., Kino-oka, M., Taya, M., Tone, S. 2001 Evaluation of growth property of red beet hairy roots depending on condition of inocula and its application to culture control with fuzzy logic theory. Biochemical Engineering Journal 8: 121-127.

Veena, V., Taylor, C. G. 2007.Agrobacterium rhizogenes: Recent develoments and promising applications.In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant 43: 383-403.

Weathers, P. J., Kim, Y. J. 2001. Transformed roots of Artemisia annua exhibit an unusual pattern of border cell release. In Vitro Cellular & Develo[micron]mental Biology-Plant 37: 440-445.

Wink, M. 1987. Physiology of the accumulation of secondary metabolites with special reference to alkaloids. En: Constabel, F., Vasil, I. eds. Cell culture and somatic cell genetics of plants. Vol 4: Cell culture in Phytochemistry, Academic press, p. 17-41.

Wyslouzil, B. E., Whipple, M., Chatterjee, C., Walcerz, D. B., Weathers, P. J., Hart, D. P. 1997. Mist deposition onto hairy root cultures: Aerosol modeling and experiments. Biotechnology Progress 13: 185-194.

Zobayed, S. M. A., Saxena, P. K. 2003. In vitro-grown roots: A superior explant for prolific shoot regeneration of St. John's wort (Hypericumperforatum L. cv 'New Stem') in a temporary immersion bioreactor, Plant Science 165: 463-470.

Zobayed, S., Saxena, P. K. 2004. Production of St. John's wort plants under controlled environment for maximizing biomass and secondary metabolites. In Vitro Cellular & Develo[micron]mental Biology-Plant 40: 108-114.

Angela Maria Otalvaro-Alvarez (1) *, Mario Enrique Velasquez-Lozano (2)

(1) Facultad de Ingenieria, Universidad de La Salle, Bogota, Colombia

(2) Facultad de Ingenieria, Universidad Nacional de Colombia, Bogota, Colombia

* Correspondencia: Angela Maria Otalvaro-Alvarez, amotalvaro@unisalle.edu.co

Recibido: 23 de julio de 2013

Aceptado: 27 de abril de 2014

Leyenda: Figura 1. Raices adventicias cultivadas en el biorreactor luego de 21 dias de crecimiento
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Title Annotation:ciencias naturales
Author:Otalvaro-Alvarez, Angela Maria; Enrique Velasquez-Lozano, Mario
Publication:Revista de la Academia Colombiana de Ciencias Exactas, Fisicas y Naturales
Date:Jan 1, 2014
Words:6443
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